BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Febuari hingga Juli 2008 di Laboratorium Bagian Mikrobiologi Departemen Biologi, FMIPA, IPB.

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah genom M. magneticum AMB-1, sekuen ORF 14 (gene id: amb0759) dan ORF 38.0 (gene id: amb1482), galur Escherichia coli

DH5α, media Luria Agar (LA) (NaCl 10 g/L, Bacto Trypton 10 g/L, Yeast extract 5 g/L dan Bacto Agar 15 g/L) dan Luria Broth (LB), ampisilin (5 mg/ml), pGEMT-Easy (Promega) (Lampiran 2), gel agarosa,

KIT-Kelompok bakteri magnet merupakan bakteri gram negatif dan termasuk ke dalam grup α-proteobakteria (Burgess et al. 2007). Bakteri magnet memiliki habitat di perairan tawar dan laut. Kelompok bakteri magnet memilih lingkungan mikroaerofilik atau anaerob seperti sedimen dan memiliki ketergantungan terhadap unsur-unsur mineral dalam perairan, terutama terhadap besi (Schuler & Baeurlein 1998).

Bakteri magnet memiliki kemampuan untuk merespon medan magnet dan cenderung bermigrasi sepanjang garis bidang magnet bumi (Blakemore 1975). Hal ini dikarenakan kemampuan kelompok bakteri tersebut mensintesis magnetosom. Magnetosom merupakan partikel magnetit (Fe3O4) atau greigit (Fe3S4), dan dilapisi membran fesikel yang berasal dari invaginasi membran sitoplasma (Gorby et al. 1998, Komeili et al. 2006). Umumnya magnetosom tersusun berantai dalam sel, terdiri dari 15 sampai 20 partikel magnet berukuran antara 20 hingga 50 nm. Magnetosom berperan seperti jarum kompas yang mengorientasikan bakteri magnet pada medan magnet bumi, sehingga bakteri magnet dapat memilih lingkungan mikroaerofilik yang menjadi habitatnya (Bazylinski & Frankel 2004, Smith et al. 2006).

Salah satu strain bakteri magnet yang sering dijadikan model dalam biosintesis magnetosom adalah Magnetospirillum magneticum AMB-1. Strain tersebut bersifat anaerob fakultatif, mampu tumbuh dalam kondisi aerob, namun tidak dapat mensintesis magnetosom. Strain tersebut juga mudah dikulturkan di laboratorium (Matsunaga et al. 1991). Partikel magnetosom dalam sel M. magneticum

AMB-1 berupa magnet magnetit (Fe3O4) dan tersusun berbentuk rantai memanjang searah panjang sel (Wahyudi et al. 2003).

Matsunaga et al. (2005) telah mensekuen keseluruhan DNA genom M. magneticum AMB-1. Ukuran genom total

M. Magneticum AMB-1 adalah 4. 9 Mb. Berdasarkan studi genetik terhadap pembentukan magnetosom pada M. magneticum AMB-1 melalui mutagenesis menggunakan transposon, setidaknya ada 36 gen yang terlibat dalam biosintesis magnetosom dan tersebar pada genom

magnetosom melalui mutagenesis menggunakan transposon adalah ORF 14 dan ORF 38.0 (Wahyudi 2004a).

Penelitian ini menggunakan sekuen ORF 14 dan 38.0 yang terdapat pada Gen Bank untuk dianalisis secara bioinformatika. Kedua ORF akan diintroduksikan ke dalam sel Esherichia coli DH5α menggunakan vektor kloning pGEMT-Easy. Kloning molekuler yang dilakukan dalam penelitian ini akan berguna dalam telaah lanjutan mengenai peranan kedua ORF dalam biosintesis magnetosom pada M. magneticum AMB-1.

Biosintesis magnetosom pada bakteri merupakan proses kompleks yang diregulasi secara genetik. Sampai saat ini mekanisme dalam pembentukan magnetosom belum dapat dipahami sepenuhnya (Grünberg 2001, Wahyudi 2004b). Sehingga diperlukan telaah molekuler seperti isolasi, kloning molekuler, dan karakterisasi tiap gen yang terlibat biosintesis magnetosom.

Tujuan

Melakukan analisis bioinformatika dan melakukan kloning molekuler terhadap dua ORF yang terlibat dalam biosintesis magnetosom.

BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Febuari hingga Juli 2008 di Laboratorium Bagian Mikrobiologi Departemen Biologi, FMIPA, IPB.

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah genom M. magneticum AMB-1, sekuen ORF 14 (gene id: amb0759) dan ORF 38.0 (gene id: amb1482), galur Escherichia coli

KIT-Polymerase Chain Reaction (PCR) (TAKARA La Taq), primer spesifik (forward dan reverse) yang didesain berdasarkan sekuen ORF 14 dan 38.0, Geneaid Gel/PCR Fragments Extraction Kit, bufer transformasi (0.1 M CaCl2, 5 mM MgCl2, 5mM Tris-Cl pada pH 7), enzim restriksi EcoRI, NdeI dan BamHI (Promega). Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mesin sentrifuse (Jouan A14), mesin PCR 2400 (Perkin-Elmer), piranti elektroforesis (BioRad), dan peralatan yang umum digunakan di laboratorium mikrobiologi.

Metode

Analisis Bioinformatika Sekuen ORF 14 dan ORF 38.0. Analisis bioinformatika sekuen ORF 14 (gene id: amb0759) dan ORF 38.0 (gene id: amb1482) menggunakan program Bioedit, ScanProsite yang tersedia di situs www.expasy.org, dan BLASTX yang tersedia di situs www.ncbi.nlm.nih.gov.

Amplifikasi ORF 14 dan ORF 38.0 dengan Polymerase chain reaction. Amplifikasi ORF 14 (1059 bp) dan ORF 38.0 (1482 bp) dilakukan dengan mencampurkan berturut-turut 1.25 µl ddH2O, 12.5 µl bufer PCR GC II, 4 µl (2.5 mM) dNTPs, 0.25 µl (5 unit/µl) enzim LA Taq DNA Polymerase, 1 µl (10 pmol) primer spesifik (forward dan reverse) masing-masing ORF, dan 5 µl (0.5 µg) DNA template. Sekuen primer spesifik ORF 14 yaitu forward: GGG GGA CAT ATG AAG AGT CCG GAT ACC;

reverse: GGG GGA TCC AAA CTA TTT CGC CGC TTC GCC. Sedangkan sekuen primer spesifik ORF 38.0 yaitu forward: GGG GGA CAT ATG AGC GAC GTC GTC GAA; reverse: GGG GGA TCC AAA TCA CGT GTC GTC CCC CCA. Sekuen kedua primer yang digunakan dalam penelitian ini memiliki situs restriksi enzim NdeI (forward, terlihat pada basa yang digarisbawahi) dan BamHI (reverse, terlihat pada basa yang digaris bawahi) (Lampiran 3).

Tahap awal dalam reaksi PCR adalah pradenaturasi pada suhu 95 ⁰C selama 2 menit. Selanjutnya reaksi PCR dilakukan sebanyak 30 siklus, tiap siklus terdiri dari tahap denaturasi, annealing, dan elongasi. Denaturasi kedua DNA dilakukan pada suhu 95⁰C selama 2 menit, annealing pada

suhu 58⁰C selama 1 menit, dan elongasi pada suhu 72⁰C selama 1 menit. Tahap terakhir dilakukan pada suhu 72⁰C selama 10 menit.

Produk PCR dielektroforesis pada gel agarosa 1% (b/v). Proses selanjutnya adalah purifikasi produk PCR dari gel agarosa menggunakan PCR Fragments Extraction Kit (Geneaid). Setelah dielektroforesis, gel berisi pita DNA hasil PCR dipotong dan dimasukkan ke dalam tabung mikro 1.5 ml. Kemudian, ke dalam tabung tersebut ditambahkan 500 µl DF Buffer, lalu diinkubasi pada suhu 60⁰C selama 10 menit. Setelah gel larut, tabung mikro diinkubasikan hingga suhunya sama dengan suhu ruang. Pengikatan DNA dilakukan dengan memasukkan campuran gel ke dalam tabung penampung yang dilengkapi DFkolom. Selanjutnya tabung penampung disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 30 detik. Cairan yang tertampung dibuang, kemudian DFkolom dimasukkan kembali ke dalam tabung penampung. Proses pencucian dilakukan dengan menambahkan 600 µl Wash Buffer

pada DFkolom dan disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 30 detik. Cairan yang tertampung dibuang, kemudian Dfkolom dikembalikan ke tabung penampung dan disentrifugasi selama 3 menit untuk mengeringkan membran pada DFkolom. DFkolom dipindahkan ke tabung mikro steril, lalu 30 µl Elution Buffer ditambahkan di tengah-tengah membran Dfkolom, untuk proses elusi. Kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit dan disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 13000 rpm. DFkolom dibuang dan DNA yang tertampung disimpan pada suhu -20⁰C.

Kloning ORF 14 dan ORF 38.0 ke dalam sel E. coli DH5α. Amplikon hasil purifikasi diligasi ke dalam vektor kloning pGEMT-Easy. Ligasi ORF 14 ke plasmid pGEMT-Easy dilakukan dengan mencampurkan berturut-turut 5 µl 2x

Rapid Ligation Buffer (Promega), 0.53 µl (53 ng) DNA sisipan, 1 µl (3 Weiss Unit/µl) enzim T4 DNA ligase (Promega), 1 µl (50 ng) vektor kloning pGEMT-Easy (Promega). Campuran kemudian dilarutkan dengan ddH2O hingga volume reaksi 10 µl. Ligasi ORF 38.0 ke plasmid pGEMT- Easy dilakukan dengan mencampurkan berturut-turut 5 µl 2x

DNA sisipan, 1 µl (3 Weiss Unit/µl) enzim T4 DNA ligase, dan 1 µl (50 ng) vektor kloning pGEMT-Easy. Campuran kemudian dilarutkan dengan ddH2O hingga volume reaksi 10 µl. Inkubasi dilakukan pada suhu 15 ⁰C selama 12 jam. Ligasi ORF 14 dan ORF 38.0 ke dalam pGEMT-Easy akan menghasilkan plasmid rekombinan pGEMT-Easy-14 dan pGEMT-Easy-38.0 (Gambar1). Plasmid rekombinan kemudian diintroduksikan kedalam sel E. coli DH5α (Gambar 1) menggunakan metode kejutan panas (Sambrook & Russel 1989).

Tahap awal dalam introduksi kedua plasmid rekombinan ke dalam sel E. coli

DH5α adalah pembuatan sel kompeten (Sambrook & Russel 1989). Satu koloni E. coli DH5α dikulturkan kedalam 2 ml media LB, lalu diinkubasi pada suhu 37 ⁰C dan kecepatan 100 rpm selama 16 jam. Setelah 16 jam, 0.5 ml kultur dipindahkan ke dalam 50 ml media LB, dan diinkubasi selama 3 jam pada suhu 37 ⁰C dan kecepatan 100 rpm. Sebanyak 1.5 ml kultur dipindahkan kedalam tabung mikro steril dan disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Pelet yang didapat kemudian diresuspensi dengan 1 ml bufer transformasi (0.1 M CaCl2, 5 mM MgCl2, 5mM Tris-Cl pada pH 7) dingin lalu diinkubasi dalam es selama 20 menit, dan disentrifugasi kembali pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Pelet yang didapatkan kemudian diresuspensi dengan 250 µl bufer transformasi dingin selama 10 menit. Setelah diinkubasi dalam es, sel

E. coli DH5α telah kompeten dan siap diintroduksi dengan plasmid rekombinan. Sebanyak 250 µl sel E. coli yang telah dibuat kompeten dicampurkan dengan 10 µl plasmid rekombinan dan diinkubasi pada suhu 42⁰C selama 45 detik, kemudian diinkubasikan kembali dalam es selama 2 menit. 100 µl media LB ditambahkan kedalam suspensi dan diinkubasi pada inkubator bergoyang selama 24 jam pada suhu 37⁰C. Suspensi selanjutnya disentrifugasi pada 8000 rpm selama 2 menit, pelet diresuspensi dengan 100 µl media LB, kemudian sebanyak 100 µl suspensi disebarkan pada media LA + Amp 50 µg/ml + X-gal 40 µg/ml.

Verifikasi Hasil Kloning ORF 14 dan ORF 38.0. Verifikasi dilakukan untuk memastikan bahwa koloni putih E. coli

DH5α yang tumbuh pada media LA

diduga membawa plasmid rekombinan pGEMT-Easy-14 dan pGEMT-Easy-38.0. Verifikasi dilakukan dengan pemotongan plasmid rekombinan menggunakan enzim restriksi EcoRI (5‘ G–A–A–T–T–C 3‘),

BamHI (5; G–G–A–T–C–C 3‘), dan NdeI (5‘ C–A–T–A–T–G 3‘) (Promega), dan PCR koloni menggunakan primer spesifik untuk mengamplifikasi kedua ORF.

Isolasi plasmid rekombinan menggunakan metode Sambrook & Russel (1989) dilakukan dengan mengkulturkan koloni putih yang tumbuh ke dalam 10 ml media LB, lalu diinkubasi pada suhu 37 ⁰C dan kecepatan 100 rpm selama 16 jam. 1,5 ml kultur sel E. coli DH5α disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 2 menit, pelet diresuspensi dengan 100 µl larutan A (glukosa 50 mM, Tris-Cl 25 mM pH 8 dan ethylenediamintetra-acetic acid [EDTA] 10 mM pH 8), lalu ditambahkan 150 µl larutan B (sodium dodecyl sulfat [SDS] 1% dan NaOH 0.2 N) untuk melisis sel, dan 200 µl larutan C (kalium asetat 5M dan asam asetat glasial pada pH 6), kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Presipitasi plasmid dilakukan menggunakan etanol absolut (2 kali volume) dan sodium asetat 3 M (10% volume total), dan diinkubasi selama 12 jam pada suhu -20 ⁰C, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Pelet dibilas dengan 1 ml etanol 70 %, kemudian dikeringudarakan selama 3 jam. Plasmid rekombinan diresuspensi dalam 20 µl ddH2O, lalu ditambahkan 0.2 µl RNase 1% (b/v). Verifikasi pertama kali dilakukan dengan pemotongan plasmid rekombinan menggunakan enzim restriksi EcoRI. Sebanyak 3 µl (± 120 ng) plasmid rekombinan hasil isolasi ditambahkan 2 µl bufer H (Promega), 0.2 µl Bouvine serum albumin (BSA) (Promega), 0.5 µl (6 unit)

EcoRI (Promega) dan ddH2O hingga volume reaksi 20 µl. Campuran reaksi kemudian diinkubasi pada suhu 37 ⁰C selama 12 jam. ORF 14 memiliki situs restriksi untuk EcoRI pada basa ke 776, sehingga pemotongan plasmid rekombinan pGEMT-Easy-14 akan menghasilkan 3 pita DNA berukuran 3 kb (pGEMT-Easy), pita sekitar 0.8 kb, dan 0.3 kb (ORF 14). Sedangkan pemotongan plasmid rekombinan pGEMT-Easy-38.0 hanya akan menghasilkan 2 pita DNA berukuran 3 kb (pGEMT-Easy) dan pita sekitar 1.5 kb (ORF 38.0).

Gambar 1. Skema konstruksi plasmid rekombinan pGEMT-Easy-14 dan pGEMT-Easy-38.0, dan kloning kedua ORF ke dalam sel E. coli DH5α.

Amplikon ORF 14 (1059 pb) NdeI BamHI

Amplikon ORF 38.0 (1482 pb) NdeI BamHI

E. coli DH5α yang membawa plasmid rekombinan

pGEMT-Easy-14

E. coli DH5α yang membawa plasmid rekombinan

pGEMT-Easy-38.0 TRANSFORMASI TRANSFORMASI Nae 2707 XmnI2009 ScaI 1890 Nae 2707 XmnI2009 ScaI 1890 Nae 2707 XmnI2009 ScaI 1890 Nae 2707 XmnI2009 ScaI 1890 Amp^r _lac_Z Amp^r _lac_Z pGEMT-Easy-14 (4.1 kb) lacZ Amp^r lacZ lacZ Amp^r ORI ORI pGEMT-Easy-38.0 (4.5 kb)

Plasmid rekombinan (pGEMT-Easy-14 dan pGEMT-Easy-38.0) yang telah diverifikasi menggunakan enzim restriksi

EcoRI, kemudian dipilh untuk pemotongan menggunakan enzim restriksi

BamHI dan NdeI (Promega) yang situs restriksinya terdapat pada primer spesifik kedua ORF. Sebanyak 3 µl (± 160 ng) plasmid rekombinan ditambahkan 2 µl bufer D (Promega), 0.2 µl BSA (Promega), 0.5 (5 unit) µl BamHI, 0.5 µl (5 unit) NdeI dan ddH2O hingga volume reaksi 20 µl. Campuran reaksi kemudian diinkubasi pada suhu 37 ⁰C selama 12 jam.

PCR koloni menggunakan primer spesifik ORF 14 dan ORF 38.0 dilakukan untuk memastikan bahwa DNA sisipan adalah benar-benar ORF 14 dan ORF 38.0. Koloni putih E. coli DH5α yang telah diverifikasi menggunakan enzim restriksi

EcoRI, BamHI, dan NdeI kemudian disuspensikan kedalam 25 µl ddH2O dan dipanaskan pada suhu 95 ⁰C selama 2 menit, 2.5 µl suspensi ditambahkan kedalam 22.5 µl reaksi PCR. Komposisi reaksi dan kondisi PCR dalam verifikasi sama dengan kondisi PCR yang digunakan untuk mengamplifikasi kedua ORF tersebut diatas. Visualisasi hasil restriksi dan PCR koloni dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 0.7% (b/v).

HASIL

Hasil Analisis Bioinformatika Sekuen ORF 14 dan ORF 38.0. Hasil analisis bioinformatika menggunakan program BLASTX NCBI untuk ORF 14 menunjukkan sekuen tersebut mengkodekan protein yang memiliki homologi sebesar 90% dengan protein

berdomain GGDEF pada M. magnetotacticum MS-1, sedangkan ORF 38.0 mengkodekan protein yang memiliki homologi sebesar 70% dengan

6-hydroxynicotinate reductase pada

Bradyrhizobium sp. BTAi1 (Tabel 1). Sekuen asam amino yang dikode ORF 14 berdasarkan analisis program ScanProsite memiliki ukuran 352 asam amino dan memiliki satu domain GGDEF (Gambar 2 a). Sekuen asam amino yang dikode ORF 38.0 memiliki ukuran 493 asam amino. Berdasarkan analisis menggunakan program ScanProsite, protein yang dikode ORF tersebut adalah protein feredoksin (2Fe2S) (Gambar 2b).

Amplifikasi ORF 14 dan ORF 38.0.

Visualisasi hasilamplifikasi ORF 14 dan ORF 38.0 pada gel agarosa 1% (b/v) menunjukkan pita berukuran sekitar 1.1 kb untuk ORF 14 dan sekitar 1.5 kb untuk ORF 38.0 (Gambar 3). Hal ini sesuai dengan ukuran sebenarnya kedua sekuen tersebut pada GenBank.

Kloning ORF 14 dan ORF 38.0 ke dalam sel E. coli DH5α. DNA hasil amplifikasi telah diligasikan kedalam vektor kloning pGEMT-Easy (3 kb), proses ligasi menghasilkan plasmid rekombinan pGEMT-Easy-14 dan pGEMT-Easy-38.0. Plasmid rekombinan yang dikonstruksi telah berhasil diintroduksikan ke dalam sel E. coli DH5α

melalui metode kejutan panas (heat shock). Koloni E. coli DH5α yang membawa plasmid rekombinan terlihat berwarna putih pada media LA yang mengandung ampisilin (50 µg/ml) dan X-gal (40 µg/ml) (Gambar 4).

Tabel 1. Hasil Analisis Bioinformatika Sekuen ORF 14 dan ORF 38.0, diambil tiga hasil yang terbaik dari analisis menggunakan program BLASTX-NCBI.

ORF Homologi Identitas (%) Similiaritas (%) E-value Organisme No Akses 14 GGDEF domain GGDEF domain Diguanylate cyclase 90 61 42 95 76 61 3e-170 2e-104 2e-66 M. magnetotacticum MS-1 M. gryphiswaldense MSR-1 Bradyrhizobium sp. BTAi1 ZP_00054 171.2 CAM7560 7.1 YP_00123 9949.1 38.0 6-hydroxynicotinate reductase 5-methyltetrahydropteroyltriglut amate-homocysteine methyltransferase 6-hydroxynicotinate reductase 70 66 65 82 80 77 0.0 0.0 9e-177 Bradyrhizobium sp. BTAi1 Roseobacter sp. AzwK-3b Burkholderia xenovorans LB400 YP_00123 8498.1 ZP_01901 924.1 YP_55464 9.1

Plasmid rekombinan (pGEMT-Easy-14 dan pGEMT-Easy-38.0) yang telah diverifikasi menggunakan enzim restriksi

EcoRI, kemudian dipilh untuk pemotongan menggunakan enzim restriksi

HASIL

berdomain GGDEF pada M. magnetotacticum MS-1, sedangkan ORF 38.0 mengkodekan protein yang memiliki homologi sebesar 70% dengan

6-hydroxynicotinate reductase pada

Amplifikasi ORF 14 dan ORF 38.0.

Tabel 1. Hasil Analisis Bioinformatika Sekuen ORF 14 dan ORF 38.0, diambil tiga hasil yang terbaik dari analisis menggunakan program BLASTX-NCBI.

a)

(352 aa)

GGDEF: (207-342) APLSLLMIDIDHFKQFNDTYGHQLGDQVLKLVARSLSEVAQAKDTAARYGGEEFAVILPA TPLEKSMEVAETIRNQVSTKRLTNrrtgqvLGQVTLSIGAALLREAEAPDSLVHRADEAM YLAKRDGRNRVKSEID b) (493aa) Keterangan: 1.HDG (103-105) 2Fe2S 2.RGG (358-361) 2Fe2S 3.LGG (450-452) 2Fe2S 4.QVI (462-464) 2Fe2S 5.RNY (485-487) 2Fe2S

Gambar 2. Hasil analisis bioinformatika menggunakan program ScanProsite. a. Domain GGDEF yang dikode ORF 14, b. Feredoksin (2Fe2S) yang dikode ORF 38.0.

1 2 3

Gambar 3. Elektroforesis gel agarosa 1 % (b/v)

DNA hasil amplifikasi ORF 14 (lane 2) dan ORF 38.0 (lane 3). Lane 1: Marker 1 kb DNA Ladder (Promega).

Verifikasi Hasil Kloning ORF 14 dan ORF 38.0. Pemotongan plasmid rekombinan hasil isolasi dari beberapa koloni putih E. coli

DH5α yang diduga adalah pGEMT-Easy-14 menggunakan enzim restriksi EcoRI telah menghasilkan pita berukuran 3 kb yang menunjukkan ukuran pGEMT-Easy, pita berukuran sekitar 0.8 kb dan 0.3 kb yang menunjukkan bahwa ORF 14 (sekitar 1.1 kb) telah terpotong EcoRI (Gambar 5a). Visualisasi hasil restriksi plasmid rekombinan pada lane 2 gel agarosa (Gambar 5a) hanya memperlihatkan dua pita yaitu pGEMT-Easy dan fragmen DNA yang tidak sesuai dengan ukuran ORF 14 jika terpotong EcoRI, sehingga plasmid rekombinan pada lane 2 bukan pGEMT-Easy-14. Pemotongan plasmid rekombinan yang diduga adalah pGEMT-Easy-38.0 menggunakan enzim restriksi

EcoRI telah menghasilkan pita berukuran 3 kb yang menunjukkan pGEMT-Easy dan pita

berukuran sekitar 1.5 kb yang menunjukkan ukuran ORF 38.0 (Gambar 5b). Verifikasi kedua plasmid rekombinan menggunakan enzim restriksi NdeI dan BamHI masing-masing menghasilkan dua pita pada gel agarosa (Gambar 5c). Pita 3 kb (lane 2 &3) menunjukkan ukuran plasmid pGEMT-Easy, sedangkan pita berukuran sekitar 1.5 kb (lane

2) menunjukkan ukuran ORF 38.0 dan pita berukuran sekitar 1.1 kb (lane 3) menunjukkan ukuran ORF 14. PCR koloni menggunakan primer spesifik ORF 14 dan ORF 38.0 menghasilkan pita berukuran sekitar 1.1 kb untuk ORF 14 dan sekitar 1.5 kb untuk ORF 38.0 (Gambar 5d). Pemotongan plasmid rekombinan dan PCR koloni yang dilakukan dalam penelitian ini telah membuktikan bahwa ORF 14 dan ORF 38.0 dari M. magneticum AMB-1 telah berhasil diintroduksi ke dalam sel E. coli DH5α. 10000 4000 2000 1500 1000 500 b ORF 38.0 (sekitar1.5 kb) ORF 14 (sekitar1.1 kb)

Gambar 4. Koloni putih E. coli DH5α yang diduga membawa plasmid rekombinan (ditunjukan oleh panah merah).

100 aa

1 2 3 4 5

PEMBAHASAN

Berdasarkan sekuen yang terdapat pada

GenBank, ORF 14 memiliki ukuran sebesar 1059 pasang basa (pb), sedangkan ORF 38.0 berukuran 1482 pb. Kedua ORF telah berhasil diamplifikasi dalam penelitian ini, elektroforesis gel agarosa menunjukkan pita DNA berukuran sekitar 1.1 kb untuk amplikon ORF 14 dan pita DNA berukuran sekitar 1.5 kb untuk amplikon ORF 38.0. Penentuan ukuran amplikon kedua ORF didasarkan pada pengamatan visual letak pita DNA terhadap marker (1 kb DNA Ladder Promega), terdapat kemungkinan perbedaan ukuran amplikon kedua ORF dengan ukuran kedua ORF pada

GenBank karena ada penambahan dari primer yang digunakan.

Analisis menggunakan program BLASTX NCBI dalam penelitian ini memperlihatkan sekuen tersebut mengkode protein yang memiliki homologi dengan protein berdomain GGDEF pada M. magnetotacticum MS-1. Hal ini ditunjukkan oleh nilai identitas (90 %) yang menunjukkan kesamaan sekuen asam amino dan nilai similiaritas (95 %) yang menunjukkan kesamaan struktur dan fungsi protein yang dikode ORF 14 dengan domain GGDEF. Nilai expectation value (e-value) menunjukkan jumlah pemasangan yang kemungkinan terjadi dengan sekuen yang ada di GenBank. Nilai e-value 0.0 menunjukkan kesamaan panjang kedua sekuen yang

1 2 3 4 5 1 2 3 4

a) Restriksi pGEMT-Easy-14 menggunakan EcoRI. b) Restriksi pGEMT-Easy-38 menggunakan EcoRI.

Lane 1: 1 kb DNA Ladder RealBiotech Lane 1: 1 kb DNA Ladder RealBiotech

Lane 3, 4, 5: Hasil Restriksi pGEMT-14 Lane 2, 3, 4: Hasil Restriksi pGEMT-38

1 2 3 1 2 3

c) Restriksi pGEMT-Easy-14 dan pGEMT-Easy-38.0 d) PCR koloni dari koloni putih E. coli DH5α menggunakan NdeI dan BamHI. Lane 1: 1 kb DNA Ladder RealBiotech

Lane 1: 1 kb DNA Ladder RealBiotech Lane 2: Amplikon ORF 14

Lane 2: Restriksi pGEMT-38.0 Lane 3: Amplikon ORF 38.0

Lane 3: Restriksi pGEMT-14

Gambar 5. Elektroforesis gel agarosa 0.7 % (b/v) DNA hasil verifikasi kloning ORF 14 dan 38.0 ke dalam E. coli DH5α. pGEMT-Easy (3 kb) Pita 0.8 kb ORF 14 Pita 0.3 kb ORF 14 3000 2000 1000 500 b b pGEMT-Easy (3 kb) ORF 38.0 (sekitar1.5 kb) 3000 2000 1000 500 pGEMT-Easy (3 kb) ORF 38.0 (sekitar 1.5 kb) ORF 14 (sekitar1.1 kb) 3000 2000 1000 500 b 3000 2000 1000 500 ORF 38.0 (sekitar1.5 kb) ORF 14 (sekitar 1.1 kb) b

PEMBAHASAN

Berdasarkan sekuen yang terdapat pada

GenBank karena ada penambahan dari primer yang digunakan.

Dalam dokumen Kloning Dua Kandidat Gen yang Terlibat Dalam Biosintesis Magnetosom pada Magnetospirillum magneticum AMB-1 di Escherichia coli (Halaman 24-35)