Pada penelitian ini isolat S. costaricanus 45I-3 diremajakan pada media agar-agar xilan dan YMA. Hasil yang didapat menunjukkan bahwa pertumbuhan diawali dengan perkecambahan spora menjadi hifa substrat berwarna putih pada media agar-agar xilan. Hifa substrat dan hifa aerial berwarna abu-abu pada media YMA (Gambar 2).
Gambar 2 Morfologi isolat S. costaricanus 45I-3 yang ditumbuhkan pada media agar-agar xilan (a) tampak depan, (b) tampak belakang, dan (c) pada media YMA. Pada (b) terlihat media xilan berubah warna menjadi kuning tua.
Isolasi Genom S. costaricanus 45I-3
Kuantitas DNA hasil isolasi genom menggunakan spektrofotometer disajikan pada Tabel 2.
(a) (b)
18
Tabel 2 Kuantitas genom hasil isolasi
No OD (Optical Density) Kemurnian Konsentrasi DNA
λ 230 nm λ 260 nm λ 280 nm λ260/ λ280) μg/ml μg/μl 1 0.188 0.076 0.039 1.94 760 0.76 2 0.216 0.624 0.314 1.99 1090 1.92 3 0.009 0.025 0.014 1.79 438 0.44 4 0.204 0.398 0.199 2.00 696 0.697 5 0.219 0.197 0.099 1.99 344 0.345 6 0.215 0.438 0.223 1.96 766 0.767 7 0.183 0.460 0.233 1.97 805 0.805 8 0.199 0.540 0.271 1.99 9450 9.45 9 0.294 0.839 0.435 1.93 146 0.46
Kuantitas DNA (konsentrasi) hasil pengukuran dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm ialah terendah pada sampel nomor 3 yaitu 438 µg/ml sedangkan yang tertinggi pada sampel nomor 8 yaitu 9450 µg/ml (Tabel 2). Kemurnian DNA yang didapat berdasarkan nilai rasio OD260/OD280 rata-rata adalah 1.9 yang artinya DNA yang diperoleh mempunyai kemurnian yang sangat tinggi dan tidak terkontaminasi oleh protein.
Analisis Gen Penyandi Enzim Xilanase S. costaricanus 45I-3
Amplifikasi menggunakan metode inverse-PCR menghasilkan fragmen DNA yang berukuran sekitar 1500 pb (Gambar 4).
Gambar 3 Amplifikasi i-PCR terhadap gen endoxilanase famili 11 dengan primer I (F-Sc1) dan primer II (R-ScI) yang arah perpanjangannya ke luar. M = marker 1 Kb ; 1 dan 2 = produk i-PCR setelah dipotong dengan enzim restriksi HinfI.
1.500 pb 1500 750 500 250 M 1 2 1000
19 Produk inverse-PCR selanjutnya di sekuen dan disejajarkan untuk menentukan panjang amplikon yang dihasilkan. Data hasil sekuensing disajikan pada Lampiran 2 dan 3. Hasil pensejajaran sekuen menunjukkan bahwa enzim restriksi HinfI memotong pada nukleotida ke 694 ke arah downstream dan nukleotida ke 564 pada arah upstream. Hal ini tergambar dengan adanya daerah tumpang tindih (overlaping) pada urutan nuleotida tersebut. Dari hasil ini didapat panjang amplikon yang teramplifikasi secara keseluruhan yaitu sebesar 1664 pb. Analisis Asam Amino Menggunakan BLASTX
Total amplikon sebesar 1664 pb selanjutnya dilakukan BLASTX dengan tujuan untuk menentukan homologi antara sekuen asam amino hasil penelitian dengan sekuen asam amino GenBank yang ada di situs NCBI. Hasil perbandingan sekuen asam amino menggunakan program BLASTX dapat dilihat pada Tabel 3 dan Lampiran 4 dan 5.
Tabel 3 Analisis homologi menggunakan BLASTX
No. Akses Discription Max
Score Score Total Q.C (%) value E. Ident Max (%) AFH35005.1 Xylanase [bacterium
enrich-ment culture clone Xyl8B8]
509 509 61 4e-175 95 ZP06710529.1 Endo-1,4-beta-xylanase B
[Streptomyces sp. e14] 433 433 54 2e-145 81 CCK28706.1 Endo-1,4-beta-xylanase B [Streptomyces davawensis JCM 4913] 423 423 54 2e-141 77 EHN73405.1 Endo-1,4-beta-xylanase [Streptomyces coelicoflavus ZG0656] 409 409 54 4e-136 77 ZP06710529.1 Endo-1,4-beta-xylanase [Streptomyces sp. SirexAA-E] 423 423 54 2e-141 77
Keterangan : No. Akses = nomor akses;max score = nilai maksimal; Total Score = keseluruhan skor yang dibandingkan; Q.C = Quary Coverage; E. value = nilai kepercayaan; dan iden = identitas/ kesamaan;
20
Deduksi asam amino penyandi gen xylanase galur S. costaricanus 45I-3 dengan gen xilanase keluarga 11 lainnya ditunjukkan pada Gambar 4. Daerah yang ditandai dengan latar berwarna hitam menunjukkan kesamaan dari lima asam amino yang dibandingkan, daerah dengan latar abu-abu menunjukkan minimal ada 3 sekuen asam amino yang sama sedangkan huruf yang tidak memiliki latar menunjukkan sekuen asam amino yang berbeda sama sekali dengan sekuen asam amino lainnya. Sekuen asam amino yang digaris bawah menunjukkan tingkat kesamaan tinggi.
S._c MKI--- --GPLTSLFR GVCAVVLLAV GALTLPGAGI AGADTVITSN QTGTDNGYYY 60 xyl_c MKIRSRRERR PRGPLTSLFR GVCAVVLLAV GALTLPGAGI AGADTVITSN QTGTDNGYYY 60 xyl_B --- --- ---MLAL AVLAMPG--A ASADTVITSN QTGTNNGYYY 34 Xyl_Sd AHADTVVTTN QTGTNNGYYY 20 Xyl_Sc ARADTVVTTN QEGTNNGYYY 20
S._c SFWTDGGGTV SMNLGSAGNY STNWSNTGNF VAGKGWSNGG RRSVTYSGTF NPPGNAYLSL 120 xyl_c SFWTDGGGTV SMNLGSAGNY STNWSNAGNF VAGKGWSNGG RRSVTYSGTF NPPGNAYLSL 120 xyl_B SFWTDGGGST SMNLGSGGNY STSWTNSGNF VAGKGWSTGG RKAVTYSGSF NPSGNAYLAL 94 Xyl_Sd SFWTDSQGTV SMNLASGGSY STQWSNTGNF VAGKGWANGA RRTVTYSGTF NPSGNAYLAL 80 Xyl_Sc SFWTDSQGTV SMNMGSGGQY STSWRNTGNF VAGKGWANGG RRTVQYSGTF NPSGNAYLTL 80
S._c YGWTSNPLVE YYIVDNWGSY RPTGTFKGTV TSDGGTYDIY ETTRTNAPSV EGTKTFNQYW 180 xyl_c YGWTSNPLVE YYIVDNWGSY RPTGTFKGTV TSDGGTYDIY ETTRTNAPSV EGTKTFNQYW 180 xyl_B YGWTTNPLVE YYVVDNWGTY RPTGTYKGTV TSDGGTYDIY ETTRVNAPSV EGTRTFNQYW 154 Xyl_Sd YGWTANPLVE YYIVDNWGTY RPTGTFKGTV TTDGGTYDIY KTTRYNAPSV EGNKTFDQYW 140 Xyl_Sc YGWTANPLVE YYIVDNWGTY RPTGEYKGTV TSDGGTYDIY KTTRVNKPSV EGTRTFDQYW 140
S._c SVRQFKRTGG TITTGNHFDA WAGHGMNLGS FNYYMILATE SYQSSGSSNI TVGSSGSGGG 240 xyl_c SVRQSKRTGG TITTGNHFDA WAGHGMNLGS FNYYMIMATE GYQSSGSSNI TVGSSGSGGG 240 xyl_B SVRQSKRTGG TITTGNHFDA WASHGMNLGA FNYYMILATE GYQSSGNSNI TVSDGGSGGG 200 Xyl_Sd SVRQSKRTGG TITTGNHFDA WARAGMPLGS FNYYMIMATE GYQSSGSSNI TVGGTSGGGG 214 Xyl_Sc SVRQSKRTGG TITTGNHFDA WARAGMPLGS FNYYMIMATE GYQSSGSSNI NVGGTGGGGD 200
S._c --GGGTGGGG TGGGGTGGCT ATVTAGQSWD DRYNLNVSVS GANNWTVTAN VPAPEKVLST 300 xyl_c --GGGTGGG- TGGGGTGGCT ATVTAGQSWD DRYNLNVSVS GANNWTVTAN VPAPEKVLST 300 xyl_B TGGGGTGGG- GGGTGTGGCT ATLSAGQQWG DRYNLNVSVS GSSNWTVTMN VPSPEKVLAT 274 Xyl_Sd GGGGGTGCSA TGGGGTGGCT ATLSAGQQWS DRYNLNVSVT GSSNWTVTMN VPSPAKVLST 260 Xyl_Sc --DGGGDNG- GGGGGTGGCT ATLSAGQKWG DRYNLNVSVS GSDNWTVTMN VPSPAKVMST 260
S._c WNVAASYPSA QVLTAKSNGS GNNWGLTVQK NGSTTWPTFS CTAN 342 xyl_c WNVAASYPSA QVLTAKSNGS GNNWGLTVQK NGSTTWPTFS CTAN 342 xyl_B WNVSASYPSA QVLSAKPNGS GNNWGVTIQT NGTWTWPTVT CTAN 318 Xyl_Sd WNVSASYPSS QVLTAKPNGS GNNWGVTIQH NGNYTWPTVS CTA 320
Xyl_Sc WNINASYPSA QTLTARSNGS GNNWGATIQA NGNWTWPSVS CTA 320
Gambar 4 Deduksi asam amino antara S.costaricanus 45I-3 terhadap sekuen asam amino pengkode xilanase pada 3 spesies lainnya. S._c = endoxilanase S. costaricanus 45I-3 (studi ini), xyl_c = Xylanase bacterium enrichment culture clone Xyl8B8 xyl_B = Endo-1,4-beta-xylanase B Streptomyces sp. e14, Xyl_Sd = Endo-1,4-beta-xylanase Streptomyces davawensis JCM 4913, dan Xyl_Sd = Endo Streptomyces coelicoflavus.
21
Gambar 5 Filogenetik berdasarkan sekuen asam amino yang dibandingkan dengan beberapa galur Streptomyces penghasil endoxilanase famili
11 dengan metode NJ dan Bootstrap 1000x. Xilanase isolat S. costaricanus 45I-3 ditunjukkan dengan tanda panah.
Analisis Struktur Gen
Hasil analisis Basic Local Alignment Tools X (BLASTX) memberikan informasi bahwa fragmen gen sekitar 1664 pb yang diperoleh dari hasil penggabungan sekuen yang ditemukan dari penelitian ini dan sekuen 408 pb, mengekspresikan protein Glyco_hydro dan dan Glyoxalase. Untuk mengetahui lebih lanjut tentang kedua gen ini, maka dilakukan analisis ORF Finder. Hasil analisis ORF akan memberikan informasi ada tidaknya kodon awal (ATG) dan kodon akhir (TAA/TAG/TGA). Hasil analisis ORF menunjukkan ada 2 ORF yaitu Glyco_hydro_11 Superfamily dari nukleotida urutan 316 sampai dengan 1344 (Gambar 6). ORF ini telah lengkap karena memiliki start kodon dan stop kodon. ORF lainnya ditemukan pada nukleotida ke 1355 sampai dengan 1663 (Gambar 7), kodon ini hanya memiliki stop kodon namun belum ada start kodon.
Streptomyces costaricanus 45I-3
xylanase bacterium enrichment culture clone Xyl8B8 endo-14-beta-xylanase B Streptomyces sp. e14
endo-14-beta-xylanase Streptomyces sp. SirexAA-E endo-14-beta-xylanase B Streptomyces griseoaurantiacus M045
xylanase II Streptomyces thermoviolaceus
xylanase B precursor Streptomyces thermocyaneoviolaceus endo-14-beta-D-xylanase precursor Streptomyces sp. THW31
4-xylanase Streptomyces coelicoflavus ZG0656 endo-beta-14-xylanase Streptomyces sp. SWU10
Endo-14-beta-xylanase
endo-14-beta-xylanase B Streptomyces coelicolor A3(2) endo-14-beta-xylanase B Streptomyces lividans TK24 100 100 80 49 33 100 65 85 59 100 0.02
22
Gambar 6 Hasil analisis open reading frame (ORF) untuk glyco_hydro_11 Superfamily.
Gambar 7 Hasil analisis open reading frame (ORF) untuk Glyo_EDI_BRP_Like Superfamily
Berdasarkan hasil analisis ORF Finder diketahui bahwa protein Glyco_Hidro 11 dan Gly_BRP tidak pada operon yang sama, ditandai dengan adanya kodon akhir dengan posisi yang berlawanan. Karena ada dua ORF dengan operon yang berbeda, perlu diketahui RBS atau Shine Delgarno, dan promoter untuk masing-masing operon. Hasil analisis promoter menunjukkan bahwa arah transkripsi ke dua gen ini berlawanan (Gambar 8).
23
agtcaccatgagggtgactgtagcggcgagggtctgacaatggctccccatgggctccgaaac tttcgaaagggccccaccccctctggatcttgctctctccgccgcctcgaataagtctgtgac gttcgcacaagatggcgtctcaccagcatgcaaatcccttgagtgcatgggactttgatgacc atttcgaaataactaccgaaactattgactgcctttgtgtacatcgcctcaacactgatgcac
-35 promoter -10
cccgcgcagcgcgtcgctccaccctcatccggctccatcgatccatgaggaggaagcacgtcc
Kodon awal RBS ATGAAGATCCGCAGCCGAAGAGAACGCCGCCCCCGGGGACCTCTCACCTCGCTCTTCCGAGGTGTC 381 1 M K I R S R R E R R P R G P L T S L F R G V 22 TGTGCCGTTGTTCTGCTCGCCGTCGGGGCGCTGACCCTGCCCGGCGCCGGGATCGCCGGCGCCGAC 447 C A V V L L A V G A L T L P G A G I A G A D 44 ACGGTCATCACCTCGAACCAGACCGGTACCGACAACGGGTACTACTACTCGTTCTGGACCGACGGC 513 T T V I T S N Q T G T D N G Y Y Y S F W T D G GGTGGCACCGTCTCCATGAACCTGGGGTCCGCAGGCAACTACAGCACCAACTGGAGCAACGCCGGC 579 G G T V S M N L G S A G N Y S T N W S N A G 88 AACTTCGTGGCCGGCAAGGGCTGGAGCAACGGCGGGCGCCGCAGCGTGACCTACTCCGGCACTTTC 645 N F V A G K G W S N G G R R S V T Y S G T F 110 AACCCGCCCGGCAACGCGTATCTGTCGCTGTACGGCTGGACCTCGAACCCGCTGGTCGAGTACTAC 711 N P P G N A Y L S L Y G W T S N P L V E Y Y 132 ATCGTCGACAACTGGGGCAGCTACCGGCCCACCGGCACCTTCAAGGGCACGGTCACCAGTGACGGC 777 I V D N W G S Y R P T G T F K G T V T S D G 154 GGGACGTACGACATCTACGAGACGACCCGGACCAACGCCCCGTCGGTGGAGGGCACCAAGACCTTC 843 G T Y D I Y E T T R T N A P S V E G T K T F 176 AACCAGTACTGGAGCGTGCGGCAGTTCAAGCGGACCGGCGGCACCATCACCACCGGCAACCACTTC 909 N Q Y W S V R Q F K R T G G T I T T G N H F 198 GACGCCTGGGCCGGCCACGGGATGAACCTGGGCAGCTTCAACTACTACATGATCATGGCGACCGAG 975 D A W A G H G M N L G S F N Y Y M I M A T E 220 AGCTACCAGAGCAGCGGCAGCTCCAACATCACCGTGGGCAGCTCCGGTTCGGGCGGCGGTGGTGGC 1041 S Y Q S S G S S N I T V G S S G S G G G G G 242 GGCACGGGTGGCGGCGGAACCGGCGGCGGTGGCACCGGCGGCTGCACGGCGACCGTGACCGCGGGC 1107 G T G G G G T G G G G T G G C T A T V T A G 264 CAGTCCTGGGACGACCGGTACAACCTGAACGTCTCGGTCAGCGGGGCGAACAACTGGACGGTGACC 1173 Q S W D D R Y N L N V S V S G A N N W T V T 286 GCGAACGTCCCGGCCCCGGAGAAGGTCCTGTCGACCTGGAACGTGGCCGCGAGCTATCCCAGTGCC 1239 A N V P A P E K V L S T W N V A A S Y P S A 308 CAGGTGCTGACCGCCAAGTCCAACGGCAGCGGCAACAACTGGGGTCTGACCGTGCAGAAGAACGGC 1305 Q V L T A K S N G S G N N W G L T V Q K N G 330
Kodon Akhir Kodon Akhir
TCCACCACCTGGCCGACGTTCAGCTGCACGGCCAACTGAggccgaagcCTAGGCCCTGACGACG 1370
S T T W P T F S C T A N * * A L T T 342/5 ATCTGCTTCCCGCACGGAGCCCCGGACCTCCTCGTGAGGTGGCGCAAGGAGGGCCCGCAGTTCGAG 1436 I C F P H G A P DL L V R W R K E G P Q F E 27 CCGAAGACCGCCGGCCTGGGACTCCTCCGGCGGGAGGCCGCCGACCTGGACGACGTGGGCCTGGAG 1502 P K T A G L G L L R R E A A D L D D V G L E 49 ATCCATGCCCAGAAGGGCCAGGCCCCCGACCCGTGGACCCCCCCGCGCTACGACGCCGTCCGGACC 1568 I H A Q K G Q A P D P W T P P R Y D A V R T 71 TTCGGCCTCGGCCCCACCGGCGAGACCGGCCTCCTGGTCTTCGACGACACCGCCTTCCTCGCCCGC 1634 F G L G P T G E T G L L V F D D T A F L A R 93 TACGGTCTCCTGGAGGGCTACTTCAGCGCC 1664 Y G L L E G Y F S A 104
Gambar 8 Skema hasil penggabungan ORF Gly-Hydro (GH11) dan Glyoxalase dengan arah berlawanan. RBS terdapat pada basa ke 7 arah upstream (hulu) dari kodon awal. Promoter terdapat pada nukleotida ke 225 sampai dengan 232 diapit oleh daerah -35 dan -10. P: promoter.
ORF 1 (1029 bp) ORF2 (309pb)
P RBS Gly_Hydro 11 Glyoxalase
24
Analisis Domain, Situs Aktif dan Struktur 3 Dimensi
Hasil analisis domain menggunakan program Conserved Domains Database (CDD) yang tersedia di situs NCBI menunjukkan bahwa fragmen gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3 memiliki dua domain yaitu kelompok glikosil hidrolase famili 11 (GH11) dan pada bagian ujung fragmen terdapat domain carbohydrate binding module type 2 (CBM2) yang merupakan daerah pengikatan substrat xilan atau selulosa. Berdasarkan analisis menggunakan scan prosite situs aktif enzim ini terdapat pada asam mino ke-130 (Gambar 9).
Gambar 9 Analisis domain menggunakan program Scan Prosite. Huruf berwarna merah menunjukkan posisi situs aktif (active site) domain Glyco_Hydrolase 11 (GH11). Huruf dengan latar kuning menunjuk-kan asam amino penyusun domain CBM2. Situs aktif terdapat pada asam amino ke-130.
MKIRSRRERRPRGPLTSLFRGVCAVVLLAVGALTLPGAGIAGADTVITSNQTGTDNGYYYSFW TDGGGTVSMNLGSAGNYSTNWSNAGNFVAGKGWSNGGRRSVTYSGTFNPPGNAYLSLYGW TSNPLVEYYIVDNWGSYRPTGTFKGTVTSDGGTYDIYETTRTNAPSVEGTKTFNQYWSVRQFK RTGGTITTGNHFDAWAGHGMNLGSFNYYMIMATESYQSSGSSNITVGSSGSGGGGGGTGGG GTGGGGTGGCTATVTAGQSWDDRYNLNVSVSGANNWTVTANVPAPEKVLSTWNVAASYPS AQVLTAKSNGSGNNWGLTVQKNGSTTWPTFSCTAN
25
(a) (b)
(a) (b)
Gambar 10 Prediksi struktur tiga dimensi enzim endoxilanase S. costaricanus 45I-3 menggunakan program Cn3D. (a) domain glikosil hidrolase famili 11, (b) domain CBM2.
Hasil visualisasi struktur 3 dimensi fragmen endoxilanase 11 mengguna-kan program Cn3D menunjukmengguna-kan bahwa fragmen ini memiliki bentuk seperti tangan kanan yang tertutup, dimana bentuk ini merupakan ciri umum dari endoxilanase famili 11. Lipatan domain katalitik terbagi menjadi dua lembar β (A dan B) merupakan helai antiparalel β dan satu helix alpha pendek yang menyerupai tangan kanan tertutup. Loop antara helai B7dan B8 membentuk 'thumb' dan loop yang menghubungkan helai B6 dan B9 ialah 'cord'.
Gambar 10b menunjukkan struktur 3D dari domain Carbohydrate Binding module keluarga 2 (CBM2). CBM2 terbagi atas CBM2a dan CBM2b. CBM2 yang ditemukan pada penelitin ini merupakan CBM2a yang spesifik mengikat substrat yang berupa selulosa. CBM keluarga 2a memiliki permukaan yang bersifat hidrofobik terdiri dari tiga residu triptofan, yang diperlukan untuk mengikat selulosa. CBM 2a membentuk struktur sheet yang luas dengan lipat β-barrel.
Analisis Berat Molekul dan Titik Isoelektrik
Berat molekul (BM) merupakan massa molekul relatif yang dimiliki oleh enzim xilanase GH11, sedangkan titik isoelektrik (pI) adalah derajat keasaman atau pH ketika suatu makromolekul bermuatan nol akibat bertambahnya proton atau kehilangan muatan oleh reaksi asam-basa. Penghitungan berat molekul dan
26
Compute pI/Mw
Theoretical pI/Mw (average) for the user-entered sequence:
10 20 30 40 50 60 MKIRSRRERR PRGPLTSLFR GVCAVVLLAV GALTLPGAGI AGADTVITSN QTGTDNGYYY 70 80 90 100 110 120 SFWTDGGGTV SMNLGSAGNY STNWSNAGNF VAGKGWSNGG RRSVTYSGTF NPPGNAYLSL 130 140 150 160 170 180 YGWTSNPLVE YYIVDNWGSY RPTGTFKGTV TSDGGTYDIY ETTRTNAPSV EGTKTFNQYW 190 200 210 220 230 240 SVRQFKRTGG TITTGNHFDA WAGHGMNLGS FNYYMIMATE SYQSSGSSNI TVGSSGSGGG 250 260 270 280 290 300 GGGTGGGGTG GGGTGGCTAT VTAGQSWDDR YNLNVSVSGA NNWTVTANVP APEKVLSTWN 310 320 330 340 VAASYPSAQV LTAKSNGSGN NWGLTVQKNG STTWPTFSCT AN
Theoretical pI/Mw: 9.26 / 35.67495
titik isoelektrik dilakukan dengan cara menginput data asam amino yang menyusun domain GH11 ke situs (http://web.expasy.org/compute_pi/).
Gambar 11 Hasil Input data analisis berat molekul (BM) dan nilai titik isoelektrik (pI) Untuk GH11.
Dari hasil analisis diketahui bahwa enzim endoxilanase keluarga 11 (GH11) dari S. costaricanus 45I-3 memiliki berat molekul sebesar 35.67 kDa dengan nilai isolektrik 9.26 A.
PEMBAHASAN
Amplifikasi gen penyandi enzim xilanase ekstraselular pada Streptomyces costaricanus 45I-3 menggunakan dua pendekatan yang berbeda,
yaitu dengan pendekatan PCR menggunakan primer forward dan primer reverse dan metode Inverse-PCR menggunakan primer dengan perpanjangan ke arah luar parsial gen endoxilanase yang telah dilaporkan Aziz (2010). Untuk mengamplifikasi gen menggunakan pendekatan PCR, sebanyak 9 pasang primer berhasil dirancang berdasarkan gen endoxilanase Streptomyces yang tersedia di GenBank. Namun amplifikasi menggunakan 9 pasang primer tesebut tidak ada yang menghasilkan pita target yang sesuai dengan prakiraan panjang amplikon pada setiap pasang primer.
Sembilan kombinasi primer tidak berhasil mengamplifikasi gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3 mungkin disebabkan karena primer yang disusun tidak cocok sehingga tidak menempel pada target yaitu gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3. Ketidakcocokan ini karena adanya perbedaan nukleotida primer dengan gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3. Primer dapat bekerja dengan baik apabila sekuen nukleotida primer cocok dengan lokasi gen target yang akan saling berkomplemen (Hillis et al. 1996). Daerah yang digunakan sebagai cetakan adalah daerah yang conserve dari gen target yang akan mendukung kecocokan dari primer (Birt & Baker 2000). Kemungkinan yang lain adalah perbedaan suhu penempelan primer yang berbeda jauh antara primer forward dan reverse serta adanya struktur hairpin dan dimer. Penentuan suhu penempelan primer adalah langkah yang paling penting di dalam proses PCR (Koressaar & Remm 2007). Struktur sekunder pada primer dapat menyebabkan masalah selama proses PCR, sehingga perlu dihindari sekuen yang saling berkomplemen di dalam primer (hairpin) atau sekuen yang saling berkomplemen antara primer forward dan reverse (primer-dimer) itu sendiri (Newton & Graham 1997; McDowell 1999; Birt 2000; Rapley 2000).
Kesulitan dalam mengamplifikasi gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3 menggunakan pendekatan PCR disebabkan karena banyaknya sekuen nukleotida yang tidak lestari terutama pada bagian hulu gen endoxilanase kelompok
28
Streptomyces. Dengan banyaknya perbedaan sekuen nukleotida yang berbeda maka dapat terjadi kegagalan primer menempel pada cetakan yang sesuai. Adanya sekuen nukleotida yang cukup beragam pada daerah hulu gen endoxilanase mengindikasikan bahwa gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3 memiliki sekuen yang berbeda dengan sekuen gen endoxilase bakteri lain.
Kegagalan mengamplifikasi gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3 menggunakan metode PCR mendorong dilakukan pendekatan dengan metode Inverse-PCR (i-PCR). Metode i-PCR secara prinsip hampir sama dengan metode PCR biasa, namun perbedaan mendasar terdapat pada pola amplifikasi gen yang mengarah keluar gen. Amplifikasi dengan i-PCR menggunakan tiga pasang primer yang berbeda (Lampiran 1). Dari ketiga pasang primer tersebut hanya satu diantaranya (Sc-F1 & Sc-R1) yang menghasilkan pita target dengan ukuran 1500 pb. Produk i-PCR selanjutnya di sekuen dan disejajarkan untuk menentukan panjang amplikon yang dihasilkan. Hasil pensejajaran menunjukkan bahwa enzim restriksi HinfI memotong sekuen nukleotida ke 694 ke arah hilir parsial gen (Aziz 2010) dan nukleotida ke 562 pada arah hulu parsial gen. Hal ini tergambar dengan adanya daerah tumpang tindih (overlaping) pada urutan nuleotida tersebut. Dari hasil ini didapat panjang amplikon yang teramplifikasi secara keseluruhan yaitu sebesar 1664 pb.
Tingkat kemiripan antara sekuen asam amino domain endoxilanase S. costaricanus 45I-3 dibandingkan dengan sekuen asam amino yang ada di NCBI paling tinggi terhadap xylanase bacterium enrichment culture clone Xyl8B8 yaitu dengan kemiripan (identitas) sebesar 95%, terhadap endo-1,4-beta-xylanase B Streptomyces sp. e14 dengan kemiripan sebesar 81%. Terhadap gen endo-1,4-beta-xylanase tiga isolat lainnya, yaitu Streptomyces davawensis JCM 4913, Streptomyces coelicoflavus ZG0656, dan Streptomyces sp. SirexAA-E menunjukkan kemiripan sebesar 77%. Semakin tinggi nilai kemiripan menunjuk-kan bahwa sekuen gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3 semakin tepat. Dua fragmen DNA dikatakan homolog jika 70% sekuen basa atau 25% sekuen asam amino identik (panjang sekuen minimal 100 pasang basa) (Claviere & Notredame 2003).
29 Nilai probabilitas atau peluang yang terhitung secara statistik dalam kesamaan sekuen antara gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3 di GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) digambarkan dengan nilai Expectation value (E-value). Tabel 4 menujukkan bahwa nilai E.value terkecil pada gen xyalanase bacterium enrichment culture clone Xyl8B8 yaitu 4e-175, berikutnya endo-1,4-beta-xylanase B Streptomyces sp. e14 sebesar 145 dan berturut-turut 134, 4e-136, dan 2e-141 pada endo-1,4-beta-xylanase dari Streptomyces davawensis JCM 4913, Streptomyces coelicoflavus ZG0656, dan Streptomyces sp. SirexAA-E. Hasil BLASTP asam amino penyandi gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3 ini bersifat signifikan. Pada analisis melalui BLAST, E-value signifikan apabila nilainya 1x10-10 atau lebih kecil (Altschul et al. 1990).
Gen penyandi xylanase pada bacterium enrichment culture clone Xyl8B8 berhasil diamplifikasi oleh Christel et al. (2012). Isolat bacterium enrichment culture clone Xyl8B8 merupakan bakteri Gram-positif yang diisolasi dari usus rayap (Reticulitermes santonensis). Lebih lanjut dijelaskan bahwa dari 5 ORF lengkap yang berhasil diisolasi salah satunya ialah gen endo-1,4-beta-xilanase yang dikodekan oleh 340 asam amino (XylB8) dan merupakan anggota keluarga glikosil hidrolase 11 (GH11).
Deduksi asam amino menunjukkan bahwa gen gen xilanase keluarga 11 memiliki daerah yang sangat lestari di bagian tengah-tengah gen (sekuen yang ditandai dengan garis bawah pada Gambar 4. Berbeda dengan sekuen asam amino penyusun bagian hulu gen (asam amino 1 sampai dengan 40) dari kelima sekuen gen yang dibandingkan hanya 1 sekuen yang memiliki kesamaan dengan sekuen asam amino gen GH11 S. costaricanus 45I-3 yaitu dengan gen xilanase dari bacterium enrichment culture clone Xyl8B8 yang ditemukan oleh Cristel et al. (2012). Untuk bagian hilir gen daerah yang tidak lestari ditemukan pada asam amino 240-252 (asam amino S. c sebagai patokan) yang ditandai dengan cukup beragamnya sekuen asam amino penyusun gen xilanase pada daerah tersebut. Dari kelima sekuen asam amino yang dibandingkan (Gambar 4) terlihat bahwa hanya tiga diantaranya yang memiliki asam amino N terminal. Hal ini karena asam amino terakhir penyusun gen xilanase pada Streptomyces davawensis JCM 4913 (Jankowitsch et al. 2012) dan Streptomyces coelicoflavus adalah asam amino serin
30
(s). Ini artinya kemungkinan amplifikasi gen xilanase pada kedua bakteri ini masih parsial ialah belum memiliki stop kodon pada kerangka baca (ORF).
Analisis open reading frame (ORF) menunjukkan ada ORF dari urutan nukleotida 316 sampai dengan 1344. Urutan tersebut membawa kodon awal (ATG) pada posisi 316, sedangkan kodon akhir (TGA) pada posisi 1344. ORF tersebut telah lengkap karena memiliki kodon awal dan kodon akhir. ORF mempunyai 342 asam amino. Setelah dilakukan BLASTP, ORF ini diduga mengekspresikan protein Glyco_hydro 11 yang merupakan keluarga glikosil hidrolase 11 (GH11). Salah satu enzim yang termasuk ke dalam keluarga GH11 adalah endo-1,4-beta-xilanase (Christel et al. 2012). Analisis ORF menunjukkan bahwa ada ORF lainnya dari urutan nukleotida 1355 sampai dengan 1663. ORF ini membawa kodon akhir (TAG) pada posisi 1355 tetapi belum ada kodon awal. ORF memiliki 102 asam amino. Hasil BLASTP menunjukkan bahwa ORF ini mengekspresikan glyoxalase/bleomycin resistance protein (Gly_BRP). Berdasar-kan hasil analisis ORF Finder diketahui bahwa protein Glyco_Hidro 11 dan Gly_BRP tidak pada operon yang sama, ditandai dengan adanya kodon akhir dengan posisi yang berlawanan. Karena ada dua ORF dengan operon yang berbeda, oleh sebab itu perlu diketahui RBS atau Shine Delgarno, dan promoter untuk masing-masing operon (Tang 1991, Baldini et al. 1999). Hasil analisis promoter (Lampiran 6) menunjukkan bahwa arah transkripsi ke dua gen ini berlawanan (Gambar 8).
Gen penyandi endoxilanase mengkodekan protein enzim yang memiliki peranan penting dalam menghidrolisis xilan secara sempurna menjadi xilosa (Esteves et al. 2004). Enzim ini dapat dihasilkan oleh beberapa organisme seperti bakteri, alga, jamur dan aktinomisetes (Beg et al. 2001). Berdasarkan hasil beberapa penelitian, panjang ORF gen endoxilanase pada bakteri berbeda-beda. Pada bacterium enrichment culture clone Xyl8B8, gen endoxilanase tersusun atas 1025 pb nukleotida (Christelet al. 2012), pada Streptomyces sp.9 tersusun atas 1023 pb nukleotida (Li et al. 2008). Penelitian yang dilakukan Deesukon et al. (2011) menemukan bahwa nukleotida penyusun gen endoxilanase pada bakteri Streptomyces sp. SWU10 tersusun atas 1011 pb.
31 Berdasarkan analisis menggunakan scan prosite situs aktif enzim ini terdapat pada asam mino ke-130 (Gambar 9). Dalam struktur enzim dapat ditemukan satu atau lebih situs pengikatan substrat (situs aktif). Molekul (substrat) berupa xilan akan melekat pada situs aktif untuk membentuk kompleks enzim-substrat dan menghasilkan pembentukan ikatan atau perusakan dengan pelepasan satu atau beberapa produk. Proses reaksi terjadi pada tingkat lebih cepat untuk menghambat aktivasi enzim yang lebih rendah dengan menurunkan energi aktivasi. Tanpa aktivitas enzim reaksi sel akan terlalu lambat untuk mempertahankan hidup. Menurut hipotesis “lock dan key" bentuk sebuah situs aktif hanya cocok satu bentuk substrat. Kekhususan ini mencegah reaksi acak serta pengendalian terhadap ketidak spesifikan substrat.
Endoxilanase famili 11 merupakan salah satu famili glikosil hidrolase dengan Glutamat (Glu) sebagai basa nukleofil maupun donor protonnya. Topologi enzim ini berupa lipatan pita β yang saling tumpuk (Christel et al. 2012). Törrönen dan Rouvinen (1997) mengemukakan bahwa untuk menjadi enzim yang aktif, endoxilanase famili 11 secara keseluruhan harus memiliki 19 area yang terdiri atas N, B1, B2, A2, A3, B3, A5, B5, B6, Cord, B9, B8, Thumb, B7, A6, Helik, B4, A4 dan C terminal. Berdasarkan hasil visualisasi Cn3D yang telihat (Gambar 10), ke-19 area tersebut telah berhasil teramplifikasi sehingga enzim ini dapat untuk diekspresikan menjadi enzim fungsional.
Struktur tiga dimensi dari endoxilanase famili11 telah ditentukan pada beberapa enzim, baik dari bakteri maupun jamur. Lipatan domain katalitik terbagi menjadi dua lembar β (A dan B) merupakan helai antiparalel β dan satu helix alpha pendek yang menyerupai tangan kanan tertutup. Loop antara helai B7dan B8 membentuk 'thumb' dan loop yang menghubungkan helai B6 dan B9 ialah 'cord'. Dua residu asam glutamat telah ditemukan masing-masing pada helai B4 dan B6 dan merupakan katalis penting dalam aktivasi enzim xilanase ekstraselular (Törrönen & Rouvinen1997).
Analisis domain menunjukkan bahwa fragmen gen glikosil hidrolase yang berhasil diamplifikasi memiliki dua domain yaitu glikosil hidrolase famili 11 (GH11) dan pada bagian ujung fragmen terdapat domain carbohydrate binding type 2 (CBM2) yang merupakan daerah pengikatan substrat xilan dan selulosa
32
tergantung pada jenis CBM2. CBM2 terbagi atas CBM2a dan CBM2b. CBM2 yang ditemukan pada penelitin ini merupakan CBM2a yang spesifik mengikat substrat yang berupa selulosa. Seperti domain CBM lainnya domain CBM2 berisi struktur β-sheet yang berinteraksi dengan ligan melalui strip hidrofobik residu aromatik. CBM keluarga 2a memiliki permukaan yang bersifat hidrofobik terdiri dari tiga residu triptofan, yang diperlukan untuk mengikat selulosa, sedangkan CBM keluarga 2b hanya memiliki 2 tryptopan yang saling berbeda orientasi. CBM 2a membentuk struktur β-sheet yang luas dengan lipat β-barrel. Titrasi dengan cellohexaose, [beta-D-glucopyranosyl-(1,4)] 5-D-glukosa, menunjukkan