Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September 2015 - Januari 2016 di Laboratorium Analisa Kimia Bahan Pangan Fakultas Pertanian dan Laboratorium Fisiologi dan Anatomi Hewan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara, Medan. Pengujian folat dilakukan di Laboratorium Embrio Biotekindo, Bogor.
Bahan Penelitian
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah empat varietas ubi jalar dengan daging berwarna ungu, oranye, dan kuning tua (ubi madu) yang diperoleh dari petani di Brastagi, Kabupaten Tanah Karo, dan ubi jalar kuning yang diperoleh dari petani di Kecamatan Sei Binge Kabupaten Langkat, Binjai.
Bahan-bahan kimia yang digunakan adalah heksan, H2SO4 pekat, NaOH 50%, HCl 0,02 N, NaOH 0,02 N, alkohol 95%, alkohol 80%, HCl 25%, NaOH 45%, asam 3,5 dinitrosalisilat NaK Tartarat, fenol, Na-metabisulfit, buffer pH 1, buffer pH 4,5 KCl 0,025 M, Na-asetat 0,4 M, CH3COOH 2%, dan metanol. Hewan uji yang digunakan adalah mencit putih betina berjumlah 24 ekor dan mencit putih jantan berjumlah 8 ekor dengan galur Wistar, umur 3 bulan dengan berat ± 22 g dan sehat.
Alat Penelitian
Peralatan yang digunakan untuk pembuatan tepung ubi jalar adalah blender, talenan, baskom, pisau stainless steel, timbangan, oven, dan loyang. Peralatan yang digunakan untuk pembutan ekstrak ubi jalar adalah timbangan, gelas ukur, beaker glass,
spatula kaca, erlenmenyer, mikropipet, bulb, tabung sentrifuse, alat sentrifugal dan rotary evaporatory. Pengujian folat menggunakan HPLC IKP/ K-12. Peralatan yang digunakan dalam penelitian pengaruh folat terhadap fertilitas induk dan morfologi janin mencit secara in vivo meliputi kandang pemeliharaan, injeksi oral, tempat minum, botol ekstrak timbangan analitik merk Ohaus dan alat bedah.
Metode Penelitian
Penelitian terdiri dari empat tahap yaitu :
Tahap I : Pembuatan tepung dan pengamatan karakteristik kimia tepung ubi jalar. Tahap II: Pembuatan ekstrak empat varietas ubi jalar
Penelitian tahap I dan tahap II dilakukan dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) Non Faktorial dengan perlakuan tunggal berupa varietas ubi jalar (V), yang terdiri 4 taraf, yaitu :
V1 = Ubi jalar oranye V2 = Ubi jalar madu V3 = Ubi jalar ungu V4 = Ubi jalar kuning
Tahap III: Dilakukan analisis folat dan total antosianin.
Tahap IV : Pengujian in vivo pengaruh diet folat terhadap fertilitas induk dan morfologi janin mencit.
Rancangan pada penelitian tahap IV adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) Non Faktorial dan desain penelitian dapat dilihat pada Gambar 7. Subjek penelitian berupa tikus mencit. Populasi berupa mencit (Mus musculus) betina galur wistar berusia 3 bulan dengan berat badan ± 22 g.
25
Jumlah sampel yang digunakan berdasarkan pada rumus Federer (Purawisastra, 2001) sebagai berikut :
(k-1) (n-1) > 15 (4-1) (n-1) > 15 3 (n-1) > 15 + 3 3n > 15 n > 6 ~ 7 Keterangan : k = Jumlah kelompok
n = Jumlah sampel dalam tiap kelompok
Pada penelitian ini jumlah sampel untuk tiap kelompok terdiri 6 ekor mencit dengan jumlah kelompok mencit ada 4 sehingga penelitian ini membutuhkan 24 mencit betina dan 8 mencit jantan dari populasi yang ada.
Gambar 7. Desain penelitian pengujian in vivo pengaruh folat terhadap fertilitas induk dan morfologi janin mencit percobaan
P1 = Kelompok kontrol yaitu pemberian akuades selama 28 hari
P2 = Kelompok diet rendah folat : 0,1 ml (5µg) dan 0,2 ml akuades, selama 28 hari
P3 = Kelompok diet normal folat : 0,2 ml (10µg) dan 0,1 ml akuades, selama 28 hari
P4 = Kelompok diet tinggi folat : 0,3 ml = (15µg), tanpa akuades selama 28 hari
X1 = Tingkat fertilitas induk Y1 = Fertilitas induk mencit Y2 = Kenaikan berat badan Y3 = Jumlah anakan mencit
P2 P3 P4 P1 Sampel Mencit 24 ekor betina X1 : Y1, Y2, Y3 X2 : W1, W2, W3 Dibandingkan dengan uji statistik
X2 = Morfologi janin mencit W1 = Berat badan anakan mencit W2 = Ukuran badan anakan mencit W3 = Penampilan fisik
Pengamatan terhadap jumlah anakan mencit, berat badan induk, berat badan anakan, ukuran badan anakan, dan penampilan fisik. Pengamatan dilakukan selama 28 hari.
Model Rancangan
Model rancangan penelitian Rancangan Acak Lengkap (RAL) Non Faktorial adalah sebagai berikut:
Ŷij= µ + αi+ + εij
dimana:
Ŷij : Hasil pengamatan dari faktor V pada taraf ke-i dalam ulangan ke-j µ : Efek nilai tengah
αi : Efek faktor V pada taraf ke-i
εij : Efek galat dari faktor V pada taraf ke-i dalam ulangan ke-j.
Apabila diperoleh hasil yang berbeda nyata dan sangat nyata maka uji dilanjutkan dengan uji beda rataan dengan menggunakan uji LSR (Least Significant Range).
Pelaksanaan Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dalam empat tahap yakni seperti berikut :
Penelitian tahap I : Pembuatan tepung ubi jalar dan pengamatan karakteristik kimia tepung ubi jalar
Jenis ubi jalar yang digunakan untuk pembuatan tepung adalah ubi jalar dengan warna daging yaitu ungu, oranye, kuning tua (ubi madu) dan kuning. Ubi jalar disortasi, dicuci, ditiriskan, dan dikupas kulitnya. Kemudian ubi diiris tipis dengan ketebalan ± 0,5 cm dipaparkan diatas loyang dan dikeringkan di oven pada suhu 40 oC selama ± 24 jam.
27
Kemudian dihaluskan dengan blender dan diayak dengan ayakan 60 mesh. Tepung ubi jalar yang dihasilkan dikemas dalam kemasan plastik polietilen. Pembuatan tepung ubi jalar dapat dilihat pada Gambar 8. Tepung ubi jalar yang dihasilkan kemudian dianalisa karakteristik kimia berupa komposisi proksimat yaitu kadar air, kadar abu, kadar lemak, kadar protein, dan kadar karbohidrat.
Penelitian tahap II : Pembuatan ekstrak empat varietas ubi jalar
Tepung ubi jalar dari empat varietas ditimbang sebanyak 5 g dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer 500 ml, ditambahkan 300 ml CH3COOH 2% kemudian dipanaskan pada suhu 95-100 oC pada penangas air selama 20 menit. Setelah itu dilakukan sonifikasi selama 5 menit dan didinginkan, kemudian dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu takar 500 ml, ditambahkan 125 ml metanol, dan dihimpitkan dengan CH3COOH 2% hingga batas tera. Suspensi yang dihasilkan selanjutnya di sentrifuse dan kemudian dievaporasi dengan rotary evaporator selama 4 jam sehingga diperoleh ekstrak ubi jalar. Pembuatan ekstrak ubi jalar dapat dilihat pada Gambar 9.
Penelitian tahap III : Dilakukan analisis folat dan total antosianin pada ekstrak ubi jalar
Pada tahap ini ekstrak ubi jalar yang dihasilkan, kemudian dianalisis kandungan folat dengan HPLC IKP/ K-12 dan dilakukan analisis total antosianin untuk mengetahui hubungan pigmen antosianin dengan kandungan folat.
Pengamatan dan Parameter Penelitian Kadar air (AOAC, 1995)
Sampel sebanyak 5 g dimasukkan ke dalam cawan alumunium yang telah dikeringkan selama 1 jam pada suhu 105 oC yang telah diketahui beratnya. Sampel tersebut dipanaskan pada suhu 105 oC selama tiga jam, kemudian didinginkan dalam desikator
sampai dingin kemudian ditimbang. Pemanasan dan pendinginan dilakukan berulang sampai diperoleh berat sampel konstan. Kadar air dihitung berdasarkan formula sebagai berikut.
Kadar Air = Berat awal – Berat akhir Berat awal
x 100%
Kadar abu (SNI-01-3451-1994)
Sampel sejumlah 5 g dimasukkan ke dalam cawan porselen kering yang telah diketahui beratnya (yang terlebih dulu dikeringkan dalam oven dan didinginkan dalam desikator). Kemudian sampel dipijarkan diatas kompor listrik kira-kira 1 jam sampai sampel berbentuk arang. Kemudian cawan porselen yang berisi arang dimasukkan ke dalam tanur dengan suhu 500 – 600 oC sampai terbentuk abu. Cawan porselen didinginkan kemudian dikeluarkan dari tanur dan dimasukkan ke dalam desikator selam 15 menit kemudian ditimbang beratnya. Kadar abu dihitung dengan formula sebagai berikut.
Kadar abu = Bobot akhir (g) Bobot awal (g)
x 100 % Kadar lemak (AOAC, 1995)
Analisa lemak dilakukan dengan metode Soxhlet. Sampel sebanyak 5 g dibungkus dengan kertas saring, kemudian diletakkan dalam alat ekstraksi soxhlet. Alat kondensor dipasang diatasnya dan labu lemak di bawahnya. Pelarut lemak heksan dimasukkan ke dalam labu lemak, kemudian dilakukan reflux selama ± 6 jam sampai pelarut turun kembali ke labu lemak dan berwarna jernih. Pelarut yang ada dalam labu lemak didestilasi dan ditampung kembali. Kemudian labu lemak yang berisi lemak hasil ekstraksi dipanaskan dalam oven pada suhu 70 oC hingga mencapai berat yang tetap, kemudian didinginkan dalam desikator. Labu beserta lemaknya ditimbang. Kadar lemak dihitung dengan formula sebagai berikut.
29
Kadar lemak = Bobot lemak (g) Bobot sampel (g)
x 100%
Kadar protein (Metode KjeIdahl, AOAC, 1995).
Sampel sebanyak 0,2 g dimasukkan ke dalam labu kjedahl 30 ml selanjutnya ditambahkan dengan 2,5 ml H2SO4 pekat, 1 g campuran katalis selenium dan batu didih. Kemudian sampel dipanaskan pada suhu 350 oC selama 3-4 jam atau sampai cairan berwarna putih. Labu beserta isinya didinginkan lalu isinya dipindahkan ke dalam alat destilasi dan ditambahkan larutan NaOH 40%, kemudian dibilas dengan air suling. Labu erlenmeyer berisi asam borat (H3BO3) 10 ml diletakkan di bawah kondensor, sebelum ditambahkan ke dalamnya 2-4 tetes indikator conway. Ujung tabung kondensor harus terendam dalam labu larutan asam borat, kemudian dilakukan destilasi hingga sekitar 125 ml destilat dan ditampung di dalam erlenmeyer lalu dititrasi dengan HCl 0,05 N sampai terjadi perubahan warna hijau menjadi merah muda. Kadar protein dihitungan dengan formula sebagai berikut.
% N = 1000 x sampel Bobot 6,25 x 14 x N x B) -(A x 100 %
A = ml NaOH untuk tittrasi blanko B = ml NaOH untuk titrasi sampel N = Normalitas HCl
Kadar karbohidrat (by difference).
Kadar pati (Hidrolisis asam, Apriyantono dkk., 1989).
Sampel sebanyak 2-5 g yang telah dihaluskan dimasukkan ke dalam beaker glass 250 ml, selanjutnya ditambahkan 50 ml alkohol 80% dan diaduk selama 1 jam. Suspensi tersebut disaring dengan kertas saring dan dicuci dengan air sampai volume filtrat 250 ml. Filtrat ini mengandung karbohidrat yang terlarut dan dibuang. Residu pati yang terdapat pada kertas saring dicuci sebanyak 5 kali dengan 10 ml eter. Dibiarkan eter menguap dari residu, kemudian cuci kembali dengan 150 ml alkohol 10% untuk membebaskan lebih lanjut karbohidrat yang terlarut. Residu dipindahkan dari kertas saring ke dalam erlenmeyer dengan cara pencucian dengan 200 ml air dan ditambahkan 20 ml HCl 25%. Kemudian ditutup dengan penangas balik dan dipanaskan diatas penangas air sampai mendidih selama 2,5 jam pada suhu 100 oC. Dibiarkan dingin dan dinetralkan dengan larutan NaOH 45% dan diencerkan sampai volume 500 ml sampai ± pH 7. Disaring kembali campuran diatas pada kertas saring, setelah itu ditentukan kadar gula yang dinyatakan sebagai glukosa dari filtrat yang diperoleh. Kadar pati dihitung dengan formula sebagai berikut.
Faktor pengenceran x Kadar gula pereduksi (mg/ml) x 100 % x 0,9 Kadar pati =
Bobot sampel (g)
Total antosianin (Ticolu dkk., 2016).
Persiapan larutan sampel (Winarti, dkk., 2008).
Sebanyak 10 g tepung ubi jalar di timbang dengan teliti kedalam erlenmeyer 100 ml. Ditambahkan 3,2 ml etanol, 0,6 ml CH3COOH, dan 16,1 ml air, dan di diamkan selama ± 24 jam. Ekstrak kemudian di saring dengan kain saring sehingga di dapat filtrat pigmen.
31
Pembuatan buffer pH 1
Untuk membuat buffer pH 1 digunakan KCl sebanyak 1,86 g dicampur dengan 980 ml akuades dan diatur hingga mencapai pH 1 dengan menggunakan HCl pekat. Selanjutnya larutan dipindahkan ke dalam labu ukur 1 L dan ditambahkan akuades sampai tanda batas.
Pembuatan buffer pH 4,5
Untuk buffer pH 4,50 digunakan CH3CO2Na. 3H2O sebanyak 54,43 g dicampur dengan 950 ml akuades. Kemudian pH diukur dan diatur dengan HCl pekat hingga diperoleh larutan dengan pH 4,5. Selanjutnya larutan dipindahkan ke dalam labu ukur 1000 ml dan diencerkan dengan akuades sampai volume mencapai 1000 ml.
Pengukuran dan perhitungan konsentrasi antosianin total
Faktor pengenceran yang tepat untuk sampel harus ditentukan terlebih dahulu dengan cara melarutkan sampel dengan larutan penyangga KCl pH 1 hingga diperoleh absorbansi kurang dari 1,20 pada panjang gelombang 530 nm. Selanjutnya diukur absorbansi akuades pada panjang gelombang yang akan digunakan (530 dan 700 nm) untuk mencari titik nol. Panjang gelombang 530 adalah panjang gelombang maksimum untuk sianidin-3-glukosida, sedangkan panjang gelombang 700 nm untuk mengoreksi endapan yang masih terdapat pada sampel. Jika sampel benar-benar jernih maka absorbansi pada 700 nm adalah 0.
Dua larutan sampel disiapkan, pada sampel pertama digunakan buffer KCl dengan pH 1 dan untuk sampel kedua digunakan buffer Na-asetat dengan pH 4,50. Masing-masing sampel dilarutkan dengan buffer berdasarkan FP (faktor pengenceran) yang sudah ditentukan sebelumnya. Sampel dibiarkan selama 15 menit sebelum diukur. Absorbansi dari setiap larutan pada panjang gelombang 530 dan 700 nm diukur dengan akuades
sebagai blanko. Absorbansi (A) dari sampel yang telah di larutkan ditentukan dengan rumus :
A = (A530-A700)pH 1 – (A530-A700)pH 4,5
Kandungan pigmen antosianin pada sampel dihitung dengan rumus : Total antosianin =
(mg/100 g) A x BM x FP x 1000 ε x L Keterangan :
A = Absorbansi
BM = Berat molekul = 449,20 (sianidin-3-glikosida) FP = Faktor pengencer
ε = Koefisien absorbsivitas molar = 26900 (sianidin-3-glikosida)
Pengujian Folat (Hofstetter, 1991) Persiapan larutan standar
Standar ditimbang dengan teliti sebanyak 1 g ke dalam labu takar 100 ml dan ditambahkan sebanyak 60 ml CH3COOH 2% dan metanol sebanyak 25 ml.
Kemudian dihimpitkan dengan CH3COOH 2%, dikocok sampai homogen. Diambil larutan standar dengan menggunakan siring, lalu dipasang siring dengan disk filter 0,45. Kemudian dilarutkan filtrat siap untuk diinjeksikan pada HPLC.
Persiapan larutan sampel
Sebanyak 1-2 g sampel di timbang dengan teliti dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer 100 ml. Ditambahkan 60 ml CH3COOH 2%, dipanaskan pada suhu 95-100 oC pada panangas air selama 20 menit. Sonifikasi dilakukan selama 5 menit dan didinginkan, kemudian dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu takar 100 ml, ditambahkan 25 ml metanol dan dihimpitkan dengan CH3COOH 2%, dan selanjutnya di sentrifus sehingga
33
terjadi pemisahan dengann cairan jernihnya. Larutan sampel diambil dengan menggunakan siring dan dipasang siring dengan disk filter 0,45 mm dan larutan filtrat siap untuk dinjeksikan pada HPLC.
Analisis sampel dengan HPLC
Dilakukan warm up HPLC selama 30-45 menit sampai kondisi baseline stabil terhadap fase gerak yang akan digunakan. Disuntikan larutan standar pada HPLC, lalu suntikan larutan sampel pada HPLC. Dilakukan bilas injektor valve dengan akuades minimal 3 kali menggunakan siring plastik 10 ml. Kemudian bilas HPLC dengan menggunakan akuades dan metanol masing-masing selama 30 menit.
Penelitian tahap IV : Pengujian in vivo pengaruh diet folat terhadap fertilitas induk dan morfologi janin mencit percobaan
Sebanyak 24 mencit betina galur wistar dibagi menjadi 4 kelompok, setiap kelompok terdiri dari 6 mencit betina dengan 2 mencit jantan. Kelompok I adalah kelompok kontrol hanya diberikan akuades, kelompok II adalah diet rendah folat (0,1 ml = 5 μg), kelompok III adalah diet medium folat (0,2 ml = 10 μg), dan kelompok IV adalah diet tinggi folat (0,3 ml = 15 μg). Pemberian diet masing-masing kelompok dilakukan selama 28 hari. Mencit setelah diberikan diet selama 7 hari selanjutnya dikawinkan dan ditunggu sampai kebuntingan.
Pengamatan dan Parameter Penelitian Dosis dan jumlah ekstrak yang diberikan
Ekstrak ubi jalar yang digunakan adalah ekstrak dengan konsentrasi folat yang tertinggi. Diet folat yang diberikan sesuai dengan literatur Istiadjid (2004) yaitu diet rendah folat (5μg), diet medium folat (10 μg), dan diet tinggi folat (15μg). Total ekstrak yang dapat diberikan kepada mencit percobaan untuk sekali pemberian adalah 0,3 ml.
Berdasarkan hasil analisis kandungan folat pada ekstrak ubi jalar ungu adalah 9,44 mg/kg bahan sehingga untuk mendapatkan dosis 5 µg folat dalam 0,1 ml ekstrak, dilakukan pengenceran terhadap ekstrak sebagai berikut :
Berat total ekstrak = 1000 g
Dosis folat yang diberikan 5 µg/0,1 ml = 0,05 mg/ml Banyak akuades yang ditambahkan adalah sebagai berikut : 9,44 mg = x ml 1 ml 0,05 mg x = 9,44 0,05 ml x = 188,8 ml
Berdasarkan hasil perhitungan konsentrasi ekstrak 0,05 mg/ml, maka ke dalam 1000 g ekstrak ubi jalar ungu ditambahkan 188,8 ml akuades. Volume ekstrak yang diberikan ke mencit untuk mendapatkan dosis sesuai dengan perlakuan dapat dilihat pada Tabel 8. Tabel 8. Volume ekstrak folat yang diberikan pada mencit untuk diet rendah, medium, dan
tinggi folat.
Diet folat Volume ekstrak yang diberi ke mencit (ml/ ekor mencit)
Jenis mg µg
Rendah 0,05 5 0,1
Medium 0,1 I0 0,2
Tinggi 0,15 15 0,3
Persiapan pengadaan mencit wistar
Mencit betina galur wistar yang digunakan dalam penelitian ini sebanyak 28 ekor dan 8 ekor jantan yang diadaptasikan selama kurang lebih satu minggu terhadap makanan dan lingkungan.
Persiapan kandang
Kandang yang digunakan dalam penelitian ini yaitu kandang individual berukuran 20 x 20 x 20 cm. Dalam penelitian ini digunakan sebanyak 4 kandang dalam keadaan bersih dengan sirkulasi udara yang baik dan tidak ditumpuk.
35
Pemberian pakan
Jenis ransum yang diberikan yaitu pelet yang dibeli dari P.T. Charoen Pokhphan Medan. Pemberian diet folat ubi jalar yang dilakukan selama 28 hari. Makanan dan minuman yang diberikan secara adlibitum.
Fertilitas induk mencit
Dilakukan pengamatan terhadap fertilitas induk berdasarkan kecepatan terjadinya kebuntingan. Pengamatan dilakukan dengan penimbangan berat badan dan pengamatan secara visual terhadap induk mencit setelah dikawinkan setiap 3 hari sekali selama 21 hari. Mencit ditimbang dengan timbangan merk Ohaus. Terjadinya kebuntingan ditandai adanya peningkatan berat badan. Ciri-ciri mencit hamil dapat diketahui secara visual adalah perut terlihat membesar dan buncit, putting susu mencit terlihat sangat menonjol, dan tidak terlalu banyak bergerak atau keaktifan mencit berkurang seperti sebelum hamil (Astriana, 2014).
Berat badan induk mencit
Pengamatan dilakukan terhadap berat badan induk mencit dilakukan dengan penimbangan berat badan induk mencit setiap 3 hari selama 21 hari setelah dikawinkan. Penimbangan dengan timbangan analitik merk Ohaus dengan ketelitian dua angka. Tujuan penimbangan berat badan induk untuk mengetahui terjadinya kebuntingan.
Jumlah anakan mencit
Pengamatan terhadap jumlah anakan dilakukan secara visual yaitu setelah usia kebuntingan mencapai 21 hari, kemudian dilakukan pembedahan secara histerotomi dengan menggunakan alat bedah. Dihitung jumlah anakan yang dihasilkan dari induk mencit yang hamil berdasarkan kelompok perlakuan.
Berat badan anakan mencit
Pengamatan terhadap berat badan anakan mencit dilakukan setelah pembedahan secara histerotomi dengan menggunakan alat bedah pada usia kebuntingan mencapai 21 hari, kemudian dilakukan penimbangan berat badan anakan menggunakan timbangan analitik merk Ohaus dengan ketelitian dua angka.
Ukuran badan anakan mencit
Pengamatan terhadap berat badan anakan mencit dilakukan setelah pembedahan secara histerotomi dengan menggunakan alat bedah pada usia kebuntingan mencapai 21 hari, kemudian dilakukan pengukuran panjang anakan dengan meletakkan anakan pada kertas millimeter. Setiap kotak pada kertas millimeter berukuran 1 mm.
Penampakkan fisik anakan mencit
Pengamatan penampilan fisik dilakukan secara visual yaitu setelah pembedahan secara histerotomi dengan menggunakan alat bedah pada usia kebuntingan mencapai 21 hari, kemudian dilakukan pengamatan pada anakan berdasarkan penampilan fisiknya.
37