1. Identifikasi Mikroalga
Penentuan keseragaman jenis merupakan tahap awal yang harus dilakukan pada mikroalga yang akan dijadikan sebagai bahan baku biodiesel untuk memastikan bahwa isolat yang digunakan benar-benar jenis yang diharapkan dan dalam kultur yang dibiakkan terdapat satu jenis mikroalga (monokultur). Akan tetapi pengamatan yang dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000 x menunjukkan bahwa kultur sel-sel isolat mikroalga mengalami kontaminasi, sehingga di dalam kultur ditemukan beberapa jenis mikroalga (Gambar 4B). Adapun pengecekan kandungan lipid menunjukkan isolat mikroalga berpendar merah kekuningan yang berarti isolat mikroalga mengandung lipid polar dan lipid netral (Gambar 4A).
(A) (B) Gambar 4 (A) Pengamatan hasil verifikasi lipid dengan mikroskop fluorescence.
(B) Pengamatan morfologi isolat mikroalga dengan mikroskop
cahaya.
Identifikasi secara morfologi dari jenis mikroalga yang dominan menunjukkan isolat mikroalga membentuk koloni yang tersusun atas 2, 4, 8 sel atau kelipatannya dan berbentuk seperti bola kubus, sel dilindungi oleh adanya lapisan musilagenus yang melapisi setiap sel seperti amplop, warna selnya biru kehijauan (Gambar 4B) diduga termasuk dalam genus Chroococcus sp. dan dikelompokkan dalam divisi Cyanophyta, sedangkan golongan yang lain termasuk
spesies dari Chlorophyta.Warna isolat yang mengalami perlakuan berbagai air media dan konsentrasi P mulai hari ke-0 sampai hari ke-16 cenderung memiliki warna yang sama yaitu berwarna hijau (Lampiran 2), tetapi berbeda nilai OD-nya. Identifikasi secara morfologi hanya berhasil sampai pada tingkat genus untuk jenis yang dominan dalam kultur.
Identifikasi molekuler dilakukan untuk mendukung identifikasi secara morfologi. Pengecekan fragmen hasil isolasi DNA mikroalga (Gambar 5) melalui elektroforesis menunjukkan hasil yang bagus dan terlihat adanya pita DNA yang tajam, jelas dan tidak terdegradasi dengan ukuran sesuai dengan yang diharapkan.
Gambar 5 Hasil isolasi DNA (1,2) pita DNA isolat mikroalga (3) marka molekuler yang digunakan 1 kb DNA Ladder.
Pengecekan hasil PCR melalui elektroforesis menunjukkan panjang produk PCR sesuai dengan yang diharapkan yaitu 600 bp untuk fragmen 1 yang menggunakan primer SR1-SR5 dan 750 bp untuk fragmen 2 dengan primer SR4-SR9 (Gambar 6). Tahap selanjutnya adalah purifikasi fragmen DNA hasil amplifikasi PCR menggunakan protokol yang tersedia pada kit (Promega, USA) untuk mendapatkan DNA secara murni untuk dilakukan sekuensing dan analisis BLAST pada database Bank gen.
- 1 - 10 - 2 - 3 - 0,5 - 1,5 2 1 3 kb
Gambar 6 Hasil Amplifikasi DNA (PCR) gen 18S rDNA (1) pita DNA yang dihasilkan menggunakan primer forward-reverse SR1-SR5 dengan panjang produk 600 bp (2) marker yang digunakan 1000 bp DNA Ladder (3) pita yang dihasilkan dengan menggunakan primer
forward-reverse SR4-SR9 dengan panjang produk 750 bp.
Hasil sekuen gen 18S rDNA dari fargmen 1 dan fragmen 2 yang diperoleh dengan menggunakan primer forward-reverse SR1-SR5 dan SR4-SR9 disajikan pada Gambar 7. Berdasarkan hasil analisis sekuen gen 18S rDNA dengan menggunakan program BLAST terhadap sekuen DNA menunjukkan bahwa 50% dari sekuen DNA mikroalga mempunyai kemiripan (similaritas) 84% (E value 0,0 dan skor maksimum 645) dengan sekuen DNA aksesi Uncultured freshwater
eukaryote clone LG11-03 18S ribosomal RNA gene (AY919722.1), sedangkan
daftar beberapa organisme yang urutan nukleotidanya mempunyai kemiripan DNA dengan isolat mikroalga dengan max identity 79-84% berdasarkan hasil analisis BLAST ditampilkan dalam Tabel 5.
750 bp 600 bp
GGACTGCTGT CTCAAGATAA GCCATGCATG TCTAAGTATA AACAATTTAT 50 ACCGGTAAAA CCGCCAAGGG CTCTATAATA CATTTATTTT TTATTTTATT 100 GCACCCACAA TTTATATAAC TGCGTAATTT CTAGAGATAA TATACGTGAA 150 AAATCCCCAG TCTTTGGAAG GGATGTATTT ATTAAATAAA AAACCAATCC 200 ATCTCTCCGT TCGCTCCTTG GTGAATCATA ATAACTTTCC GGATCAAACG 250 GCCGCGTGTC TGCTACGCTT CATTCAAATT TCTGCCCGAT CAACTTTCTA 300 TGGACGGATA GAGGCCTAAC ATCCTTTTAA CGGGCGACGG ACAATTAAGG 350 ATCGATTCCT TACAGAGAGC CTGCCAGATC AATACCACTT CCAAGGAAGG 400 AAAGTAGCCC GCACATTACC CAATCCTTAC TCACACAGGT AGTGACTATC 450 AATAACTATG CAGTCCCCGA ACAGGCCGGT GTAATTGGAA TGAGAACAAT 500 TTAAATCCCT TATCGAGGAA CAATTAGAGG GCAAGTCTGG TGCCAGCAGC 550 CGCGGTAATT CCAGCTCCAA TAGCGTATAT TAAAGTTGCT GCAGTTAAAA 600 AGCTCGTAGT TGAATTTCTG GAGCGTATAT TAAAGTTGCT GCAGTTAAAA 650 AGCTCGTAGT TGAATTTCTG GCCCGGGNCG CCTGGCCGCC CAGCGTTGGC 700 CCGTGGCGTG GAGGCTCCCT CCCGCTGTAC GACTGGGGAT CATCTTTTCC 750 GTTTGTTGGC CCGCGTCCGC CATTGTGATC TGTTAAAATT AAAAAGCGCA 800 AGCGTCGCTC TTGCGCTCTT GCTTTGAATA CATTGAAATG GTAAAACCGC 850 GCTTTACTTT CGTTTGTTTT TGAAGGTGAC AAAAAGTAAA ATAAGTTGGG 900 AGGGGGGTTG TTGGGCTGTC GGGTGTTCAG TGCTGGTCTT TGTTGACCAC 950 AAGCTGAACA GAAACCAACG CCCAGNCGGA ATCATTTCTT TAATAAAAAA 1000 GTAAAGTTAT AGGAGAGAAT AAGATAACCT CCCGCCCTTG TTCATACAAT 1050 AAGCCTTCCC ACCTGTCTTT GACTGCGGTT TGACTCTGTC TCATCTGGCG 1100 GATCTCTAGA AACTTAAGGT TCCGGGTTCC CGGGGGGTAT GGTTGGAATN 1150 CTGAAACTTT TGACAAANAC CGCCAGTCNC CCGAGNAGCG GAGCCTGTGG 1200 CCTAACTCTG ACTCACAAAA CGAAACCTCA CTCGACCACG ACACTTTTGA 1250 CATATAGAGA GGGATT 1266
Gambar 7 Hasil sekuen gen 18S rDNA isolat mikroalga yang berasal dari sumber air panas Cipanas.
Tabel 5 Daftar organisme yang mempunyai kemiripan DNA dengan isolat mikroalga berdasarkan hasil BLAST dari koleksi database Bank Gen
Accecion Description Max score Total score Query coverage E value Max indentity AY919722.1 Uncultured freshwater
eukaryote clone LG11-03 18S ribosomal RNA
gene, partial sequence 645 645 50% 0,0 84%
AJ130863.1 Unidentified eukaryote 18S ribosomal RNA,
clone LKM74, partial 636 636 50% 1,00E-178 83%
AY919786.1 Uncultured freshwater eukaryote clone LG30-03 18S ribosomal RNA
gene, partial sequence 630 630 50% 6,00E-177 83%
GQ995317.1 Uncultured
Chytridiomycota clone T5P1AeC12 18S ribosomal RNA gene,
partial sequence 531 531 50% 4,00E-147 80%
AB586075.1 Spizellomyces sp. NBRC 105423 gene for 18S ribosomal RNA, partial
sequence 524 524 50% 6,00E-145 79%
2. Pertumbuhan Mikroalga
Pertumbuhan mikroalga diukur berdasarkan nilai OD. Isolat mikroalga sampai hari ke-16 mengalami pertumbuhan berbeda pada perlakuan air media dan konsentrasi P, tetapi secara umum menghasilkan pola pertumbuhan yang sama, meliputi fase lag, fase eksponensial, dan fase stasioner. Fase lag atau adaptasi berlangsung selama hari pertama perlakuan, diikuti fase eksponensial pada semua perlakuan air media terjadi sampai hari ke-14. Selanjutnya mengalami fase stasioner (Gambar 8).
Perlakuan komposisi air media dan konsentrasi P secara tunggal berpengaruh nyata terhadap pertumbuhan mikroalga, tetapi interaksi antara kedua faktor tidak mempengaruhi secara nyata (Lampiran 5). Penggunaan komposisi air media yang mengandung SAP Cipanas pada media tumbuh mikroalga menghasilkan pertumbuhan yang lebih tinggi dibandingkan pada perlakuan air media yang mengandung aquades (Tabel 6). Komposisi air media yang mengandung aquades:SAP dengan perbandingan 1:2 (v/v) memiliki nilai rata-rata
pertumbuhan yang paling tinggi dengan nilai absorbansi yaitu 2,19. Isolat mikroalga pada media yang mengandung aquades:SAP dengan perbandingan 1:0 (v/v) memiliki nilai rata-rata pertumbuhan paling rendah dan lebih lambat peningkatan pertumbuhannya selama fase kriptik pada hari ke-10 sampai harike-14, sehingga lebih cepat mengalami fase kematian dibandingkan dengan perlakuan yang lain (Gambar 8).
Tabel 6 Rata-rata OD pada hari ke-16 pada komposisi air media yang berbeda Air media Rata-rata OD
Aquades:SAP (1:0) 1,83a Aquades:SAP (0:1) 2,17b Aquades:SAP (1:1) 2,16b Aquades:SAP (2:1) 2,11ab Aquades:SAP (1:2) 2,19b
Keterangan : Nilai rata-rata pada kolom yang sama yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf 0,05 berdasarkan uji DMRT.
Gambar 8 Pola pertumbuhan isolat mikroalga pada komposisi air media yang berbeda aquades:SAP (1:0)(v/v) ( ), aquades:SAP (0:1) (v/v)( ), aquades:SAP (1:1) (v/v) ( ), aquades:SAP (2:1) (v/v) ( ), aquades:SAP (1:2) (v/v)( ). 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 N ilai O D p ada λ 680 nm Pertumbuhan (hari)
Perlakuan konsentrasi P yang semakin tinggi menyebabkan peningkatan pertumbuhan isolat mikroalga (Tabel 7). Hasil yang diperoleh terlihat bahwa konsentrasi P 120 ppm menunjukkan rata-rata pertumbuhan isolat mikroalga paling tinggi(2,21) bila dibandingkan dengan perlakuan konsentrasi P 40 ppm dan P 80 ppm sampai pada hari ke-14. Selanjutnya pertumbuhan isolat mikroalga pada semua perlakuan mulai mengalami penurunan pertumbuhan yang menandakan awal fase stasioner (Gambar 9).
Tabel 7 Rata-rata OD isolat mikroalga pada hari ke-16 pada tiga tingkat konsentrasi P (ppm)berbeda
Konsentrasi P Rata-rata OD
40 1,95a 80 2,11ab 120 2,21b
Keterangan: Nilai rata-rata pada kolom yang sama yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf 0,05 berdasarkan uji DMRT.
Gambar 9 Pola pertumbuhan isolat mikroalga pada berbagai konsentrasi P 40 ppm ( ), 80 ppm ( ), 120 ppm ( ). 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Ni lai OD pad a λ 680 nm Pertumbuhan (hari)
3. Biomassa Mikroalga
Biomassa diukur berdasarkan bobot kering biomassa mikroalga untuk menentukan kandungan lipid yang dihasilkan. Interaksi antara komposisi media dan konsentrasi P mempengaruhi secara nyata bobot kering biomassa isolat (Tabel 8). Rata-rata bobot kering biomassa yang tertinggi (175 mg dalam 100 ml isolat mikroalga) diperoleh pada media tumbuh dengan komposisi aquades:SAP dengan perbandingan 1:0 (v/v) dan konsentrasi P 120 ppm.
Tabel 8 Pengaruh interaksi antara komposisi air media dengan konsentrasi P (ppm)terhadap bobot kering biomassa (mg)isolat mikroalga
Interaksi Aquades:SAP
(1:0) (0:1) (1:1) (2:1) (1:2) Konsentrasi P 40 135ab 153ab 133a 137ab 157ab 80 171ab 1406ab 170ab 171ab 132a
120 175b 165ab 140ab 155ab 167ab
Keterangan: Nilai rata-rata pada kolom dan baris yang sama yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf 0,05 berdasarkan uji DMRT.
4. Kandungan dan Produktivitas Lipid Mikroalga
Komposisi air media, konsentrasi P yang ditambahkan dan interaksi keduanya tidak mempengaruhi secara nyata kandungan lipid dan produktivitas lipid mikroalga pada pengamatan hari ke-16. Namun demikian, media tumbuh dengan komposisi air media aquades:SAP dengan perbandingan 1:0 (v/v) dan konsentrasi P 40 ppm cenderung menghasilkan rata-rata bobot kering lipid tertinggi (28 mg dalam 100 ml isolat mikroalga) yang disajikan pada Tabel 9, kandungan lipid tertinggi, yaitu sebesar 21% (Tabel 10), dan produktivitas lipid tertinggi, yaitu sebesar 17mg l-1hari-1 (Tabel 11).
Tabel 9 Bobot kering lipid (mg) isolat mikroalga pada berbagai komposisi air media dan konsentrasi P (ppm)
Komposisi air media 40 Konsentrasi P 80 120
Aquades:SAP (1:0) 28 21 20
Aquades:SAP (0:1) 22 21 18
Aquades:SAP (1:1) 14 23 18
Aquades:SAP (2:1) 25 18 20
Aquades:SAP (1:2) 16 14 24
Tabel 10 Kandungan lipid (%) isolat mikroalga pada berbagai komposisi air media dengan konsentrasi P (ppm)
Komposisi air media Konsentrasi P
40 80 120 Aquades:SAP (1:0) 21 12 12 Aquades:SAP (0:1) 14 18 11 Aquades:SAP (1:1) 10 15 14 Aquades:SAP (2:1) 19 11 13 Aquades:SAP (1:2) 10 10 14
Tabel 11 Produktivitas lipid (mgl-1 hari-1) isolat mikroalga pada berbagai komposisi air media dengan konsentrasi P (ppm)
Komposisi air media 40 Konsentrasi P 80 120
Aquades:SAP (1:0) 17 13 13
Aquades:SAP (0:1) 14 13 11
Aquades:SAP (1:1) 9 14 11
Aquades:SAP (2:1) 16 11 13
Aquades:SAP (1:2) 10 8 15
5. Kandungan Pati Mikroalga
Pada hari ke-16 perlakuan konsentrasi P yang berbeda dalam media tumbuh mempengaruhi kandungan pati isolat mikroalga, sedangkan perlakuan komposisi air media dan interaksi antara komposisi air media dan konsentrasi P
tidak mempengaruhi kandungan pati isolat mikroalga. Kandungan pati isolat mikroalga pada media dengan konsentrasi P 120 ppm lebih tinggi daripada kandungan pati mikroalga pada media dengan konsentrasi P 80 dan 40 ppm (Tabel 12).
Tabel 12 Kandungan pati (mg ml-1) pada isolat mikroalga pada tiga konsentrasi P (ppm) yang berbeda
Keterangan: Nilai rata-rata pada kolom yang sama yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf 0,05 berdasarkan uji DMRT.
6. Kandungan Protein Mikroalga
Komposisi air media yang berbeda mempengaruhi kandungan protein isolat mikroalga, sedangkan konsentrasi P dan interaksi antara komposisi air media dan konsentrasi P tidak mempengaruhi kandungan protein mikroalga. Rata-rata kandungan protein tertinggi (0,73 mg ml-1) dihasilkan isolat mikroalga yang ditumbuhkan pada media yang mengandung aquades:SAP dengan perbandingan 2:1 (v/v),meskipun nilai ini tidak berbeda nyata dari perlakuan media dengan komposisi SAP yang lain. Semua isolat mikroalga yang diberi perlakuan komposisi air media yang mengandung SAP cenderung memiliki kandungan protein lebih tinggi dibandingkan dengan media yang hanya berupa aquades (Tabel 13).
Tabel 13 Kandungan protein (mg ml-1)isolat mikroalga pada komposisi air media berbeda
Komposisi air media Rata-rata protein Aquades:SAP (1:0) 0,51a Aquades:SAP (0:1) 0,72b Aquades:SAP (1:1) 0,71b Aquades:SAP (2:1) 0,73b Aquades:SAP (1:2) 0,72b
Keterangan: Nilai rata-rata pada kolom yang sama yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf 0,05 berdasarkan uji DMRT.
Konsentrasi P Rata-rata kandungan pati
40 0,03a 80 0,03a 120 0,06b
Pembahasan
Isolat mikroalga koleksi Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Departemen Biologi FMIPA IPB berpendar dengan warna merah kekuningan dibawah mikroskop flourescence. Menurut Matsumoto et al. (2010) dan Elumalai et al. (2011) warna merah menunjukkan adanya lipid polar atau klorofil dan warna kuning menunjukkan adanya lipid netral yang mengandung hidrokarbon dan triasilgliserol pada isolat mikroalga. Lipid netral yang dikandung biomassa mikroalga merupakan bahan dasar biodiesel (Matsumoto et al.2010). Hal ini menunjukkan bahwa isolat mikroalga ini memiliki kandungan lipid yang dapat dijadikan bahan baku biodiesel.
Kultur mikroalga yang digunakan dalam penelitian ini masih mengandung beberapa jenis mikroalga yang hidup dalam kultur peremajaan, yang berarti kultur yang digunakan belum monokultur. Penentuan nama jenis mikroalga berdasarkan hasil pengamatan mikroskop cahaya memiliki tingkat kesulitan yang tinggi dalam melakukan identifikasi secara tepatkarena mikroalga memiliki plastisitas yang tinggi yang dipengaruhi oleh kondisi lingkungan hidupnya. Pada kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan akan memiliki bentuk yang berbeda dengan pada kondisi lingkungan yang normal. Identifikasi morfologi memiliki kelemahan yaitu hasil pengamatan dapat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan (Umayah & Purwantara 2006).
Adapun mikroalga yang dominan memiliki ciri-ciri yaitu berwarna hijau kebiruan, koloni berbentuk seperti bola (spherical), mempunyai dinding sel yang dilindungi oleh lapisan polisakarida dalam bentuk musilagenus yang menghubungkan bagian dasar dari koloni. Sel yang dilindungi oleh musilagenous yang melingkupi sekitar sel dan biasanya menyalin bentuk sel. Setiap sel biasanya membelah diri berbentuk seperti setengah bola dengan jumlah sel ganda 2, 4, 8 dan seterusnya dan tetap dalam bentuk koloni, sehingga berbentuk kubus.Identifikasi morfologi isolat mikroalga yang dominan berdasarkan buku
The Freshwater Algae (Prescot 1978) dan buku Introduction to the AlgaeStructure and Reproduction. second edition (Bold & Wyne 1985) menunjukkan kesamaan
ciri-ciri yang dimiliki Chroococcus sp. golongan Cyanophyta (prokariot) yang didalam selnya terdapat klorofil a, karoten dan xantofil (pada umumnya tidak
dalam bentuk fikoeritrin, fikosianin) dan terdapat vakuola semu yang disebut gelembung udara (Prescott 1978). Selain itu terdapat jenis mikroalga yang tidak dominan dan diduga memiliki kemiripan dengan golongan Chlorophyta.
Bold dan Wyne (1985) menuliskan dalam bukunya bahwa pada umumnya Cyanophyta mendominasi habitat yang mempunyai rentangan pH netral. Media tumbuh dalam penelitian ini setelah diberikan media BG 11 memiliki pH sekitar 7-8. Aquades yang digunakan mempunyai pH sekitar 6, sedangkan pH air sumber air panas Cipanas sekitar 7,6. Isolat ini dalam penelitian Gunawan (2010) ditemukan pada sumber air panas Cipanas, Ciater, Gunung Pancar dan Ciwalini yang habitat asalnya memiliki pH dan suhu yang berbeda. Namun dalam kondisi laboratorium ternyata Chroococcus sp. mendominasi semua air yang berasal dari keempat sumber air panas tersebut.
Dalam identifikasi molekuler, isolasi DNA dan pemilihan primer yang benarserta prosedur amplifikasi fragmen target yang benar dan akurat perlu diperhatikan untuk meminimalkan kemungkinan kesalahan dalam mendapatkan sekuen DNA yang diharapkan. Isolasi DNA dilakukan untuk mendapatkan DNA yang murni, sehingga dapat diamplifikasi dengan baik. Akan tetapi untuk mendapatkan DNA yang murni perlu dilakukan tehnik isolasi yang tepat.
Beberapa masalah timbul pada saat isolasi DNA.Pertama, isolat mikroalga terkontaminasi dengan organisme lain yang dapat mengganggu dalam mendapatkan DNA yang diharapkan. Hal ini dapat diatasi dengan menyediakan isolat mikroalga yang berasal dari kultur yang steril dan monokultur. Kultur yang steril dan monokultur diharapkan bebas dari organisme yang lain seperti jenis mikroalga lain, rotifera, protozoa dan fungi yang eukariotik.
Masalah kedua adalah adanya senyawa polifenol dan polisakarida yang tinggi dari isolat mikroalga. Adanya polifenol dan polisakarida yang tinggi mempengaruhi kemurnian DNA dan juga mempengaruhi enzim-enzim yang digunakan dalam teknik molekuler seperti polymerase dan ligase (Barnwell et al. 1998). Isolat mikroalga yang digunakan dalam penelitian ini mempunyai lapisan musilagenus yang mengandung polisakarida yang tinggi. Isolasi DNA pada tanaman yang banyak mengandung polisakarida dan senyawa polifenol umumnya menggunakan CTAB (Ardiana 2009). Perlakuan konsentrasi CTAB berfungsi
untuk proses lisis dinding sel. Oleh karena itu dalam pelaksanaaan isolasi DNA dari sampel pada organisme yang memiliki musilagenus seharusnya menggunakan konsentrasi CTAB bertingkat seperti yang dilakukan oleh Barnwell et al. (1998). Penggunaan CTAB bertingkat dilakukan untuk melisis dinding sel mikroalga secara bertahap, sehingga didapatkan DNA murni yang bebas dari polisakarida dan senyawa polifenol.
Hasil analisis BLAST dari sekuen DNA mikroalga menunjukkan 50% dari sekuen DNA mikroalga pada penelitian ini mempunyai kemiripan 84% dengan aksesi AY919722.1 Uncultured freshwater eukaryote clone LG11-03 18S
ribosomal RNA gene. Aksesi AY919722.1 merupakan golongan eukariotik yang
ditemukan dalam danau air tawar dan belum teridentifikasi nama jenisnya. Oleh karena isolat mikroalga yang digunakan dalam penelitian ini merupakan isolat lokal Indonesia, sementara data dalam database umumnya berupa mikroalga yang berasal dari luar negeri, maka belum dimungkinkan untuk memberi nama spesies pada mikroalga yang ditemukan pada sumber air panas Cipanas dan untuk itu perlu dikaji lebih lanjut.
Tahap peremajaan isolat mikroalga dilakukan untuk mendapatkan mikroalga dalam jumlah yang sesuai dengan kebutuhan dan siap diberi perlakuan, karena isolat ini awalnya dalam kondisi dorman selama dalam laboratorium. Peremajaan dilakukan pada volume 50, 100, 200sampai 400 ml masing-masing selama 3 minggu sampai isolat mencapai OD >1 untuk mendapatkan isolat yang aktif tumbuh. Pengambilan bahan penelitian dilakukan pada saat isolat mengalami fase eksponensial yaitu dalam keadaan aktif tumbuh, sehingga fase lag atau adaptasi cepat terjadi (Isnansetyo & Kurniastuty 1995). Hasil yang diperoleh pada komposisi air media yang berbeda mempunyai laju pertumbuhan yang berbeda. Hal ini berarti dengan komposisi air media yang berbeda dalam media tumbuh dapat mempengaruhi pertumbuhan sel mikroalga (P<0,05).
Pola pertumbuhan mikroalga pada umumnya meliputi 3 fase pertumbuhan yaitu fase lag, fase log atau eksponensial, dan fase stasioner (Pelczar & Chan 1986). Pola pertumbuhan pada fase lag atau adaptasi berlangsung sangat cepat. Isolat ini yang berada dalam fase eksponensial menunjukkan isolat mikroalga
mampu tumbuh dengan cepat pada media baru yang berbeda dengan media peremajaan.
Pada kondisi media tumbuh yang terbatas mikroalga seperti halnya tumbuhan hijau masih mampu melakukan fotosintesis dan respirasi seluler untuk menghasilkan energi yang dibutuhkan dalam berbagai proses antara lain proses metabolisme untuk mempertahankan hidupnya. Akan tetapi hasil proses metabolisme yang terjadi pada kondisi kurang menguntungkan berbeda dengan pada kondisi lingkungan optimum karena media baru memiliki kandungan nutrien yang berbeda dengan media sebelumnya sehingga mempengaruhi metabolisme mikroalga (Pelczar & Chan 1986).
Komposisi air media yang mengandung air yang berasal dari SAP mempunyai kecenderungan meningkatkan pertumbuhan yang lebih tinggi dibandingkan air media berupa aquades. Kondisi diatas menunjukkan bahwa air media yang mengandung SAP memiliki kandungan nutrisi baik hara makro maupun hara mikro yang lebih baik dibandingkan dengan media tumbuh yang hanya mengandung aquades. Media tumbuh yang banyak mengandung nutrien dan memiliki pH yang sesuai kebutuhan dalam proses fisiologi isolat mikroalga akan memberikan peluang bagi sel-sel isolat untuk tumbuh dan berkembang dengan cepat (Suantika & Hendrawandi 2009).
Air media berupa aquades dapat digunakan untuk air media isolat mikroalga, tetapi menghasilkan rata-rata pertumbuhan paling rendah dan fase kriptik pada hari ke-10 lebih lama dibandingkan dengan perlakuan komposisi air media yang mengandung aquades:SAP dengan perbandingan 1:2 (v/v). Hal ini karena konsentrasi hara makro dan hara mikro yang terdapat dalam air media berupa aquades tidak cukup untuk pertumbuhan isolat mikroalga. Akibatnya banyak sel yang mati dan mengalami lisis.Sel yang lisis dapat menjadi nutrisi baru bagi isolat. Pola pertumbuhan isolat mikroalga pada media tumbuh yang berupa aquades menghasilkan fase stasioner lebih cepat, sehingga lebih cepat menuju fase kematian bila dibandingkan dengan komposisi air media yang mengandung SAP. Pada awal fase ini terjadi pengurangan pertumbuhan, dimana penambahan jumlah individu mulai berkurang atau menurun yang disebabkan oleh berkurangnya
sumber nutrisi di dalam media, sehingga tidak seimbang dengan jumlah mikroalga yang membutuhkan nutrisi untuk tumbuh dan berkembang.
Perlakuan berbagai komposisi air media tidak mempengaruhi kandungan lipid dan produktivitas lipid. Lipid merupakan cadangan yang penting bagi organisme yang berada dalam lingkungan yang kurang mengguntungkan untuk pertahanan diri (Taiz & Zeiger 2002). Hal ini mengindikasikan bahwa dalam kultivasi mikroalga untuk mendapatkan kandungan lipid dan produktivitas lipid yang relatif tinggi dapat digunakan komposisi air media berupa aquades saja. Penggunaan aquades dapat mengurangi biaya produksi dan tidak mengganggu kelestarian lingkungan sekitar sumber air panas yang merupakan daerah potensi wisata yang dilindungi.
Air media merupakan habitat mikroalga untuk melangsungkan kehidupanya. Hal ini berarti perubahan kondisi air media sangat mempengaruhi kelansungan hidup mikroalga. Sebagian besar sel mengandung air dengan kisaran 60-85% dari biomassa sel. Air mempunyai peran penting sebagai senyawa utama penyusun protoplasma, pelarut hara mineral yang dibutuhkan bagi kehidupan mikroalga, sebagai medium reaksi metabolisme, berperan dalam reaksi terang fotosintesis dalam hal ini air sebagai sumber elektron, berperan penting dalam mempertahankan turgiditas sel, pertumbuhan sel dan pergerakan sel (Hamim 2007)
Pemberian konsentrasi P yang semakin tinggi menunjukkan nilai OD yang semakin meningkat. Hasil penelitian ini mendukung penelitian Syahri (2009) yang melaporkan bahwa dengan peningkatan konsentrasi P yang terdapat dalam media tumbuh mikroalga dapat meningkatkan OD selnya. Unsur P yang terkandung dalam media tumbuh sangat dibutuhkan oleh mikroalga dalam pengaturan proses pertumbuhan dan metabolisme yaitu digunakan untuk menyusun membran sel (fosfolipid), bahan dasar energi (ATP, ADP dan AMP) dan sintesis asam nukleat (Theodorou et.al. 1991; Ferrao-Filho et al. 2003).
Menurut Ferrao-Filho et al.(2003) unsur P yang terlarut dalam air media berperan penting dalam metabolisme antara lain respirasi seluler. Dalam proses respirasi seluler dihasilkan energi bagi mikroalga untuk pertumbuhan, pembelahan dan fungsi yang lain, sehingga unsur P sebagai penyusun energi ATP dan zat yang
terlarut dalam air media sangat dibutuhkan dalam proses ini oleh mikroalga. Hal ini memungkinkan terjadi pemanfaatan sebanyak-banyaknya nutrisi maupun hasil metabolisme yang tersimpan untuk pertumbuhan dan pembentukan sel anak sebelum koloni mengalami kematian sel.
Unsur P dalam larutan nutrisi biasanya dalam bentuk fosfat yang akan diserap oleh mikroalga dalam kondisi lingkungan yang banyak menerima cahaya dan dalam pH antara 6-7 (Lewin 1962). Sidabutar (1999) melaporkan bahwa penambahan garam-garam fosfat sebagai larutan buffer atau larutan penyangga akan menyebabkan pH media tumbuh menjadi stabil. Penambahan konsentrasi P menyebabkan peningkatan bobot kering biomassa. Seiring dengan peningkatan pertumbuhan, maka akumulasi biomassa semakin meningkat. Biomassa yang tersimpan merupakan cadangan energi yang dihasilkan melalui fotosintesis dan