Kegiatan penelitian dilaksanakan mulai bulan Desember 2007 sampai dengan Oktober 2008 di Laboratorium
Biotechnology Research Indonesia – The Netherlands (BIORIN) dan Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, Kampus IPB Darmaga, Bogor.
Bahan
Daun M. malabathrichum digunakan sebagai bahan tumbuhan. Plasmid pGEM®-T
Easy (Gambar 1) digunakan sebagai vektor pengklonan dan Escherichia coli galur DH5 digunakan sebagai inang vektor rekombinan.
Gambar 1 Peta fisik plasmid pGEM®-T Easy.
Primer aktin ActF (ATGGCAGATGCC GAGGATAT) dan ActR (CAGTTGTGCGA CCACTTGCA) digunakan untuk verifikasi cDNA, primer spesifik Mt2F (TCGAGAAA AATGTCTTGCTGTG) dan Mt2R (CTTCAC TTGCAGGTGCAAGG) yang didesain berdasarkan cDNA Arabidopsis thaliana
(Nomor aksesi: AY037263) digunakan untuk mengisolasi cDNA Mt2 dari M. malabatrichum.
Metode
Isolasi RNA total dari daun
Semua alat dan media yang digunakan untuk isolasi RNA total disterilkan (diautoklaf pada 121 °C 20 menit), ddH2O yang digunakan diperlakukan dengan 0.1% (v/v) DEPC (Diethylpirocarbonate) dan disterilkan.
RNA total diisolasi dari daun muda M. malabathricum dengan menggunakan prosedur LiCl (Chang et al. 1993) yang dimodifikasi. Sebanyak 0.5 gram daun yang telah dipisahkan dari tulang daunnya digerus sampai halus bersama 0.3 gram pasir kuarsa, lau ditambahkan 3 ml buffer ekstraksi [2% CTAB (hexadecyl trimethyl amonium
bromide), 2% PVP (Polyvinyl pirolidon), 100 mM Tris-HCl pH 8, 25 mM EDTA, 2 M NaCl, dan 100mM -merkaptoetanol] yang bersuhu 65 °C dan digerus hingga halus, lalu dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml dan diinkubasi pada 65 °C 10 menit sambil dibolak-balik, ditambahkan 1x volume CI (kloroform:isoamilalkohol 24:1), lalu divorteks sebentar dan disentrifugasi 10000 rotasi per menit (rpm) pada 4 °C 10 menit (Jouan BR4i). Supernatan ditambah 1/4 kali volume LiCl 10 M dan diinkubasi pada suhu –20 °C selama 2 jam, lalu disentrifugasi 10000 rpm pada 4 °C 20 menit. Endapan yang terbentuk ditambah 400 l TE (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA pH 8) dan diekstraksi dengan 1x volume fenol pH 9, divorteks sebentar lalu disentrifugasi 10000 rpm pada 20 °C 10 menit. Supernatan ditambah 1/4 kali volume LiCl 10 M dan diinkubasi pada –20 °C selama 2 jam. Larutan kemudian disentrifugasi 10000 rpm pada 4°C 10 menit. Endapan selanjutnya dicuci dengan etanol 70% (v/v), disentrifugasi, dikeringudarakan, lalu diresuspensi dengan 20 l air DEPC.
Kuantifikasi dan kualifikasi RNA total
Kuantitas RNA total hasil isolasi ditentukan dengan spektrofotometer UV-VIS (Cecil CE 2020) pada panjang gelombang 260 dan 280 nm. Konsentrasi RNA ditentukan dengan penyetaraan bahwa satu satuan absorban pada panjang gelombang 260 nm sebanding dengan 40 g/ml RNA. Kemurnian RNA total diukur melalui perbandingan absorban panjang gelombang 260 nm dengan 280 nm, yaitu antara 1.8 sampai 2 (Sauders & Parker 1999).
Kualitas RNA ditentukan dengan elektroforesis pada gel agarosa 1% (b/v) (Sigma, Germany) dengan larutan penyangga MOPS [4.2/l gram MOPS (3-Morpholino propanesulfonic acid), 0.41 g/l Na-asetat, 0.37 g/l EDTA(2NA)H2O]. Sebanyak 1 l RNA dicampur dengan 12 l larutan premiks [5% 20 kali MOPS, 50% (v/v) formamida, 17.5% (v/v) formaldehid, 27.5% (v/v) air DEPC] dipanaskan pada 65 °C 10 menit, didinginkan di es selama 5 menit, dan diberi 1/6 kali volume loading dye [0.25% (b/v)
bromphenol blue, 0.25% (b/v) xylene cyanol
FF, 30% (v/v) gliserol], kemudian dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 30 menit. Visualisasi RNA dilakukan di atas UV transluminator GelDoc (Labquip) setelah direndam dalam EtBr (0.5 g/ml) selama 5 menit.
3
Sintesis cDNA
Sintesis cDNA dilakukan melalui reaksi transkripsi balik menggunakan Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen). Komposisi reaksi sintesis cDNA ialah 5 g RNA total, 1x RT buffer, 20 pmol primer oligo-dT, 4 mM dNTP, 10 mM DTT, 40 U enzim Superscript TMIII RTase, dan air DEPC dengan volume reaksi 20 l. Kualitas cDNA diperiksa menggunakan PCR dengan primer spesifik aktin. Komposisi reaksi PCR-aktin tersebut ialah 0.5 l cDNA, 1 l buffer Taq (Gen Scr Inc.), 0.2 mM dNTP, 10 pmol primer ActF, 10 pmol primer ActR, 4 % (b/v) DMSO (dimetilsulfoksida), 0.5 U enzim Taq DNA polimerase (Gen Scr Inc.), dan ddH2O hingga volume akhir 10 l. PCR dilakukan dengan kondisi pra-PCR pada 95 °C 5 menit, denaturasi pada 94 °C 30 detik, penempelan primer pada 55 °C 30 detik, dan pemanjangan pada 72 °C 1.5 menit sebanyak 35 siklus, pasca-PCR pada 72 °C 5 menit, dan inkubasi pada 15 °C 10 menit.
Amplifikasi fragmen cDNA MmMt2 dengan primer spesifik
cDNA Mt2 dari M. malabatrichum
(MmMt2) diisolasi dan diamplifikasi menggunakan PCR dengan primer spesifik
Mt2. Sebanyak 1 l hasil reaksi RT ditambah dengan 2 l 10x Taq buffer, 0.2 mM dNTP, 4 % (b/v) DMSO, 20 pmol primer Mt2F, 20 pmol primer Mt2R, 0.5 U enzim taq DNA polimerase (Gen Scr Inc.), dan dH2O hingga volume akhir 20 l. Reaksi PCR dilakukan dengan kondisi pra-PCR pada 95 °C 5 menit, denaturasi pada 94 °C 30 detik, penempelan primer pada 58 °C 30 detik, pemanjangan pada 72 °C 1.5 menit sebanyak 35 siklus, pasca-PCR pada 72 °C 5 menit, dan inkubasi pada 15°C 10 menit.
Pengklonan cDNA MmMt2 ke dalam pGEM®-T Easy
Sebelum di klon ke dalam inang, cDNA
MmMt2 diligasikan ke dalam vektor menggunakan prosedur Promega (1996). Komposisi reaksi ligasi ialah 2 µl 5x buffer
rapid ligase, 1 µl pGEM®-T Easy (10 ng), 1 µl ml T4 DNA ligase (3 U/µl) (Promega), dan 3 µl produk PCR, kemudian diinkubasi pada 4 °C selama semalam. Hasil ligasi diintroduksikan ke dalam E.coli galur DH5 menggunakan metode yang dipublikasikan Suharsono (2002).
Seleksi koloni E. coli yang mengandung vektor rekombinan
Seleksi yang digunakan ialah seleksi resistensi terhadap ampisilin dan seleksi biru- putih. Sebanyak 50 l bakteri hasil transformasi dicawansebarkan pada media 15 ml LB padat [1% bakto tripton, 0.5 % ekstrak khamir, 1% NaCl, 2.5 % agar (b/v)] yang mengandung 100 mg/l ampisilin, 10 l 100 mM isopropiltio- -galaktosida (IPTG), dan 50 l 2% (b/v) X-gal (5-bromo-4- chloro-3-indolyl- -D-galactoside), kemudian diinkubasi pada 37 °C selama semalam. Koloni putih yang tumbuh kemudian diambil menggunakan tusuk gigi steril dan digores pada LB padat dengan ampisilin untuk stok dan sisa goresannya digunakan sebagai bahan cetakan PCR untuk mendeteksi keberadaan sisipan cDNA MmMt2 dalam vektor rekombinan. Sisa goresan tersebut disuspensikan ke dalam 6.5 l ddH2O, dipanaskan pada 95 °C 10 menit, dan didinginkan pada 15 °C 5 menit. Suspensi ditambah dengan 1 l 10x buffer taq, 0.2 mM dNTP, 4 % (b/v) DMSO, 20 pmol primer
Mt2F, 20 pmol primer Mt2R, 0.5 U enzim taq DNA polimerase (Gen Scr Inc.) dengan volume akhir 10 l. PCR dilakukan pada kondisi yang sama dengan amplifikasi fragmen cDNA MmMt2.
Analisis cDNA sisipan
Plasmid pGEM®-T Easy rekombinan yang terdapat dalam koloni putih hasil seleksi biru-putih diisolasi menggunakan prosedur yang dipublikasikan oleh Suharsono (2002) dan Anwar (2008). Plasmid rekombinan yang telah diisolasi dikeluarkan sisipannya dengan pemotongan menggunakan enzim EcoR1 (Promega Inc.). Sebanyak 100 ng DNA plasmid dicampur dengan 10 U enzim restriksi EcoR1, buffer 1x, dan ddH2O sampai volume akhir 20 l, kemudian diinkubasi pada 37 °C selama 8 jam.
Pengurutan DNA dan analisisnya
Pengurutan DNA menggunakan DNA Sequencer ABI Prism model 310 versi 3.7. Selanjutnya, urutan cDNA dianalisis homologinya menggunakan program BLAST (basic local alignment search tools) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Deduksi asam amino fragmen MmMt2
menggunakan program translation dari EXPASY (http://www.expasy.ch/tools/dna/). Analisis keberadaan situs restriksi dalam cDNA MmMt2 dilakukan dengan menggunakan program NEBcutter ver.2.0
4
(http://www.tools.neb.com/NEBcutter2/htm). Analisis kesamaan, filogenetik, dan profil berdasarkan urutan nukleotida dan deduksi asam amino dengan Mt2 dari spesies lain menggunakan program MAFFT ver.6.0. (http://align.bmr.kyushu-.ac.jp/mafft/online/ server/) (Katoh et al. 2005). Analisis urutan nukleotida untuk mencari ORF (open reading frame) menggunakan program BESTORF (http://www.softberry/bestorf/). Analisis domain terkonservasi pada cDNA MmMt2
menggunakan program conserved domain
NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/ structure/cdd/wrpsb.cgi).