alat yang digunakan dalam percobaan lain alat-alat gelas, kuvet, pipet mikro, bung Eppendorf, sentrifus, spektrofotometer s, bulp, penangas air, gegep, oven, , mikrofus Beckman. Bahan–bahan digunakan dalam analisis konsentrasi peroksida darah adalah 1,1,3,3- toksipropana (TMP), asam biturat (TBA) 1% (b/v) dalam asam 50%, n-butanol:piridin 15:1, akuades, n H2SO4, larutan HCl, asam
ungstat, kertas tisu dan aluminum foil. l yang digunakan adalah serum darah
(a)
r 7 Lempuyang gajah (a) tumbuhan lem uk ng isi gat et ya au ng pi 2002). ndung as er, itu ponin. an n, ri, kan an o, ter n, han si - m m s, m . ah
tikus putih jantan galur Sprague
diperoleh dari Program Kreativi bidang Penelitian (PKMP) yan DIKTI tahun 2009 atas nama Novita Sari, Feni Tri Asmoro, R dan Lutfi Anshori dibimbing Sulistiyani, M.Sc., Ph.D. deng Herbal dari Campuran Lem (Zingiber zerumbet L.) dan (Camellia sinensis) Antihiperkolesterolemia (Ariya
Metode Penelitian Hewan Coba dan Rancangan (Ariyani 2010)
Penelitian ini menggunakan putih jantan galur Sparague
dikelompokkan menjadi 2 kelom ke-0 hingga minggu ke-6), y normal (N) yang terdiri atas 6 kelompok pakan kolesterol (HK atas 20 ekor tikus. Kemudian ke-7 hingga minggu ke-10, ke coba menjadi 4 kelompok, yai kelompok HK dibagi menjadi yaitu kelompok hiperkolesterol n=6), kelompok teh herbal dos n=7), dan kelompok teh herba III, n=7). Kelompok norm kelompok yang hanya diberi dan akuades mulai minggu minggu ke-10. Kelompok HK HK III merupakan kelompok pakan kolesterol (1.5%) dan dengan dosis 0.5 mg/kg BB mulai dari minggu ke-0 hingga
(b)
mpuyang gajah dan (b) rimpang lempu
7
ague Dawley yang ivitas Mahasiswa ang didanai oleh a Raiza Ariyani, o, Rezana Falachi, bing oleh drh. dengan judul Teh mpuyang Gajah dan Teh Hijau sebagai yani 2009). tian
gan Percobaan kan 26 ekor tikus
ague Dawley yang lompok (minggu , yaitu kelompok 6 ekor tikus dan HK) yang terdiri n mulai minggu kelompok hewan yaitu normal dan adi 3 kelompok, erolemia (HK I, dosis 1 (HK II, bal dosis 2 (HK mal merupakan ri pakan standar u ke-0 hingga K I, HK II, dan pok yang diberi n PTU (0.01%) yang diberikan ngga minggu ke-6.
Kemudian mulai minggu ke-7 hingga minggu ke-10 pakan kolesterol dan PTU dihentikan dan diganti dengan pakan standar. Kandungan nutrisi yang terdapat dalam pakan standar tersebut antara lain protein (18%), karbohidrat (8%), lemak (7%), serat (6%), fosfor (1%) dan kalsium (0.5%). Kelompok HK II dan kelompok HK III merupakan kelompok perlakuan ekstrak teh herbal lempuyang gajah dengan dosis yang berbeda untuk masing-masing kelompok. Kelompok perlakuan ekstrak teh herbal dicekok ekstrak seduhan teh herbal lempuyang gajah mulai minggu ke-7 sampai minggu ke-10. Kelompok HK II dan kelompok HK III masing-masing dicekok teh herbal dengan dosis 14.29 mg/kg BB dan 21 mg/kg BB.
Semua tikus diadaptasikan selama 7 hari untuk menyeragamkan cara hidup dan makanannya. Makanan hewan percobaan diberikan sebanyak 20 gram/ekor/hari, baik pakan standar maupun pakan kolesterol dan air minum diberikan secara ad libitum (selalu tersedia). Bobot badan ditimbang tiap minggu, sedangkan pakan sisa ditimbang setiap hari. Analisis lipid peroksida dilakukan pada sampel serum darah minggu ke-0, 2, 4, 6, 8, dan 10.
Pembuatan Teh Herbal
Teh herbal lempuyang gajah terdiri atas simplisia lempuyang gajah dan teh hijau yang diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (Balittro), Bogor. Adapun cara pembuatan teh herbal tersebut adalah teh hijau dan simplisia lempuyang gajah (Ariyani 2010) tersebut dikemas dalam kantung teh celup. Sesuai dengan Ariyani (2010), teh herbal lempuyang gajah mengandung lempuyang gajah:teh hijau yaitu dosis 1 sebanyak 1:2 dan dosis 2 sebanyak 2.5:2. Lempuyang gajah yang digunakan dalam penelitian ini jumlahnya lebih banyak daripada yang digunakan oleh Yasni et al (1996), yaitu hanya setengah dari dosis 1.
Masing-masing dosis teh herbal diseduh dengan air panas (100˚C) selama 5 menit. Lalu seduhan dikeringkan dengan rotavapor
pada suhu 50˚C selama 2 jam hingga diperoleh ekstrak seduhan teh herbal. Rendemen yang diperoleh dari ekstrak teh herbal 1 dan 2 yaitu 0.17% dan 0.16% (Ariyani 2010).
Pembuatan Pakan Kolesterol
Pakan kolesterol dibuat dari kolesterol tepung kuning telur 1.5%, lemak kambing 5%, minyak goreng curah 6%, dan pakan
standar hingga 100%. Semua bahan diaduk sampai tercampur rata, dan dijadikan bentuk pelet seperti bentuk pakan standar. Tepung kolesterol dipersiapkan dari kuning telur ayam negeri, yaitu digunakan sebanyak 48 kg telur ayam. Kuning telur dipisahkan dari putihnya, lalu direbus hingga matang (± 15 menit). Setelah matang, kuning telur dibersihkan dari selaput lendirnya dan digerus sampai halus kemudian dikeringkan dalam oven 70˚C (± 24 jam) sambil sesekali digerus lagi hingga benar-benar kering dan halus (Kristiani 2003). Tepung kuning telur kemudian diukur konsentrasi kolesterolnya dengan menggunakan metode Lieberman-Buchard (Kenny 1952). Tabung sentrifus 15 mL diisi dengan 12 mL campuran alkohol:eter (3:1). Kemudian dimasukkan 0.02 g tepung kuning telur ayam diaduk perlahan sampai semua bercampur. Tabung ditutup rapat dan didiamkan selama 15 menit. Selanjutnya tabung disentrifugasi pada 1600 g (3000 rpm) selama 3 menit. Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke dalam gelas piala ukuran 50 mL, lalu diuapkan pada penangas air mendidih sampai supernatan kering. Kemudian residu yang tersisa ditambahkan 2 mL kloroform dan dikocok perlahan agar residu terekstrak, kemudian ekstraknya dipindahkan ke dalam tabung sentrifus. Lalu gelas piala tadi dibilas lagi dengan 2 mL kloroform. Lalu ukuran ekstrak ditepatkan menjadi 5 mL dengan kloroform untuk standar kolesterol diambil sebanyak 5 mL, dan blanko kloroform 5 mL, lalu ditempatkan ke dalam tabung sentrifus kemudian ditambahkan 2 mL asetat anhidrida dan 0.1 mL asam sulfat pekat pada semua tabung, lalu dikocok. Kemudian tabung disimpan di dalam ruang gelap selama 15 menit dan larutan diukur absorbansinya pada panjang
gelombang (λ) 420 nm dengan menggunakan spektrofotometer uv.
Pengambilan Sampel Darah
Sesuai dengan Ariyani et al (2009), Sebelum dilakukan pengambilan darah, tikus dipuasakan terlebih dahulu kurang lebih 16 jam. Pengambilan darah tikus dilakukan 2 minggu sekali pada masa percobaan. Bagian ujung ekor dibersihkan dengan alkohol 70% dan diolesi anastesi topical xylocaine. Lalu ekor disayat kira-kira 5 mm dari bagian ujung ekor, ekor tikus diurut perlahan-lahan sampai darahnya keluar ± 1 mL sambil ditampung dalam tabung Eppendorf lalu diletakkan pada suhu 0 ˚C. Darah dibiarkan selama 24 jam pada suhu 4˚C agar diperoleh serum.
9
Kemudian disentrifus pada kecepatan 1600 g (3000 rpm) selama 10 menit.
Pengukuran Lipid Peroksida Serum Darah (Modifikasi Yagi 1994)
Penentuan Kurva Standar. Konsentrasi lipid peroksida darah yang terukur dalam percobaan merupakan kompleks yang terbentuk dari dua molekul asam tiobarbiturat (tiobarbituric acid, TBA) akan berikatan dengan satu molekul malondialdehida (MDA). Kurva standar dibuat dengan menggunakan larutan 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP) yang diasumsikan sebagai MDA yang terbentuk di dalam darah tikus, dengan konsentrasi 0.9, 1.8, 2.7, 3.6, 4.5 dan 6.0 µM. Kemudian larutan dipipet sebanyak 2 mL dan ditambahkan 0.5 mL asam tiobarbiturat (TBA) 1% dalam asam asetat glasial 50%. Campuran diletakkan di dalam penangas air bersuhu 95˚C selama 60 menit dan didinginkan pada suhu ruang.
Setiap tabung diberi 0.5 mL akuades dan 2.5 mL n-butanol:piridin (15:1 v/v), dikocok dengan kuat. Kemudian disentrifugasi pada kecepatan 1600 g (3000 rpm) selama 15 menit. Fase organik yang terdapat pada lapisan atas diambil dan diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum 533 nm menggunakan spektrofotometer.
Analisis Sampel Lipid Peroksida Serum Darah. Serum darah yang akan dianalisis merupakan serum darah yang diperoleh dari PKMP yang dilakukan oleh Ariyani et al
(2009). Sampel (serum darah tikus) yang dipanaskan bersama dengan TBA pada pH rendah akan membentuk komples yang berwarna merah muda, kemudian serapannya diukur menggunakan spektrofotometer UV- Vis pada panjang gelombang maksimum 533 nm.
Sebanyak 0.3 mL serum darah ditempatkan di dalam tabung sentrifus dan ditambahkan 1.2 mL H2SO4 1/12N lalu
dicampur. Kemudian sebanyak 0.15 mL asam fosfotungstat 10% ditambahkan. Setelah itu, larutan didiamkan pada suhu ruang selama 5 menit lalu disentrifus pada kecepatan 1600 g (3000 rpm) selama 20 menit. Peletnya dicampur dengan 1.2 mL H2SO4 1/12N,
kemudian didiamkan selama 10 menit pada suhu ruang. Sebanyak 0.15 mL asam fosfotungstat 10% ditambahkan dan didiamkan selama 5 menit pada suhu ruang, lalu disentrifus pada kecepatan 1600 g (3000 rpm) selama 15 menit. Peletnya disuspensi dengan 2 mL akuades dan ditambahkan 0.5 mL asam tiobarbiturat (TBA) 1% dalam asam
asetat glasial 50%. Campuran diletakkan di dalam penangas air bersuhu 95˚C selama 60 menit, kemudian didinginkan pada suhu ruang. Setiap tabung diberi 0.5 mL akuades (pH campuran 1.6-1.7), lalu ditambahkan 2.5 mL n-butanol:piridin (15:1 v/v), dikocok dengan kuat. Kemudian disentrifugasi pada kecepatan 1600 g (3000 rpm) selama 15 menit. Lalu fase yang terbentuk pada lapisan atas (yang berwarna merah muda) diambil dan diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum 533 nm dengan spektrofotometer uv-vis.
Pengukuran Lipid Peroksida Hati (Vernanda 2010)
Pembuatan Homogenat Hati. Hati beku yang telah disimpan di dalam lemari beku dicairkan pada suhu ruang selama beberapa menit hingga hati agak mencair. Kemudian hati diambil ± 2 gram untuk dibuat menjadi homogenat sebanyak 10 mL dalam larutan KCl dingin 1.5%. Lalu homogenat diambil sebanyak 0.1 mL dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang bertutup dan dilapisi
aluminum foil.
Pembuatan Kurva Standar. Kurva standar dibuat menggunakan larutan stok pereaksi TMP 6M yang diencerkan dengan akuades menjadi 60 µM kemudian dibuat konsentrasinya menjadi 0.6, 0.9, 1.5, 3.0, 4.5, dan 6.0 µM. Larutan masing-masing konsentrasi dipipet sebanyak 4 mL ke dalam tabung reaksi. Kemudian tiap tabung ditambah 1 mL TBA 1% dalam pelarut asam asetat 50%. Setelah itu, dipanaskan di penangas air hingga mendidih pada suhu 95˚C selama 60 menit, lalu didinginkan pada suhu kamar. Kemudian tiap tabung ditambah 1 mL akuades dan 5 mL n-butanol:piridin (15:1 v/v), diaduk dengan vorteks, lalu disentrifugasi pada 3000 rpm selama 15 menit. Lapisan atas yang terbentuk pada larutan diambil, kemudian serapannya diukur pada panjang gelombang 532 nm dengan spektrofotometer.
Analisis Lipid Peroksida Hati. Homogenat hati yang telah dibuat, ditambah dengan 0.2 mL SDS 8.1% dan 1.5 mL asam asetat 20% ke dalam tiap tabung dan diatur pHnya dari 2.5 menjadi 3.5 dengan NaOH 1 M dengan menggunakan pH meter. Tiap tabung reaksi ditambah dengan 0.7 mL akuades dan 1.5 mL TBA 1.0% dalam pelarut asam asetat 50%, kemudian dipanaskan ke dalam penangas air pada suhu 950C selama 60 menit, dan didinginkan pada suhu ruang. Tiap tabung reaksi ditambah 1 mL akuades dan 5
mL n-butanol:piridin (15:1 v/v), diaduk dengan vorteks, disentrifus pada 4000 rpm selama 10 menit, diambil lapisan atasnya, dan diukur serapannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 532 nm.
Analisis data (Mattjik & Sumertajaya 2002)
Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini diperoleh secara statistik, menggunakan metode Rancangan Acak Lengkap (RAL). Model rancangan tersebut adalah:
Yij = µ + τi + εij
Keterangan:
Yij = pengamatan perlakuan ke-i dan ulangan ke-j
µ = pengaruh rataan umum
τi = pengaruh perlakuan ke-i, i = 1,2,3,4
εij = pengaruh galat perlakuan ke-i dan
ulangan ke-j, j = 1,2,3,4,5,6
i1 = kelompok normal yang hanya diberi
akuades
i2 = kelompok negatif atau kelompok
hiperlipidemia yang diberi pakan hiperlipidemia, induksi PTU dan akuades
i3 = kelompok yang diberi pakan
hiperlipidemia, induksi PTU, dan ekstrak teh herbal dengan dosis 1 i4 = kelompok yang diberi pakan
hiperlipidemia, induksi PTU, dan ekstrak teh herbal dengan dosis 2 Data dianalisis menggunakan program Microsoft Office Excel 2007 dengan metode
t-test dan program SPSS 17.0 dengan metode analisis korelasi data dan Analysis of Variance
(ANOVA). Bila terdapat perbedaan dalam perlakuan, maka dilakukan uji Duncan.