Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Penelitian Bioteknologi dan Ilmu Hayat, IPB, dari bulan September 2004 sampai September 2005.
Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 9 jenis sponge (Sponge ST1, ST2, ST3, ST4, ST5, ST6, ST7, ST8 dan ST9) yang diambil dari koleksi Balai Besar Riset Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan, Badan Riset Kelautan dan Perikanan, Departemen Kelautan dan Perikanan. Sponge tersebut berasal dari perairan Pulau Nias dan Binuangeun (peta lokasi pada Lampiran 1). Bahan lainnya adalah tabung dialisis cut-off 10 kDa, substrat tetraethoxyorthosilicate (TEOS), buffer HF/ NH4F, buffer Tris-Cl, larutan natrium hipoklorit, larutan HNO3, H2SO4, etanol, standar protein BSA, pereaksi Bradford, bahan-bahan kimia untuk analisis, bahan-bahan kimia untuk SDS/PAGE dan pereaksi untuk colorimetric molybdate assay (konsentrasi bahan-bahan pada Lapmpiran 2).
Alat utama yang digunakan adalah oven, spektrofotometer, haemacytometer, mikroskop polarisasi, refrigerator, freezer, alat elektroforesis, sentrifugasi, alat dialisis, stirrer, shaker, pipet mikro, alat-alat gelas dan plastik .
Metode Penelitian
Pengumpulan dan Pemilahan Sampel Sponge
Sponge diambil dari perairan Binuange un (Ujung Kulon, Banten) sebanyak 2 jenis (Sponge ST1 dan ST2) dan perairan Pulau Nias (Sumatera Utara) sebanyak 7 jenis (Sponge ST3, ST4, ST5, ST6, ST7, ST8 dan ST9). Selama distribusi ke laboratorium, sponge dibawa dalam kondisi beku. Pengambilan dan
pengumpulan sampel dilakukan oleh Departemen Kelautan dan Perikanan. Pemilahan sampel sponge dilakukan berdasarkan struktur visual sponge.
Isolasi Silika Spikula dari Sponge
Isolasi silika spikula dari 7 sampel sponge yang berasal dari perairan Pulau Nias dan 2 sampel sponge dari perairan Binuangeun, dilakukan dengan menggunakan metoda Shimizu et al. (1998). Metode ini berdasarkan pada pemisahan silika spikula yang tidak larut asam dari komponen lainnya. Pertama kali, sponge dibersihkan dengan air laut, dipotong dengan ukuran 1 cm3, dibleaching dengan perendaman dalam larutan hipoklorit jenuh (7%) selama 1 jam. Potongan tersebut dicuci dengan air bebas ion, dibersihkan dengan air ± 10 kali dan direndam dalam HNO3:H2SO4 3 N (1:4) semalam.
Bagian yang tidak larut asam (yang mengendap) dibilas dengan air bebas ion beberapa kali sampai pH diatas 6, dihilangkan airnya dan dicuci dengan aseton. Setelah itu dikeringudarakan dalam refrigerator. Ini adalah silika spikula. Bentuk silika spikula diamati secara mikroskopis.
Isolasi Protein dari Silika (Shimizu et al. 1998)
Isolasi protein dilakukan dengan melarutkan silika dalam buffer, sehingga proteinnya terlarut dalam buffer tersebut. Silika spikula yang telah diisolasi di atas direndam dalam buffer HF 2 M /NH4F 8 M (pH 5,0) sambil diaduk untuk melarutkan silika, sampai tidak terlihat adanya endapan. Untuk menghilangkan buffer HF, larutan ini didialisis dalam air bebas ion bersuhu 4oC selama 36 jam (selama waktu tersebut, air bebas ion diganti 9 kali). Dialisat disentrifugasi pada 6.000 xg selama 40 menit pada 4oC. Protein yang mengendap disuspensikan dalam air bebas ion atau buffer Tris-Cl pH 6,8 dan disimpan pada 10oC. Protein filamen diamati secara mikroskopis.
Penentuan Konsentrasi Protein
Penentuan konsentrasi protein dilakukan dengan menggunakan Metode Bradford (dye-binding method) (Dunn 1989). Protein sebanyak 100 µl yang
direaksikan dengan 2 ml Bradford (Bradford stok : air =1:19) akan menghasilkan warna biru yang ditangkap oleh spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm. Selanjutnya konsentrasi protein ditentukan dengan menggunakan persamaan linier dari kurva standar protein BSA (Bovine Serum Albumin). Kurva standar protein BSA dibuat dengan mereaksikan 100 µl larutan BSA berbagai konsentrasi BSA (20, 40, 60, 80,100.120, 140, 160,180 dan 200 µg/ml) dengan pereaksi Bradford, kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm. Sebagai blanko digunakan 100 µl aquades yang direaksikan dengan 2 ml Bradford (1:19).
Penghitungan Jumlah Protein per ml dengan Haemacytometer
Metode penghitungan haemacytometer umumnya digunakan untuk menghitung jumlah sel bakteri atau spora kapang dengan pengamatan di bawah mikroskop (Fardiaz 1989). Metode penghitungan ini menggunakan gelas objek haemacytometer yang mempunyai garis- garis seperti terlihat pada Gambar 3.1. Kotak terbesar berukuran 1 mm2. Kotak 1 mm2 yang terdapat pada bagian tengah dibagi menjadi 25 kotak (0,2 mm x 0,2 mm) yang masing- masing berisi 16 kotak kecil (0,05 mm x 0,05 mm). Jika gelas objek ini ditutup dengan gelas penutup, kedalaman di bawah gelas penutup adalah 0,1 mm (tinggi sampel 0,1 mm).
Sampel larutan protein diteteskan dalam gelas objek tersebut, kemudian ditutup dengan gelas penutup. Jumlah filamen protein dihitung pada kotak yang berukuran 0,2 mm x 0,2 mm (0,04 mm2) dengan tinggi sampel 0,1 mm. Dilakukan 5 kali penghitungan pada tempat yang berbeda, kemudian dibuat rata-rata. Jumlah filamen protein dalam 1 ml (1 cm3) dihitung sebagai berikut :
Jumlah filamen protein/mm2 = Rata-rata jumlah protein/0,04 mm2 x 25 Jumlah filamen protein/mm3= Rata-rata jumlah protein/mm2 x 1
0,1 mm
Jumlah filamen protein/ml = Rata-rata jumlah protein/mm3x 1000
Penentuan Berat Molekul dengan Teknik SDS-PAGE
Berat molekul protein ditentukan dengan menggunakan SDS/PAGE (Metode Laemmli 1970). Protein (10 – 15 µl) disuspens ikan dalam buffer sampel, diinkubasi pada 95oC selama 1 menit, dan dilarikan dalam gel poliakrilamid 10% (komposisi gel pada Lampiran 3), pada tegangan 100 V selama ±1 jam. Marker berat molekul LMW (Low molecular Weight) dari Amersham Bioscience yang tediri dari protein Phosphorylase b, albumin, ovalbumin, carbonic anhidrase, trypsin inhibitor, a-lactalbumin digunakan sebagai standar berat molekul yang juga dilarikan dalam gel. Gel diwarnani dengan silver staining untuk melihat protein yang terpisah dan kemudian ditentukan berat molekul berdasarkan standar protein. Prosedur silver staining secara lengkap pada Lampiran 4).
Reaksi Protein dengan Substrat TEOS (Cha et al. 1999)
Sebanyak 0,25 ml suspensi protein dalam buffer Tris-HCl pH 6,8 (dengan konsentrasi tris sebesar 25 mM) direaksikan dengan tetraethox yorthosilicate (TEOS, sebanyak 1ml; dengan konsentrasi 4,5 mmol/ml) sambil dishaker pada suhu kamar selama 12 jam, selanjutnya disentrifugasi untuk memisahkan produk silika (sebagai endapan).
Analisis Hasil Reaksi dengan Colorimetric Molybdate Assay (Strickland and Parsons 1972)
Pelet yang dihasilkan dari hasil reaksi dicuci minimal 3 kali dengan etanol untuk menghilangkan TEOS yang tidak bereaksi, kemudian disentrifugasi kembali. Pelet dilarutkan dalam 1 ml 1 M NaOH pada 85-95oC selama 30 menit untuk menghitung jumlah residu TEOS yang terpolimerisasi. Larutan dibiarkan selama 24 jam untuk membiarkan terjadinya pelarutan silika. Penghitungan asam silikat yang dilepaskan dilakukan dengan colorimetric molybdate assay yang dimodifikasi dengan pelarut Brzezinski dan Nelson (1986) yang dapat mendeteksi Si(OH)4 sampai dengan 50 mM.
Colorimetric molybdate assay dilakukan dengan cara mereaksikan 0,2 ml sampel dengan 0,4 ml larutan ammonium molibdat, dan dicampurkan selama 10
menit. Setelah 10 menit, ditambahkan 0,6 ml reduction reagent (campuran metol sulfit, H2SO4 50%, asam oksalat jenuh dan air bebas ion), lalu divorteks. Setelah 3 jam, dilakukan pengukuran dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 810 nm. Sebagai kurva standar digunakan berbagai konsentrasi Si (larutan TEOS dalam DMSO dengan konsentrasi TEOS 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 dan 225 µmol/ml DMSO) dan sebagai blanko digunakan 0,2 ml air bebas ion yang diberi perlakuan yang sama.
Hasil reaksi diamati dalam mikroskop, dan dilakukan foto dengan JEOL JSM-5310LV Scanning Electron Microscopy yang sebelumnya dicoating dengan JEOL JFC-1200 Fine Coater. Proses ini dilakukan di Laboratorium Material Science, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan, Universitas Indonesia.