Penelitian ini dilakukan pada bulan Oktober 2011 sampai dengan Juni 2012. Penelitian bertempat di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Terpadu Departemen Biologi, FMIPA IPB.
Bahan dan Alat Penelitian
Bahan yang digunakan ialah bakteri S.costaricanus45I-3 yang berasal dari Kalimantan (koleksi Dr. Ir. Yulin Lestari, Bagian Mikrobiologi Departemen Biologi, FMIPA IPB) digunakan sebagai sumber gen endoxilanase.
Bahan dan alat untuk ekstraksi DNA terdiri atas STE (0.3 M sukrosa; 25 mM Tris-HCL; 25 mM EDTA.2Na pH 8), proteinase K (5 mg/ml), enzim lisozim (20 mg/ml), PCI(Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol = 25 : 24 : 1), CIAA (Chloroform : Isoamyl alcohol = 24 : 1), fenol, isopropanol, etanol 70% (v/v), Tris-HCl EDTA ((TE) (10 mM Tris-HCl-EDTA pH 8; 1 mM EDTA)), dan tabung mikro1.5 ml. Bahan untuk campuran PCR yaitu akuades steril, primer I, primer II, dan TAKARATaq DNA Polymerase (bufer dengan 1.5 mM Mg2+, dNTP 0.4 mM, 0.5 U/µl TAKARATaq DNA polymerase). Bahan yang digunakan untuk elektroforesis adalah medium agarosa 1%, bufer 1xTAE (Tris 0.5 M, asam asetat 0.65 M, EDTA 0.02M), penanda 1kb DNA ladder (Fermentas), dan 6x loading dye (Promega). Visualisasi DNA menggunakan UV Transluminator.
Peremajaan Isolat S. costaricanus45I-3
Media yang digunakan untuk meremajakan isolat S. costaricanus 45I-3 adalah media agar-agar xilan (0.5% ekstrak khamir; 10.3% sukrosa; 0.5% NaCl; 0.5% xilan Birchwood; 2% agar) dan media Yeast Malt Agar (YMA). Biakan diinkubasi pada suhu ruangan selama 4 hari.
Isolasi DNA Genom S. costaricanus 45I-3
Sebanyak 1.5 ml biakan bakteri dimasukkan ke tabung mikro mikro1.5 ml lalu disentrifugasi pada kecepatan 800 rpm selama 10 menit, supernatan dibuang dan pelet yang terbentuk dicuci dengan bufer STE (komposisi: 0.3 M sukrosa; 25
12
mM Tris-HCL; 25 mM EDTA·2Na pH 8), kemudian disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 10 menit. Pelet dicuci sebanyak 3 kali secara berulang. Selanjutnya supernatan dibuang dan pada pelet yang didapat ditambahkan 200 µl bufer STE dan 45 µl lisozim (20 mg/ml), tabung dibolak-balik secara pelan lalu diinkubasi pada suhu 55ºC selama 1 jam sehingga terbentuk protoplas. Sebanyak 20 µl proteinase-K (20 mg/ml) ditambahkan pada campuran tersebut dan diinkubasi pada suhu 55ºC selama 60 menit lalu ditambahkan 400µl 10% CTAB dalam larutan 0.7 M NaCl, dan diinkubasi pada suhu 65ºC selama 30 menit. Ke dalam larutan ditambahkan 1 kali volume fenol:kloroform (25:24) dan disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Fase bening dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan 0.6 kali volume isopropanol dan 20 µl natrium asetat, dinkubasi pada suhu -20ºC selama semalam. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit, bagian sepernatan dibuang sedangkan pada pelet dicuci menggunakan alkohol 70% sebanyak 1 ml. DNA dikeringanginkan selama 1 jam untuk membuang alkohol lalu dilarutkan ke dalam 50 µl ddH2O steril selanjutnya disimpan pada 4 ºC atau -20ºC.
Amplifikasi Gen Endoxilanase dengan Metode Inverse PCR
Pemotongan DNA Genom. Untuk mengamplifikasi DNA yang mengapit fragmen bagian hulu dan hilir sekaligus, DNA genom dipotong dengan menggunakan enzim restriksi yang tidak memotong fragmen tersebut, yaitu HinfI, HindIII, EcoR1, EcoRV, BamHI, dan NdeI. Sebanyak 10 µl DNA genom ditambahkan dengan 2 µl 10x buffer RE, 1 µl enzim restriksi dan 6 µl akuades steril lalu diresuspensi dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama semalam. Selanjutnya DNA diekstrak dengan fenol-kloroform kemudian diendapkan dengan etanol 100% dan dicuci dengan etanol 70%. Selanjutnya pelet dikering anginkan pada suhu ruang selanjutnya disuspensikan ke dalam 5 µl akuades steril.
Sirkularisasi DNA Hasil Pemotongan. Potongan genom hasil restriksi disirkularisasi atau diligasikan dengan menggunakan enzim ligase (DNA ligase T4, ligation kit ver.2 solution I). Ligasi dilakukan semalaman pada suhu 15ºC. Sampel DNA yang telah disirkularisasi kemudian diendapkan menggunakan
13 etanol 100%. Pelet DNA dikering anginkan selanjutnya diresuspensikan ke dalam 5 µl akuades steril.
Amplifikasi Gen Penyandi Xilanase Ekstraselular. Amplifikasi fragmen gen penyandi enzim xilanase ekstraselular dengan inverse-PCR dilakukan menurut Wahyudi et al. (2001). Primer didesain berdasarkan pada sekuen parsial gen endoxilanase yang dilaporkan Aziz (2010). Primer yang digunakan yaitu primer I (Sc-F1-3’ATCAC CACCGGCAACCACTTCG-5’): dan primer II (Sc-R1 3’-TGCCCCAGTTGTCGACGATGTAG-5’), i-S1-i-S2, dan Sc-F1-Sc-R1 (Lam-piran 1). DNA diamplifikasi dengan menggunakan Gene Amp System 2400, thermocycler (Perkin Elmer). Reaksi inverse-PCR meliputi : 25 µl 2x Buffer (Reaction With GC), primer masing-masing 1 µl (10 µM), 1 µl LA Taq polymerase, 3 µl sampel DNA, dan akuades steril hingga volume 50 µl. Program i-PCR sebagai berikut; denaturasi awal (94°C, 5 menit), diikuti denaturasi (94°C, 2 menit). Penempelan primer (61°C, 1 menit), pemanjangan (72°C, 1 menit) dan pemanjangan akhir (72°C, 7 menit). Amplifikasi dilakukan sebanyak 30 sikIus. Elektroforesis pada Gel Agarosa 1%
DNA hasil PCR divisualisasi dengan teknik elektroforesis menggunakan Agarose biologi meolekuler (Biorad) 1%. 1 gram agarosa dilarutkan ke dalam 100 ml bufer TAE 1x kemudian dididihkan. Selanjutnya dicetak dan dibiarkan sampai membeku dan dimasukkan ke bak elektroforesis (Biored) yang telah diisi larutan bufer TAE 1x. DNA produk PCR sebanyak 5 µl dicampur dengan 2 µl loading dye, kemudian dimasukkan ke dalam sumur pada agarosa. Kondisi elektroforesis diatur pada tegangan 75 volt selama 45 menit. Selanjutnya agarosa diwarnai dalam larutan ethidium bromida (0.5 µl/ml) selama 15 menit, diamati pada UV transluminator (UV luminescence).
14 1500 1000 750 500 250
Gambar 1 Strategi yang digunakan untuk mengamplifikasi gen endoxilanase pada S. costaricanus 45I-3. Mula-mula genom dipotong secara acak menggunakan enzim restriksi yang tidak memotong sekuens 408 pb yang dilaporkan aziz, salah satunya Hinf1. Selanjutnya dilakukan sirkularisasi dan amplifikasi menggunakan primer yang arah pemanjangannya keluar. Poduk inverse-PCR selanjutnya disekuensing dan disejajarkan pada parsial gen yang dilaporkan Aziz (2010), sehingga akan didapat total amplikon yang dapat dianalsis lebih lanjut.
15 Analisis Nukleotida, Asam Amino, ORF, RBS, Situs Aktif, dan Struktur 3 Dimensi
Proses sekuensing DNA menggunakan jasa sekuensing PT. Genetika Science Indonesia. Sekuen produk inverse-PCR diedit menggunakan program Genetyx Win versi 4.0, kemudian dilakukan alignment menggunakan ClustalX, Mega 4.0 (Tamura et al. 2007) dan Mega 5.0. Analisis deduksi asam amino dilakukan dengan menggunakan program BLASTX. Analisis open reading frame (ORF) menggunakan program ORF Finder di situs National Center for Biotechnology Information (NCBI), sedangkan analisis promoter dan ribosome binding site (RBS) menggunakan piranti lunak dari softberry (www. softberry.com). Analisis Domain dan situs aktif enzim dilakukan dengan menggunakan program conserved domain database (CDD) site yang tersedia di NCBI (http://prosite. expasy.org/) (Falquet et al. 2002). Visualisasi struktur 3 dimensi menggunakan program Cn3D. Penentuan berat molekul (BM) dan titik isoelektrik (pI) menggunakan program yang tersedia pada situs (http://web.expasy .org/ compute_pi/).
17