Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan dari bulan September-Oktober 2008. Tempat penelitian dilakukan di Bagian Mikrobiologi Medik Departemen IPHK Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian (BBUSKP).
Desain Penelitian
Bahan penelitian berupa daging ayam beku yang dilalulintaskan melalui Pelabuhan Penyeberangan Merak pada Balai Karantina Pertanian Kelas II Cilegon- Banten.
Untuk memperoleh informasi tentang kondisi daging ayam beku, alat angkut dan profil pengemudi dilakukan wawancara (kuesioner) dan pengamatan langsung pada saat pengambilan sampel (Lampiran 1). Data yang dikumpulkan dalam penelitian ini adalah pendidikan, pengetahuan tentang higiene daging, daerah asal daging, kemasan, warna daging, bau daging, kebersihan alat angkut dan suhu ruangan dalam alat angkut.
Pendidikan pengemudi dikategorikan sebagai tamat SD, SMP dan SMA. Pengetahuan higiene daging dikategorikan sebagai tahu dan tidak tahu. Daerah asal daging dikategorikan berasal dari Bekasi, Jakarta, Bogor dan Serang. Warna daging dikategorikan sebagai warna yang menyimpang dan warna normal daging ayam. Bau daging dikategorikan sebagai bau yang menyimpang dan bau normal daging ayam. Kebersihan ruang pendingin dikategorikan bersih atau tidak. Suhu ruangan alat angkut dikategorikan suhu yang dipersyaratkan untuk menyimpan daging ayam beku atau tidak.
Pengambilan sampel ditentukan dengan menggunakan metode random sederhana dan proporsional, sedangkan untuk menghitung besaran sampel menggunakan rumus:
n = 4 PQ L2
Keterangan:
n = besaran sampel yang digunakan P = asumsi prevalensi
Q = (1 – P)
L = galat yang diinginkan (Thrusfield 2005)
Dengan tingkat konfidensi 95% dan galat yang diinginkan 0,05 serta asumsi prevalensi untuk TPC 98.2%, E. coli 3.4%, Salmonella 3.4% dan S. aureus 2%, maka didapat:
• n = 4 x 0.982 x 0.018 (0.05) 2
= 28 sampel untuk pemeriksaan TPC
• n = 4 x 0.034 x 0.966 (0.05) 2
= 53sampel untuk pengujian E. coli •
n = 4 x 0.034 x 0.966
•
(0.05) 2
= 53 sampel untuk pengujian Salmonella
• n = 4 x 0.02 x 0.98 (0.05) 2
= 31 sampel untuk pemeriksaan S. aureus
Alat-Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu cawan petri, pipet serologi 1 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml, tabung reaksi steril, inkubator 35 ±1 0C, stomacher, penangas air, gunting stainless, gelas ukur 250 ml, pinset, plastik timbang steril, botol media, jarum inokulasi (ose), pembakar/bunsen, pH meter, timbangan, pengocok tabung (vortex mixer), autoclave, lemari steril (clean bench), lemari pendingin (refrigerator) dan freezer.
Bahan-Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan berupa Plate Count Agar (PCA), Buffered Peptone Water (BPW), Triphenil Tetrazolium Chloride (TTC)1%, Lauryl Trypthose Broth (LTB), Escherichia coli Broth (EC Broth), Eosin Methylen Blue Agar
(EMBA), Baird Parker Agar (BPA), Rappaport Vassiliadis Broth (RVB), Xylose Lysine Deoxycholate Agar (XLDA), Lactose Broth (LB), Bismuth Sulfite Agar (BSA), Hektoen Enteric Agar (HEA), Lysine Iron Agar (LIA), Simmons Citrate Agar
(SCA) , Triple Sugar Iron Agar (TSIA), Tetrathionate Broth (TTB), Urea Broth,
Indikator Methyl Red, Sulphite Indol Motility (SIM) Medium, Methyl Red-Voges Proskauer(MR-VP) Broth, Reagents Kovacs, α-naphtol, KOH 40%, kreatinin, kapas,
zat warna Gram, NaCl fisiologis dan Alkohol 70%.
Metode Pengujian
Metode pengujian yang digunakan dalam penelitian ini adalah uji kuantitatif dan kualitatif yang mengacu kepada Bacteriological Analytical Manual, Food and Drug Administration, AOAC International (BAM 2006).
Cara Kerja
Penghitungan Angka Lempeng Total (ALT)
Prinsip :
Sampel daging ayam ditumbuhkan pada media agar, maka apabila sampel tersebut mengandung mikroorganisme akan tumbuh koloni yang dapat dihitung. Cara Kerja :
25 gram sampel ditimbang secara aseptik kemudian dimasukkan dalam plastik steril dan ditambahkan 225 ml larutan BPW dan di stomacher selama 1-2 menit dengan kecepatan 230 rpm.
Sebanyak 1 ml suspensi dipindahkan dengan pipet steril ke dalam 9 ml larutan BPW untuk mendapatkan pengenceran 10-2. Dengan cara yang sama dibuat pengenceran 10-3 , 10-4 dan seterusnya sesuai kebutuhan sampel.
Sebanyak 1 ml suspensi diambil dengan menggunakan pipet steril dari setiap pengenceran di atas, kemudian dimasukkan ke dalam cawan petri steril. Dilakukan duplo untuk setiap pengenceran.
Ditambahkan 18 – 20 ml PCA yang sudah didinginkan sampai suhu 55 – 560C dan telah ditambahkan 1% larutan TTC ke masing-masing cawan yang sudah berisi larutan sampel. Supaya larutan sampel dan media PCA tercampur seluruhnya dilakukan pemutaran cawan membentuk angka delapan.
Dibiarkan sampai memadat.
Diinkubasikan pada suhu 36 ± 1 0C selama 24 – 48 jam dengan meletakkan cawan petri pada posisi terbalik.
Kemudian dihitung cawan-cawan yang mempunyai jumlah koloni 25 – 250.
Pengujian Escherichia coli Prinsip
Bakteri Coliform termasuk bakteri Gram negatif, aerob sampai fakultatif anaerob, dapat memfermentasikan laktosa dengan menghasilkan asam dan gas pada suhu 36 ±10C selama 48 jam.
Cara Kerja Uji Dugaan :
Sebanyak 25 gram sampel ditimbang secara aseptik, kemudian dimasukkan dalam plastik steril. Ditambahkan 225 ml larutan BPW dan di stomacher selama 1-2 menit dengan kecepatan 230 rpm.
Sebanyak 1 ml suspensi dipindahkan dengan pipet steril ke dalam 9 ml larutan BPW untuk mendapatkan pengenceran 10-2. Dengan cara yang sama dibuat pengenceran 10-3.
Sebanyak 1 ml suspensi diambil dengan pipet steril dari setiap pengenceran 10-1 s/d 10-3 . Dimasukkan ke dalam tabung LTB yang berisi tabung Durham. Setiap pengenceran dimasukkan ke dalam 3 tabung LTB (triplo).
Cara Kerja Uji Penegasan E. coli :
Biakan positif pada uji pendugaan dipindahkan dengan menggunakan jarum inokulasi dari setiap tabung LTB ke dalam tabung EC Broth yang berisi tabung Durham. Kemudian EC Broth yang telah diinokulasi diinkubasikan suhu 450C 48 ± 2 jam.
Gas yang terbentuk diperhatikan selama 48 ± 2 jam.
Dari tabung EC Broth yang positif, dibuat goresan pada agar L-EMB dengan menggunakan jarum inokulasi diameter 3 mm.
Biakan pada agar L-EMB diinkubasikan pada suhu 36 ± 10C selama 18 – 24 jam. Koloni tersangka diperhatikan yaitu warna hitam/gelap pada bagian pusat koloni dengan/tanpa warna metalik kehijauan. Dengan menggunakan jarum inokulasi, koloni tersangka diambil dari masing-masing Agar L-EMB dan dipindahkan ke PCA (agar miring) yang digunakan untuk uji biokimia.
Agar miring tersebut diinkubasikan pada suhu 36 ± 10C selama 18 – 24 jam. Dilakukan uji biokimia berupa uji IMVIC, TSIA dan Urea.
Uji Biokimia Uji Indol
a) Tabung SIM diinokulasikan dengan biakan dari tabung PCA dan diinkubasikan pada suhu 35 ± 1 ºC selama 24 jam ± 2 jam.
b) Uji Indol dengan ditambahkan 0,2 - 0,3 ml Reagen Kovacs.
c) Hasil uji positif ditandai dengan adanya cincin merah di permukaan media.
d) Hasil uji negatif ditandai dengan terbentuknya cincin kuning.
Uji Voges-Proskauer (VP)
a) Biakan dari tabung PCA diinokulasikan ke tabung yang berisi 10 ml media MR-VP dan inkubasi pada temperatur 35 ± 1ºC selama 48 jam ± 2 jam. b) Sebanyak 5 ml MR-VP dipindahkan ke tabung reaksi dan ditambahkan 0.6
ml larutan α-naphthol dan 0.2 ml KOH 40%, kemudian digoyang-goyang
c) Hasil uji positif apabila ada warna merah muda eosin dalam waktu 2 jam.
Uji Methyl Red (MR)
a) Sebanyak 5 ml media MR-VP diinkubasikan kembali pada suhu 36 ± 1ºC selama 48 jam ± 2 jam.
b) Ditambahkan 2 tetes indikator Methyl Red pada setiap tabung. c) Hasil uji positif ditandai dengan adanya warna merah.
d) Hasil uji negatif ditandai dengan adanya warna kuning.
Uji Citrat (Simmons Citrate Agar)
a) Tabung media Simmons Citrate Agar diinokulasikan dengan biakan dari tabung PCA dengan menggunakan jarum inokulasi.
b) Diinkubasi pada temperatur 36 ± 1ºC selama 96 jam.
c) Penggunaan inokulum terlalu banyak akan menyebabkan nutrien lain terbawa.
d) Hasil uji positif ditandai dengan perubahan warna media menjadi biru. d) Hasil uji negatif ditandai dengan tidak terjadinya perubahan warna media.
Pengujian Salmonella Prinsip
Pertumbuhan Salmonella pada media selektif dengan pra pengayaan (pre- enrichment), dan pengayaan (enrichment) dan dilanjutkan dengan uji biokimia dan uji serologi.
Pra-pengayaan
a) Sebanyak 25 g sampel ditimbang, kemudian dimasukkan dalam plastik steril dan ditambahkan 225 ml Lactose Broth (LB) kemudian di stomacher selama ± 2 menit dengan kecepatan 230 rpm.
b) pHnya dicek, bila < 6,6 sesuaikan sampai 6,8 ± 2 dengan menambahkan NaOH 1 N steril.
Pengayaan
a) Biakan pra-pengayaan diaduk perlahan kemudian diambil dan dipindahkan masing-masing 1 ml ke dalam 10 ml media TTB, sedangkan untuk media RV dipindahkan 0,1 ml ke dalam 10 ml media RV.
b) Sampel dengan dugaan cemaran Salmonellaspp. tinggi (high microbial load) : Media RV diinkubasikan pada temperatur 42 0C ± 0.2 ºC selama 24 jam ± 2 jam. Untuk media TTB diinkubasikan pada temperatur 43 ºC ± 0.2 ºC selama 24 jam ± 2 jam.
c) Sampel dengan dugaan cemaran Salmonellaspp. rendah (low microbial load):
Media RV diinkubasikan pada temperatur 42 0C ± 0.2 ºC selama 24 jam ± 2 jam. Untuk media TTB diinkubasikan pada temperatur 35 0C ± 2 ºC selama 24 jam ± 2 jam.
Isolasi dan Identifikasi
a) Masing-masing media pengayaan yang telah diinkubasikan diambil dengan menggunakan jarum ose dan diinokulasikan pada media HE, XLD dan BSA. Kemudian diinkubasikan pada temperatur 35 ºC selama 24 jam ± 2 jam. Untuk BSA apabila belum jelas dapat dinkubasikan lagi selama 24 jam ± 2 jam.
b) Koloni Salmonella diamati pada media HE terlihat berwarna hijau kebiruan dengan atau tanpa titik hitam (H2S).
c) Pada media XLD koloni terlihat merah muda dengan atau tanpa titik mengkilat atau terlihat hampir seluruh koloni hitam.
d) Pada media BSA koloni terlihat keabu-abuan atau kehitaman, kadang metalik, media di sekitar koloni berwarna coklat dan semakin lama waktu inkubasi akan berubah menjadi hitam.
e) Identifikasi dilakukan dengan mengambil koloni yang diduga dari ketiga media tersebut. Masing-masing diinokulasikan ke TSIA dan LIA dengan cara menusukkan ke dasar media agar, selanjutnya digores pada bagian miring.
c) Diinkubasikan pada temperatur 35 ºC selama 24 jam ± 2 jam. Koloni spesifik
Tabel 2 Hasil Uji Salmonella pada TSIA dan LIA
Media Bagian Miring (Slant) Bagian Dasar (Butt) H2S Gas TSIA Alkalin / K (merah) Asam / A (kuning) Positif (hitam) Negatif/ positif LIA Alkalin / K (ungu) Alkalin / K (ungu) Positif (hitam) Negatif/ Positif Uji Biokimia Uji Urease
a) Koloni dari media TSIA yang menciri Salmonella diinokulasi dengan ose ke
Urea Broth.
b) Kemudian diinkubasikan pada temperatur 35 ºC selama 24 jam ± 2 jam. c) Hasil uji spesifik Salmonella adalah negatif uji urease.
Uji Indol
a) Koloni dari media TSIA yang menciri Salmonella diinokulasikan 1 ose ke dalam media SIMdan diinkubasikan pada temperatur 35 ºC selama 24 jam ± 2 jam.
b) Ditambahkan 0,2 ml sampai dengan 0,3 ml Reagen Kovacs.
c) Hasil uji positif ditandai dengan adanya cincin merah di permukaan media. d) Hasil uji negatif ditandai dengan terbentuknya cincin kuning.
e) Hasil uji spesifik Salmonella adalah negatif uji Indol.
a. Uji Voges-Proskauer (VP)
a) Dari media TSIA yang menciri Salmonella diambil biakan dengan ose lalu diinokulasi ke tabung yang berisi 10 ml media MR-VP dan diinkubasi pada temperatur 350C selama 48 jam ± 2 jam.
b) Dipindahkan 5 ml media MR-VP ke tabung reaksi dan ditambahkan 0.6 ml larutan α-naphthol dan 0.2 ml KOH 40%, kemudian digoyang-goyang
sampai tercampur dan didiamkan.
c) Untuk mempercepat reaksi ditambahkan kristal kreatin. Hasil dibaca setelah 4 jam.
d) Hasil uji positif apabila terjadi perubahan warna pink sampai merah delima. e) Umumnya Salmonella memberikan hasil negatif untuk uji VP (tidak terjadi
perubahan warna pada media).
Uji Methyl Red (MR)
a) Sebanyak 5 ml media MR-VP yang telah diinokulasi dengan biakan dari media TSIA yang menciri Salmonella diinkubasikan kembali pada temperatur 350C selama 48 jam ± 2 jam.
b) Ditambahkan 5 - 6 tetes indikator Methyl Red pada tabung.
c) Hasil uji positif ditandai dengan adanya difusi warna merah ke dalam media. d) Hasil uji negatif ditandai dengan terjadinya warna kuning pada media. e) Umumnya Salmonella memberikan hasil positif untuk uji MR.
Uji Citrate
a) Koloni dari TSIA yang menciri Salmonella diinokulasikan ke dalam
Simmons Citrate Agar dengan osé.
b) Diinkubasikan pada temperatur 35 ºC selama 96 jam ± 2 jam.
c) Hasil uji positif ditandai adanya pertumbuhan koloni yang diikuti perubahan warna dari hijau menjadi biru.
d) Hasil uji negatif ditandai dengan tidak adanya pertumbuhan koloni atau tumbuh sangat sedikit dan tidak terjadi perubahan warna.
e) Umumnya Salmonella memberikan hasil positif pada uji citrate.
Uji Lysine Decarboxylase Broth (LDB)
a) Satu ose dari TSIA yang menciri Salmonella diambil dan diinokulasi ke dalam LDB.
b) Diinkubasikan pada temperatur 350C selama 48 jam ± 2 jam dan diamati setiap 24 jam.
c) Salmonella memberikan reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna ungu pada seluruh media dan hasil reaksi negatif memberikan warna kuning.
d) Jika hasil reaksi meragukan (bukan ungu atau bukan kuning) ditambahkan beberapa tetes 0,2 % bromcresol purple dye dan diamati perubahan warnanya.
Uji Kalium Cyanida (KCN)
a) Satu ose biakan dari TSIA yang menciri Salmonella diinokulasikan ke media TB.
b) Diinkubasikan pada temperatur 35 ºC selama 24 jam ± 2 jam. c) Satu ose koloni dari TB diambil dan inokulasi ke dalam KCNB. d) Diinkubasi pada temperatur 35 ºC selama 48 jam ± 2 jam.
e) Hasil uji positif ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan yang ditandai dengan kekeruhan.
f) Hasil uji negatif ditunjukkan dengan tidak adanya pertumbuhan pada media.
g) Salmonella memberikan hasil negatif pada uji KCN.
Uji Gula-Gula
a) Phenol Red Dulcitol Broth atau Purple Broth Base dengan 0,5% Dulcitol
- Koloni dari TSIA yang menciri Salmonella diambil dan inokulasikan pada médium dulcitol broth.
- Diinkubasikan pada temperatur 35 ºC dan diamati setiap 24 jam selama 48 jam ± 2 jam.
- Kebanyakan Salmonella memberikan reaksi positif ditandai dengan pembentukan gas dalam tabung Durham dan warna kuning (pH asam) pada media.
- Hasil reaksi negatif ditandai dengan tidak terbentuknya gas pada tabung Durham dan pada media terbentuk warna merah (pH basa) untuk indikator phenol red atau ungu untuk indikator bromcresol purple.
b) Uji Malonate Broth
- Satu ose dari TSIA yang menciri Salmonella dipindahkan ke dalam
malonate broth.
- Diinkubasikan pada temperatur 350C dan diamati setiap 24 jam selama 48 jam ± 2 jam.
- Hasil uji positif ditunjukkan dengan adanya perubahan warna menjadi biru.
- Salmonella memberikan reaksi negatif yang ditandai dengan adanya warna hijau atau tidak ada perubahan warna.
c) Uji Phenol Red Lactose Broth
- Koloni dari TSIA yang menciri Salmonella diinokulasikan ke dalam
Phenol red lactose broth.
- Diinkubasikan pada temperatur 35 ºC dan diamati setiap 24 jam selama 48 jam ± 2 jam.
- Hasil reaksi positif ditandai dengan produksi asam (warna kuning) dengan atau tanpa gas
- Salmonella memberikan hasil reaksi negatif ditandai dengan tidak ada perubahan warna dan pembentukan gas.
d) Uji Phenol Red Sucrose Broth
- Koloni dari TSIA yang menciri Salmonella diinokulasikan ke dalam
Phenol red sucrose broth.
- Diinkubasikan pada temperatur 35 ºC selama 48 jam ± 2 jam dan diamati setiap 24 jam.
- Hasil uji positif ditandai dengan adanya perubahan warna (kuning) dan dengan atau tanpa pembentukan gas.
- Salmonella memberikan hasil uji negatif ditandai dengan tidak ada perubahan warna dan pembentukan gas.
Uji Serologis
Uji Polyvalent Somatic (O)
a) Satu ose koloni dari TSIA atau LIA yang menciri Salmonella diletakkan pada gelas preparat dan ditambahkan satu tetes larutan garam fisiologis (NaCl 0,85%) steril.
b) Diberikan satu tetes Salmonella polyvalent somatic (O) antiserum di samping suspensi koloni.
c) Suspensi koloni dicampurkan ke antiserum sampai tercampur sempurna. d) Gelas preparat tersebut dimiringkan ke kiri dan ke kanan dengan latar
belakang gelap sambil diamati adanya reaksi aglutinasi.
e) Kontrol disiapkan dengan mencampur larutan garam fisiologis dan antiserum.
f) Dilakukan uji somatik (O) grup monovalent antisera Vi seperti uji polyvalent diatas.
Uji Polyvalent Flagelar (H)
a) Koloni dari TSIA yang menciri Salmonella diinokulasi ke dalam BHIB dan diinkubasi pada temperatur 350C selama 4 jam sampai dengan 6 jam atau ke dalam TSTB dan inkubasi pada temperatur 350C selama 24 jam + 2 jam. b) Ditambahkan 2,5 ml larutan garam fisiologis berformalin (formalinized
physiological saline) ke dalam 5 ml dari salah satu kultur diatas.
c) Sebanyak 0,5 ml larutan Salmonella Polyvalent Flagellar (H) antisera diambil dan dimasukkan ke dalam tabung serologi ukuran 10x75 mm. d) Ditambahkan 0,5 ml antigen yang akan diuji.
e) Larutan garam fisiologis kontrol disiapkan dengan mencampurkan 0,5 ml larutan garam fisiologis berformalin dengan 0,5 ml antigen berformalin (formalinized antigen).
f) Kedua campuran tersebut diinkubasikan ke dalam penangas air pada temperatur 480C sampai dengan 500C.
g) Diamati adanya penggumpalan setiap 15 menit selama 1 jam.
h) Hasil uji positif ditandai dengan adanya penggumpalan, sedangkan pada kontrol tidak terjadi penggumpalan.
Pengujian Staphylococcus aureus Prinsip
Metode untuk menghitung S. aureus menggunakan metode cawan hitung. Koloni S. aureus pada Baird Parker Agar mempunyai ciri : bundar, licin halus, cembung, abu-abu hingga kehitaman, tepi koloni putih dan dikelilingi daerah yang terang.
Cara Kerja :
Sebanyak 25 gram sampel ditimbang secara aseptik kemudian dimasukkan dalam plastik steril. Ditambahkan 225 ml larutan BPW steril dan di stomacher selama 1 - 2 menit dengan kecepatan 230 rpm.
Sebanyak 1 ml suspensi dipindahkan dengan pipet steril ke dalam 9 ml larutan BPW steril untuk mendapatkan pengenceran 10-2.
Sebanyak 1 ml suspensi diambil dengan pipet steril dari setiap pengenceran di atas dan dimasukkan ke dalam 3 cawan petri berisi Baird Parker Agar Medium
(BPA) + Egg Yolk 5 % (yakni : 0,4 ml untuk cawan 1, 0,3 ml untuk cawan 2 dan 0,3 ml untuk cawan 3).
Kemudian disebarkan pada permukaan agar/medium dengan menggunakan batang gelas bengkok (hockey stick).
Dibiarkan hingga meresap selama ± 30 menit pada suhu ruang.
Diinkubasi ke dalam inkubator pada suhu 36 ± 10C selama 24 – 48 jam dengan cara cawan petri dibalik.
Koloni S. aureus pada BPA mempunyai ciri : bundar, licin/halus, cembung diameter 2-3 mm, warna abu-abu sampai kehitaman, tepi koloni putih dan dikelilingi daerah yang terang.
Kuman standar S. aureus ditanam pada media BPA sebagai kontrol positif.
Interpretasi Hasil ALT/TPC
Ketentuan Penghitungan Koloni : a. Cawan Kurang dari 25 Koloni
Bila cawan duplo dari pengenceran terendah hasil koloni < 25, dihitung jumlah koloni yang ada pada cawan dari setiap pengenceran.
Untuk menentukan angka TPC yaitu rata-rata jumlah koloni per cawan dikalikan dengan faktor pengencerannya. Angka TPC ditandai dengan bintang (Tabel 3 No. 3).
Untuk menandakan bahwa perhitungan di luar 25 – 250 koloni per cawan. b. Cawan Lebih dari 250 Koloni
Bila jumlah koloni per cawan > 250, dihitung koloni-koloni untuk memberikan gambaran penyebaran koloni secara representatif.
Perhitungan angka TPC ditandai dengan bintang untuk menandakan perhitungan di luar 25 – 250 koloni per cawan (Tabel 3 No. 4).
c. Cawan Tanpa Koloni
Bila cawan dari semua pengenceran tidak menghasilkan koloni, angka ALT dilaporkan sebagai kurang 1 kali pengenceran terendah. Angka ALT ditandai dengan tanda bintang bahwa perhitungannya di luar 25 – 250 koloni (Tabel 3 No. 6).
Cawan duplo, satu cawan dari tiap pengenceran dengan 25 – 250 koloni. Bila satu cawan menghasilkan 25 – 250 koloni dan cawan lain > 25 – 250 koloni atau < 25 – 250 koloni, ke empat cawan dihitung termasuk cawan > 25 – 250 koloni atau < 25 – 250 koloni dalam perhitungan angka TPC (Tabel 3 No. 8).
Cawan duplo kedua dari satu pengenceran dengan 25 – 250 koloni, hanya 1 cawan dari pengenceran yang lain dengan 25 – 250 koloni. Bila kedua cawan dari satu pengenceran menghasilkan 25 – 250 koloni, ke empat cawan dihitung termasuk cawan < 25 atau > 250 koloni dalam perhitungan angka TPC (Tabel 3 No. 9).
Ketentuan Penulisan Hasil Perhitungan :
Dibulatkan menjadi 2 angka sesuai, bila angka ketiga 6 atau di atasnya, maka angka ketiga menjadi 0 (nol) dan angka kedua naik 1 angka, misalnya 465 menjadi 470.
Bila angka ketiga 4 atau dibawahya, maka angka ketiga menjadi 0 (nol) dan angka kedua tetap, misalnya 454 menjadi 450.
Bila angka ketiga 5, maka angka tersebut dibulatkan menjadi 0 (nol) dan angka kedua adalah angka genap, misalnya 445 menjadi 400.
Bila angka ketiga 5, maka angka tersebut dibulatkan menjadi 0 (nol) dan angka kedua naik satu angka genap, misalnya 455 menjadi 460.
Tabel 3 Pembacaan angka lempeng total/TPC No 10-2 10-3 10-4 TPC/g Keterangan 1 2 3 4 5 6 1 = = = = = = 175 208 16 17
190.000 Bila hanya satu pengenceran yang ada dalam batas sesuai, hitung jumlah rata-rata dari pengenceran tersebut. 2 = = = = = = 224 225 25 30
250.000 Bila ada dua pengenceran yang berada dalam batas sesuai, hitung jumlah masing-masing dari pengenceran sebelum merata-ratakan jumlah sebenarnya 3 18 14 2 0 0 0
1.600* Koloni< 25 : penegnceran terendah < 25 koloni, hitung jumlah dan kalikan dengan faktor pengenceran, beri tanda * (diliuar 25- 250) 4 = = = = = = = = = = = = 523 487
5.100.000 Koloni > 25 : hitung koloni yang ada/dapat dihitung (representatif), beri tanda * (di luar 25-250) 5 = = = = = = 245 230 35 spreader
240.000 Bila ada dua pengenceran antara 25 – 250, tetapi ada spreader, hitung jumlah dan kalikan dengan faktor pengenceran, untuk spreader tidak dihitung 6 0 0 0 0 0 0
230.000 Tanpa koloni : jumlah TPC adalah < 1 kali pengenceran terendah yang digunakan, beri tanda * (diluar 25 – 250) 7 = = = = = = 245 278 23 20
260.000 Koloni dengan 25 – 250 dan yang lain > 250 : hitung kedua cawan termasuk yang 25 dan rata-rata jumlah yang sebenarnya
8 = = = = = = 225 255 21 40
240.000 Salah satu plate dengan 25 – 250 koloni dari tiap pengenceran termasuk yang 25 dan rata- rata jumlah yang sebenarnya
9 = = = 220 240 18 48
230.000 Hanya satu plate yang menyimpang dari tiap pengenceran : hitung jumlah dari tiap pengenceran termasuk yang < 25 atau > 250. Kemudian rata-ratakan jumlah sebenarnya. Perbandingan 41000/29300 = 2,3 (>2), maka hasilnya dilaporkan pengenceran tertinggi, 41000 10 = = = = = = 293 260 230 41 30 20 4 270.000 41.000 Catatan :
1. Koloni yang dihitung dalam batas 25 – 250. 2. Pembulatan angka :
a) Bila angka ketiga dari kiri > 5, maka angka ketiga menjadi 0 (nol) dan angka kedua naik. b) Bila angka ketiga dari kiri > 4, maka angka ketiga menjadi 0 (nol) dan angka kedua tetap.
Interpretasi E. Coli
Tabel 4 Hasil reaksi IMVIC, TSIA dan UREA
No. Tipe Organisme TSIA Indol MR VP Citrat
1 E. coli spesifik +/gas + + - -
2 E. coli nonspesifik + - + - - 3 Typical Intermediate - - + - + 4 Atypical Intermediate - - + - + 5 Typical Enterobacter aerogenes - - - + + 6 Atypical Enterobacter aerogenes - + - + +
Klarifikasi E. coli apabila :
a. Reaksi IMVIC adalah + + - -
b. Membentuk gas di LTB pada inkubasi selama 48 ± 2 jam.
c. Pewarnaan gram menunjukkan Gram negatif, tidak berspora dan berbentuk batang pendek.
APM untuk E. coli ditentukan dengan menggunakan Tabel APM berdasarkan jumlah tabung yang positif pada tabung EC Broth.
Interpretasi hasil Salmonella spp.
Interpretasi hasil uji biokimia Salmonella dapat dilihat pada Tabel 5 di bawah ini.
Tabel 5 Reaksi biokimia Salmonella
No Uji substrat
Hasil reaksi
Positif Negatif Salmonella
1 Glukosa (TSI) Sepanjang bekas tusukan berwarna kuning Sepanjang bekas tusukan berwarna merah + 2 Lysine Dekarboksilase (LIA) Sepanjang bekas tusukan berwarna ungu Sepanjang bekas tusukan berwarna kuning +
3 H2S (TSI dan LIA) Hitam Tidak hitam +
5
Lysine
Dekarboksilase Broth
Warna ungu Warna kuning +
6 Phenol Red Dulcitol
Broth
Warna kuning dan atau dengan gas
Tanpa berubah warna
dan tanpa terbentuk gas + a) 7 KCN Broth Ada pertumbuhan Tidak ada pertumbuhan - 8 Malonate Broth Warna biru Tidak berubah warna -b
9 Uji Indol Permukaan warna
merah
Permukaan warna
kuning -
10 Uji Polyvalent
Flagelar Aglutinasi Tidak aglutinasi +
11 Uji Polyvalent
Somatic Aglutinasi Tidak aglutinasi +
12 Phenol Red Lactose
Broth
Warna kuning dengan/tanpa gas
Tidak terbentuk gas dan tidak berubah
warna
-b)
13 Phenol Red Sukrosa