Penelitian dilaksanakan pada bulan Juli 2010 sampai bulan Juni 2011 di Laboratorium Fisiologi Tumbuhan, Laboratorium Terpadu, dan Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Departemen Biologi FMIPA IPB Bogor.
Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat mikroalga asal sumber air panas Cipanas (koleksi dari Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Departemen Biologi FMIPA IPB).
Metode Penelitian
Penelitian dilakukan dengan tahapan peremajaan isolat, verifikasi lipid, identifikasi morfologi dan molekuler serta optimasi media tumbuh isolat mikroalga (Gambar 1).
1. Peremajaan Mikroalga
Tahapan peremajaan ini dilakukan untuk mendapatkan jumlah dan masa sel isolat mikroalga yang cukup untuk digunakan pada tahapan uji selanjutnya. Tahapan ini dilakukan dengan menumbuhkan masing-masing isolat mikroalga pada media yang berisi air dari sumber air panas (SAP) ditambah media BG 11 (Lampiran 1) dan isolat mikroalga dalam botol volume 500 ml, dengan perbandingan secara berurutan SAP: media BG 11: mikroalga = 346,4 ml: 3,6 ml: 50 ml. Selanjutnya diberi aerasi dan pencahayaan 5000 lux selama 16-21 harisampai mencapai Optical Density (OD) diatas 1 untuk mendapatkan mikroalga yang jumlahnya sesuai dengan kebutuhan penelitian.
Gambar 1 Diagram alir penelitian 2. Verifikasi Lipid Mikroalga
Mikroalga yang dapat dijadikan sebagai bahan baku biodiesel harus diketahui memiliki kandungan lipid. Pengujian ada tidaknya lipid dilakukan dengan menggunakan larutan nile red (NR) (Cooksey et al. 1987). Larutan stok NR berupa 1 mg NR yang dilarutkan dalam 1 ml aceton. Isolat mikroalga sebanyak 1 ml ditetesi larutan stok NR sebanyak 10 µl dan dibiarkan selama 20-30 menit. Pengamatan dilakukan dengan menggunakan mikroskop fluorescence
Media optimum Isolat mikroalga
Peremajaan isolat mikroalga Identifikasi
Percobaan media tumbuh 1. Identifikasi lipid
Pengamatan parameter : 1. Pertumbuhan
2. Bobot kering biomassa 3. Bobot kering lipid 4. Kandungan pati 5. Kandungan protein 2. Identifikasi morfologi
3. Identifikasi molekuler
4. Sekuensing DNA
5. Analisis bioinformatika (BLAST)
dengan filter biru pada panjang gelombang 450-490 nm. Jika sel mikroalga berpendar warna kuning maka mikroalga tersebut mengandung lipid netral sebagai bahan baku biodiesel.
3. Identifikasi Mikroalga 3.1 Identifikasi Morfologi
Identifikasi morfologi isolat mikroalga dilakukan dengan pengamatan menggunakan mikroskop cahaya dengan beracuan pada buku identifikasi yang berjudul “The Freshwater Algae“ (Prescot 1978) dan buku “Introduction to the
Algae Structure and Reproduction second edition” (Bold & Wyne 1985).
3.2 Identifikasi Molekuler Isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan dengan metode Sambrook et al. (1989) yang telah dimodifikasi yaitu dengan menyiapkan 500 µl isolat mikroalga ke dalam tabung eppendorf ukuran 2 ml steril lalu disentrifus dengan kecepatan 13000 rpm selama 5 menit. Pelet yang dihasilkan dipindahkan ke tabung baru dan ditambah 650 µl buffer lysis SDS. Bahan yang sudah disiapkan disentrifus dengan kecepatan 13000 rpm selama 15 menit. Supernatan diambil dan ditambah dengan 1 volume FCIAA (25:24:1), kemudian dicampur dengan cara dibolak-balik selama 5 menit dengan perlahan. Langkah selanjutnya larutan disentrifus dengan kecepatan 13000 rpm selama 10 menit. Hasilnya ditambahkan lagi dengan 1 volume CIAA (24:1) dan dicampur lagi dengan dibolak-balik selama 5 menit, kemudian disentrifus dengan kecepatan 13000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang dihasilkan dipindahkan ke dalam eppendorf baru ukuran 1,5 ml steril lalu ditambahkan dengan 1 volume isopropanol dan dicampur perlahan selama 5 menit kemudian disentrifus dengan kecepatan 13000 rpm selama 10 menit.
Pelet DNA yang diperoleh ditambah dengan etanol 70%, dicampur dengan dibolak-balik dan disentrifus lagi dengan kecepatan 4000 rpm selama 1 menit. Selanjutnya pelet dipisahkan dari supernatan dan diinkubasi dalam suhu 37°C. Setelah kering ditambahkan dengan TE (50 µl) dan disimpan dalam suhu 4°C.
Pengecekan ada tidaknya DNA dilakukan dengan elektroforesis menggunakan gel agarose 1% dalam buffer Tris-Borate-EDTA (TBE), dengan daya 65 volt selama 1 jam. Hasil elektroforesis diamati dengan penyinaran lampu UV.
Pemilihan Primer
Penentuan primer untuk amplifikasi harus disiapkan sesuai dengan tujuan penelitian. Persiapan untuk tahapan amplifikasi DNA dimulai dengan pengecekan primer yang akan digunakan untuk meminimalisir kemungkinan terjadinya kesalahan dalam melakukan identifikasi molekuler. Primer yang digunakan adalah pasangan primer forward SR1 dan SR4, primer reverse SR5 dan SR9 yang dikombinasi seperti pada Tabel 4 yang dikembangkan dari sekuen gen 18S rDNA dari organisme eukariotik (Harada et al. 2007). Posisi primer forward-reverse yang digunakan pada DNA cetakan ditunjukkan pada Gambar 2 .
Tabel 4 Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen 18S rDNA mikroalga (Harada et al. 2007)
Fragmen Primer Posisi basa Hasil yang diharapkan 1 SR1( Forward) 5’-TACCTGGTTGATCCTGCCAG-3’ 1–10 SR5(Reverse) 5’-ACTACGAGCTTTTTAACTGC-3’ 630–611 600 bp 2 SR4(Forward) 5’-AGGGCAAGTCTGGTGCCAG-3’ 548–566 SR9( Reverse) 5’AACTAAGAACGGCCATGCAC-3’ 1286–1267 750 bp
Gambar 2 Posisi primer forward-reverse gabungan menggunakan primer SR1-SR5 dan primer SR4-SR9 dan perkiraan hasil PCR yang diharapkan. Amplifikasi PCR
Amplifikasi gen 18S rDNA dari isolat mikroalga untuk 50 µl reaksi mengandung 0,5 µl Taq Polimerase 0.5v; 5 µlbuffer PCR (10x);1 µl Primer
Forward 10 µM;1 µl Primer Reverse10 µM; 2,5 µl dNTPs 2 mM; 37,5 µl
aqudestilata steril; 2,5 µl DNA template (DNA cetakan). Amplifikasi gen 18S rDNA dilakukan dengan PCR menggunakan kondisi PCR sebagai berikut: pra
denaturasi 94oC selama 3 menit, kemudian dilanjutkan dengan denaturasi 94oC selama 1 menit, annealing 55oC selama 1 menit, elongasi 72oC selama 2 menit sebanyak 35 siklus, dan diakhiri dengan final extention 72oC selama 10 menit, dan pasca PCR 15°C selama 59 menit. Setelah dilakukan amplifikasi dilanjutkan pengecekan hasil PCR dengan menggunakan elektroforesis menggunakan agarose 1% dengan daya 65 volt selama 1 jam. Hasil elektroforesis diamati menggunakan lampu UV.
Pemurnian Hasil PCR
Hasil PCR dipurifikasi mengikuti protokol Promega dengan metode sentrifus sebelum dilakukan sequensing. Tahapan purifikasi diawali dengan melakukan elektroforesis sebanyak ±50 µl dari hasil PCR pada gel agarose 1%. Pita pada gel yang terdapat DNA dipotong diatas meja lampu UV. Masing-masing potongan gel dari hasil reaksi PCR ditempatkan ke dalam satu minikolum SV tabung koleksi. Campuran gel yang mencair dipindahkan ke minikolum SV dan diinkubasi selama 1 menit pada suhu ruang. Sampel dalam rakitan minikolum
Produk 600 bp
Produk 750 bp
SR1 SR5
SV disentrifus dalam mikrosentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit. Minikolom SV dipindahkan dari rakitan kolom putar dan cairan dikeluarkan dari tabung koleksi. Minikolom dalam tabung koleksi dicuci dengan menambahkan 700 µl larutan pencuci membran yang sebelumnya dilarutkan dengan etanol 95%.
Cairan dalam rakitan minikolom SV disentrifus dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit. Pencucian diulangi dengan 500 µl larutan pencuci membran dan disentrifusi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit. Rakitan minikolom SV dari sentrifus dipindahkan secara hati-hati. Tabung koleksi dikosongkan dan dilakukan sentrifus ulang dari kolom rakitan selama 1 menit dengan mikrosentrifus yang tutupnya terbuka agar residu etanol terevaporasi sebanyak-banyaknya. Selanjutnya minikolom SV dipindahkan secara hati-hati ke tabung mikrosentrifus 1,5 ml. Air bebas ion-nuklease sebanyak 50 µl ditambahkan pada minikolom SV secara langsung ke tengah kolom tanpa menyentuh membran dengan ujung pipet dan diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit. Minikolom SV tersebut disentrifus dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit dan tabung mikrosentrifus yang mengandung DNA disimpan pada suhu 4°C atau -20°C. Pengecekan hasil purifikasi dilakukan dengan elektroforesis menggunakan agarose 1% dengan daya 65 volt selama 1 jam. Hasil elektroforesis diamati menggunakan lampu UV.
Sekuensing DNA
Hasil pemurnian disekuen dengan metode Sanger menggunakan alat ABI 3730XL (Sambrook et al. 1989). Data yang diperoleh digunakan untuk analisis bioinformatika (BLAST) berdasarkan aksesi data base dari Bank Gen (http: // www.ncbi.nlm.nih.gov [10 Juli 2011]).
4. Perlakuan Media Tumbuh 4.1. Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan percobaan faktorial dengan dua faktor yaitu faktor pertama komposisi air untuk media yang terdiri dari lima taraf yaitu aquades:SAP dengan perbandingan 1:0, 0:1, 1:1, 2:1, dan 1:2 (v/v). Faktor kedua
konsentrasi P yang terdiri dari tiga taraf yaitu 40, 80 dan 120 ppm. Masing-masingkombinasi perlakuan dilakukan tiga ulangan, sehingga secara keseluruhan ada 45 satuan percobaan. Percobaan disusun berdasarkan rancangan acak kelompok (RAK).
4.2. Persiapan Media Tumbuh
Isolat mikroalga ditumbuhkan pada media BG 11 (Lampiran 1) yang mengandung berbagai macam hara makro dan hara mikro yang dibutuhkan oleh mikroalga. Pembuatan stok bahan berupa K2HPO4, NaNO3,MgSO4.7H2O, CaCl2.2H2O,Citric Acid,Fe- Amonium Citrat, Na2EDTA,Na2CO3, trace element untuk pembuatan media BG11 (komposisi pada Lampiran 1) disiapkan dengan menggunakan botol yang berbeda untuk masing-masing bahan dalam keadaan steril. Persiapan media untuk perlakuan harus dilakukan dalam keadaan segar (dibuat segera sebelum dipakai). Tahapan perlakuan untuk unsur P menggunakan K2HPO4sebagai sumber P dari media BG 11 diberikan bervariasi dengan konsentrasi P 40, 80 dan 120 ppm sesuai dengan perlakuan yang akan diberikan sebanyak 1 ml untuk 1 liter air media.
4.3. Pelaksanaan Penelitian
Botol media ukuran 500 ml yang steril diisi dengan air media yang berbeda sesuai dengan perlakuan air media yang akan diberikan dengan perbandingan secara berurutan air media: media BG11, yaitu 346,4 ml: 3,6 mldan dilakukan dalam ruang laminar. Masing-masing botol media diberi media BG 11 yang sudah disiapkan dalam keadaan segar sebanyak 1 ml dalam 1 l air media untuk setiap stok bahan. Media BG 11 yang dipakai mengandung N 0,5 M dan konsentrasi P 40, 80 dan 120 ppm. Botol media yang telah siap segera diisi dengan isolat mikroalga yang telah memiliki Optical density (OD) >1 sebanyak 50 ml dan ditutup dengan penutup botol yang telah dimodifikasi dalam kondisi steril, lalu diberi selang aerator dan lubang pengeluaran udara.
Penempatan botol dilakukan dalam rak yang dilengkapi lampu TL yang mempunyai intensitas cahaya 70 µmol foton (m2)-1 detik-1 (5000 lux) dengan rentangan suhu 24-28°C, penyinaran dilakukan selama 24 jam hari-1, dan rak
ditutup dengan kain hitam untuk mengurangi pengaruh dari lingkungan luar (Gambar 3). Pengamatan dilakukan selama 16 hari.
Gambar 3 Denah percobaan dalam penempatan botol perlakuan berupa komposisiair media (A1) aquades: SAP (1:0)(v/v),
(A2) Aquades:SAP (0:1)(v/v) (A3) aquades:SAP (1:1)(v/v), (A4) aquades:SAP (1:2)(v/v), (A5) aquades:SAP (2:1)(v/v) dan (P1) konsentrasi P 40 ppm, (P2) konsentrasi P 80 ppm, (P3) konsentrasi P 120 ppm.
4.4 Peubah yang diamati Pertumbuhan
Pengukuran pertumbuhan sel mikroalga dilakukan dengan mengukur OD kultur mikroalga yang dilakukan setiap 2 hari sekali selama 16 hari pengamatan. OD diukur dengan cara sampel tiap perlakuan diambil sebanyak 8 ml dan dilakukan pengukuran dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 680 nm (Lee et al. 1998).
Biomassa
Pengukuran bobot basah dan bobot kering dilakukan pada hari ke-16. Pengukuran dilakukan dengan cara mengambil 100 ml kultur mikroalga, kemudian disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit dan diambil peletnya sebagai bobot basah. Selanjutnya pelet di oven pada suhu 80°C selama 24 jam. Biomassa yang telah kering kemudian ditimbang sebagai bobot kering. Kandungan Lipid
Pengukuran kandungan lipid dilakukan pada hari ke-16 dengan proses ekstraksi. Lipid mikroalga diukur dengan mengikuti metode yang dilakukan oleh
Bligh dan Dyer (1959) yang telah dimodifikasi dalam hal kecepatan sentrifus diubah menjadi 3000 rpm selama 10 menit. Metode ini menggunakan pelarut metanol dan kloroform. Pengujian kandungan lipid mikroalga dilakukan dengan cara biomassa mikroalga yang telah kering ditambah dengan 2 ml air murni, 5 ml metanol dan 2,5 ml kloroform, selanjutnya digoyang dengan shaker selama 1 malam. Setelah selesai ditambah kembali dengan 2,5 ml air murni dan 2,5 ml kloroform.
Tahap berikutnya larutan disentrifus kembali pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit dan diambil endapan lipid (pelet) dan diletakkan di dalam tabung reaksi, kemudian dipanaskan pada waterbath suhu 200°C untuk menghilangkan campuran larutan kimia yang ditambahkan sebelumnya. Kandungan lipid mikroalga yang sudah ditumbuhkan pada medium yang sesuai dianalisa dengan rumus yang digunakan oleh Weldy dan Huesemann (2007) sehingga didapatkan berat lipid. Perhitungan % total lipid mikroalga adalah:
%
Keterangan : Lw = Bobot lipid (g)
Bw = Bobot kering mikroalga (g)
Produktivitas lipid mikroalga dihitung menggunakan rumus
/ /
Kandungan Pati
Kandungan pati diukur berdasarkan kandungan gula total mengikuti metode Cleg-Anthrone (Apriyantono et al. 1989) dengan cara 1 g sampel kering atau 2,5 g sampel basah ditambahkan 10 ml air dan dilarutkan dengan 13 ml asam perklorat 52%. Hasil yang diperoleh diencerkan menjadi 100 ml lalu dilakukan penyaringan. Ekstrak yang dihasilkan diencerkan lagi sampai volume 250 ml. Ekstrak tadi diambil 10 ml dan diencerkan dengan air menjadi volume 100 ml larutan. Sebanyak 1 ml larutan tersebut dimasukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi dan ditambah 5 ml pereaksi Anthrone dengan cepat. Setelah itu dipanaskan dalam penangas air 100°C selama 12 menit. Pengukuran
absorbansinya pada panjang gelombang 630 nm. Hasilnya dibandingkan dengan larutan standar glukosa pada konsentrasi 10, 20, 40, 60, 80, dan 100 ppm. Kandungan pati dapat dihitung dengan rumus dari Goni et al. (1997) sebagai berikut
Kandungan pati = kandungan gula 0,9 Kandungan Protein
Metode yang digunakan untuk menetapkan kandungan protein adalah metode Biuret (Apriyantono et al. 1989) yang telah dimodifikasi. Pengujian ini dilakukan dengan cara menyiapkan sampel dengan volume total masing-masing 1 ml pada tabung corning ukuran 15 ml. Ke dalam masing-masing tabung corning tersebut ditambahkan 1 ml Trichloro-acetic acid (TCA) 10% sehingga protein akan terdenaturasi. Selanjutnya tabung disentrifus pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit sampai protein yang terdenaturasi mengendap dan supernatan dibuang dengan cara dekantasi. Ke dalam endapan ditambah dengan 2 ml etil eter dan dicampur merata lalu disentrifus kembali dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit untuk menghilangkan residu TCA.
Sampel yang sudah siap dibiarkan kering pada suhu kamar dalam ruang asam. Ke dalam endapan kering ditambahkan 4 ml air dan dicampur merata. Pada saat dilakukan pengukuran protein ditambahkan 6 ml pereaksi biuret. Setelah itu diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm. Hasil absorbansinya dibandingkan dengan nilai absorban dengan larutan BSA pada konsentrasi 0, 20, 40, 60, 80, 100 ppm.
4. Analisis data
Data yang diperoleh dianalisis dengan analisis sidik ragam pada tingkat kepercayaan 95% menggunakan program SPSS (Statistical Product Service Solution) dan dilanjutkan dengan uji DMRT (Duncan Multiple Range Test).