3.1 Tempat dan Waktu
Pengambilan contoh tanah dan akar tanaman dilakukan di kawasan hutan pantai Pulau Pandang Kabupaten Batu Bara pada bulan Maret 2009. Ekstraksi dan identifikasi spora serta penghitungan kolonisasi fungi mikoriza pada akar tanaman contoh dilakukan di Laboratorium Biologi Tanah dan Laboratorium Bioteknologi Kehutanan Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara.
3.2 Bahan dan Alat
Dalam penelitian ini digunakan contoh tanah dan akar tanaman dari hutan pantai. Untuk ekstraksi dan identifikasi spora fungi mikoriza digunakan bahan berupa larutan glukosa 60%, larutan Melzers sebagai bahan pewarna spora dan larutan polyvinyl lacto glycerol (PVLG) sebagai bahan pengawet spora. Sedangkan untuk pewarnaan akar digunakan bahan-bahan kimia antara lain, yaitu KOH 10%, HCl 2%, larutan pewarna (Staining: gliserol, asam laktat dan trypan blue), dan aquades.
Alat-alat yang digunakan untuk pengambilan contoh tanah dan akar tanaman adalah kompas, tali plastik, cangkul, kantong plastik dan spidol serta kertas label, sedangkan peralatan untuk pengamatan di laboratorium adalah saringan 425 µm, 212 µm, 106 µm, dan 53 µm, tabung sentrifuse, cawan petri,
pinset spora, mikroskop binokuler, mikroskop cahaya, kaca preparat, dan kaca penutup.
3.3 Pengambilan Contoh Tanah dan Akar
Pengambilan contoh tanah dan akar tanaman menggunakan metoda jalur atas dasar gradien salinitas. Jalur dibuat sepanjang 120 m dengan lebar 5 m dari garis pantai menuju ke daratan. Jalur dibagi dalam 6 petak dengan ukuran panjang setiap petak 20 m dan lebar 5 m. Jumlah jalur yang dibuat sebanyak 3 jalur dengan jarak antar jalur sekitar 200 m. Pada masing-masing petak dalam jalur diambil contoh tanah sebanyak 600-700 g dari zona rizosfir, yaitu pada kedalaman 0-20 cm. Selain itu juga diambil 3 jenis anakan yang dominan pada setiap petak ukur untuk mempelajari kolonisasi fungi mikoriza pada setiap petak ukur. Dari contoh tanah yang diambil juga dilakukan analisis tingkat salinitas tanah dengan metoda daya hantar listrik.
3.4 Ekstraksi dan Identifikasi Spora Fungi Mikoriza Arbuskula
Ekstraksi spora fungi mikoriza dilakukan untuk memisahkan spora dari sampel tanah dan mengidentifikasinya yaitu dengan teknik tuang saring dari Pacioni (1992) dan dilanjutkan dengan sentrifuse (Brundrett et al., 1996). Prosedur kerja secara lengkap adalah sebagai berikut: tanah sebanyak 50 g dicampur dengan 200-300 ml liter air dan diaduk sampai butiran tanah hancur. Campuran tanah dan air tersebut disaring dalam 1 set saringan dengan ukuran 425 µm, 212 µm, 106 µm dan 53 µm secara berurutan dari atas ke bawah. Dari saringan atas disemprot dengan air untuk memudahkan bahan pada saringan
lolos. Partikel yang tertahan pada saringan terbawah dipindahkan ke dalam tabung sentrifuse lalu tambahkan larutan glukosa 60% yang diletakkan pada bagian bawah dari larutan tanah dengan menggunakan pipet. Tabung sentrifuse ditutup rapat dan disentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm selama 3 menit, kemudian larutan supernatan dituang ke dalam saringan 53 µm dan dicuci dengan air untuk menghilangkan glukosa yang tersisa dalam saringan lalu dituangkan ke dalam cawan petri dan kemudian diamati bawah mikroskop. Selanjutnya spora yang diperoleh dihitung jumlahnya, kemudian diletakkan dalam larutan pewarnaan Melzers dan pengawetan polyvinil lacto glyserol yang terpisah pada satu kaca
preparat. Spora tersebut dipecahkan secara hati-hati dengan menekan kaca penutup dengan menggunakan ujung lidi, adanya perubahan warna spora adalah salah satu indikator untuk menentukan jenis spora.
3.5 Kolonisasi FMA pada Akar Tanaman Sampel
Akar halus segar dengan diameter 0,5 mm dicuci dengan air mengalir sampai
bersih, lalu akar sampel direndam dalam larutan KOH 10% selama 24 jam. Kemudian larutan KOH dibuang dan akar dicuci dengan air lalu direndam dengan larutan HCl 2% selama 24 jam (Kormanik dan McGraw, 1982). Selanjutnya akar sampel direndam dalam larutan trypan blue dan digantikan dengan larutan lacto glycerol untuk proses destaining (pengurangan warna). Penghitungan persentase kolonisasi akar menggunakan metode panjang akar terkolonisasi secara acak, diambil potongan akar yang telah diwarnai letakkan di
kaca preparat (Giovanneti dan Mosse, 1980). Secara skematis alur kerja kolonisasi fungi mikoriza pada akar tanaman disajikan pada lampiran 2.
Persentase kolonisasi akar dihitung dengan menggunakan rumus.
% 100 uruhan dang_kesel bidang_pan ) nda_( dang_berta bidang_pan akar kolonisasi % = + ×
∑
∑
3.6 Pemerangkapan (Trapping culture)
Teknik pemerangkapan digunakan mengikuti metode Brundreet et al., (1994).
Setiap contoh tanah dibuat 3 pot kultur sehingga terdapat 90 pot kultur. Media tanam pot kultur berupa campuran contoh tanah 50 g dan pasir sebanyak 150 g, selanjutnya benih Purieria javanica ditaruh dalam lubang tanam yang sudah diisi dengan pasir-tanah dan ditutup lagi dengan pasir (lampiran 3). Tanaman diberi larutan NaCl dengan konsentrasi yang sesuai dengan data di lapangan dan frekuensi pemberian 1 x 2 minggu. Perlakuan ini bertujuan untuk mengurangi kemungkinan terjadinya perubahan salinitas tanah dibandingkan dengan ekosistem aslinya. Setiap 2 hari sekali disiram dan diberi hara Hyponex merah dengan konsentrasi 1 g. l-1 setiap minggu. Pemeliharaan tanaman dilakukan
selama 8 minggu, selanjutnya dibiarkan tanaman sampai mati, setelah itu dilakukan pemanenan tanah untuk mengamati spora.
3.7 Pengamatan
Hasil pengamatan yang diperoleh dilakukan secara deskriptif dan menyajikan
tabel-tabel hasil identifikasi genus-genus fungi mikoriza serta nama tanaman yang menjadi inangnya. Parameter pengukuran adalah sebagai berikut:
1). Tingkat salinitas tanah dan pH
Untuk mengetahui tingkat salinitas tanah maka dilakukan pengukuran dengan menggunakan metode daya hantar listrik.
2). Jumlah spora dan tipe spora
Untuk menghitung kepadatan spora dan tipe spora maka dilakukan dengan pengamatan preparat sesuai dengan yang sudah dijelaskan pada poin 3.4. Selain itu data yang diperoleh dihitung frekuensi mutlak (FM), frekuensi relatif (FR), secara rinci rumus tersebut adalah sebagai berikut:
1. Frekuensi Mutlak (FM - %) 100% Contoh Petak Sub Seluruh Spesies Ditemukan Petak Sub (FM) Mutlak Frekuensi = ×
∑
∑
2. Frekuensi Relatif (FR – 100%) 100% × spesies satu ditemukan frekuensi Total spesies satu ditemukan Frekuensi (FR) Relatif Frekuensi =3). Persentase kolonisasi akar
Penghitungan kolonisasi akar menggunakan metode panjang akar seperti yang sudah dijelaskan pada poin 3.5.
BAB IV