3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juni 2007 – Desember 2008 di Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman, Laboratorium BIORIN Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi Institut Pertanian Bogor, dan Laboratorium Terpadu, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Perlakuan cekaman pH dan Al dilakukan di rumah kaca Institut Pertanian Bogor.
3.2 Bahan Penelitian
M. affine L. digunakan sebagai bahan tanaman. Primer forward (MF) 5’TCGAGAAAAATGTCTTGCTGTG3’ dan primer reverse (MR1) 5’GTCTCGCCGGAGAATCCCAAG3’ yang didesain dari MaMt2 (Suharsono et al. 2009) menghasilkan produk sebesar 113 pb digunakan untuk analisis ekspresi MT2. Primer forward (ActF) 5’ATGGCAGATGCCGAGGATAT3’ dan primer reverse (ActR2) 5’TCGAGGTCGGCCAACAATAC3’ yang didesain dari gen β actin kedelai (Shah et al. 1982) dan menghasilkan produk sebesar 123 pb, digunakan sebagai pembaku dalam analisis ekspresi. Primer forward (ActF) 5’ATGGCAGATGCCGAGGATAT3’ dan primer reverse (ActR) 5’CAGTTGTGCGACCACTTGCA3’ yang didesain dari gen β actin kedelai (Shah et al. 1982), digunakan untuk mengetahui kontaminasi DNA genom pada cDNA.
3.3 Metode
Penelitian ini dilakukan dengan melalui beberapa tahapan yaitu perlakuan cekaman pH dan Al rendah pada kultur air, isolasi RNA total dari M. affine L, sintesis cDNA total, dan analisis ekspresi gen dengan menggunakan Real Time PCR.
3.3.1 Perlakuan cekaman pada kultur air
Bahan tanam yang digunakan berasal dari stek pucuk tanaman M. affine L. yang diambil dari Jasinga, Kabupaten Bogor, Jawa Barat. Pengadaan stek pucuk dilakukan dengan memotong 4 - 6 ruas dari pucuk tanaman. Pucuk ditanam pada tanah Jasinga dan ditutup dengan plastik selama seminggu untuk mengurangi penguapan. Setelah itu, tutup plastik dibuka dan dibiarkan selama sebulan sampai tumbuh akar. Selanjutnya pucuk yang mempunyai akar kurang lebih 1 cm ditanam pada tempat yang berisi larutan nutrisi standar pH 6 dengan komposisi NH4NO3 2,14 mM; NaH2PO4 3,2 µM; K2SO4 : KCl (1:1) 0,77 mM; CaCl 1,2 mM; MgSO4 0,82 mM; FeSO4 35,8 µM; MnSO4 9,1 µM; H3BO3 46,3 µM; ZnSO4 3,1 µM; CuSO4 0,16 µM; (NH4)6Mo7O24 0,05 µM (Watanabe et al. 1998) dan diberi aerasi, selama seminggu. Setelah satu minggu, tanaman siap untuk diberi perlakuan cekaman pH dan Al.
Percobaan dilakukan dengan dua macam perlakuan dan dua ulangan. Perlakuan yang diberikan adalah pH dan konsentrasi Al. Perlakuan pH menggunakan 2 tingkat, yaitu pH 6 (kontrol) dan 4. Sedangkan perlakuan konsentrasi Al yang diberikan adalah 0 mM (kontrol), 0,8 mM dan 3,2 mM yang dilakukan pada pH 4. Sampel berupa daun dan akar diambil 1 minggu setelah perlakuan untuk isolasi RNA total agar didapatkan ekspresi gen yang sesungguhnya.
3.3.2 Isolasi RNA total dari Melastoma affine L.
RNA total diisolasi dari akar dan daun secara terpisah, dari dua ulangan dan dua macam perlakuan, menggunakan metode CTAB (Chang et al. 1993) yang dimodifikasi. Untuk itu, 1 g bahan tanaman digerus didalam 10 ml buffer ekstraksi (CTAB 2%; Tris pH 9,5 0,1 M; EDTA 20 mM; NaCl 1,4 M; PVP 25000 2%; dan β-mercaptoethanol 1%) hangat hingga membentuk suspensi sel. Suspensi sel dimasukkan ke tabung 20 ml dan diinkubasi pada suhu 65oC selama 10 menit, kemudian didinginkan, dan ditambah 10 ml kloroform: isoamil alkohol (24 : 1). Setelah dicampur dengan menggunakan vortex, campuran disentrifugasi dengan kecepatan 42000xg (rotor SW11, Sorval Ultra Pro 80) pada suhu 4oC selama 10 menit. Cairan bagian atas dipindahkan ke tabung 20 ml, ditambahkan ¼
volume LiCl 10 M dan diinkubasi pada suhu -32oC selama 2,5 jam. Campuran disentrifugasi pada kecepatan 42000xg pada suhu 4oC selama 10 menit. Cairan dibuang dan endapan RNA total disuspensikan dalam 500 µl TE 1X (Tris HCl pH 7,4 10 mM dan EDTA 1 mM) kemudian dipindahkan ke tabung 1,5 ml. Suspensi RNA total diekstraksi dengan penambahan 1X volume fenol pH 9, divortex dan disentrifugasi pada kecepatan 8000xg (Jouan BR4i) pada suhu 20oC selama 10 menit. Cairan bagian atas yang mengandung RNA total diambil, dimasukkan dalam tabung 1,5 ml, dan diekstraksi kembali dengan 1X volume fenol : kloroform : isoamil alkohol (25:24:1), divortex dan disentrifugasi pada kecepatan 8000xg (Jouan BR4i) pada suhu 20oC selama 10 menit. Cairan bagian atas diambil, dimasukkan dalam tabung 1,5 ml, ditambah ¼X volume LiCl 10 M dan kemudian diinkubasi pada suhu -32oC selama 2,5 jam. Cairan disentrifugasi pada kecepatan 8000xg pada suhu 4oC selama 15 menit. Cairan dibuang dan endapan RNA total dibilas dengan penambahan 500 µl ethanol 70 % dan disentrifugasi pada kecepatan 5000xg pada suhu 4oC selama 10 menit. Endapan RNA total dikeringkan dengan pengering vakum dan disuspensikan dengan 20 µl DEPC H2O. Keutuhan RNA total diuji dengan melakukan elektroforesis RNA total di gel agarose 1 % dalam buffer MOPS 1X (MOPS 4,2 g/l; Na asetat 0,41 g/l; Na2EDTA 0,37 g/l). Visualisasi RNA total dilakukan di atas UV transluminator GelDoc (Labquip) setelah diwarnai dengan EtBr (0,5 g/ml) selama 30 menit dan dibilas dengan air.
3.3.3 Pembentukan cDNA total
Untuk mendapatkan RNA yang bebas dari DNA genom, suspensi RNA total diberi Dnase sebelum sintesis cDNA dengan mencampur 5 µg RNA total, buffer Dnase I 1X, Dnase I bebas RNase (Fermentas) 0,2 U, dan DEPC H2O sampai volume total mencapai 10µl. Larutan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Setelah itu ditambahkan EDTA 2,5 mM dan diinkubasi kembali pada suhu 65oC selama 10 menit.
Sintesis cDNA total dilakukan dengan mencampur 5 g RNA total, First- Strand Reverse Transcriptase Buffer 1X, oligo (dT) 20 pmol, dNTP 4 mM, DTT 10 mM, enzim SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen) 40 U, dan
DEPC-H2O dengan volume reaksi 20 µl. Proses sintesis cDNA dilakukan dengan alat PCR (MJ Research TM 100) dengan menginkubasi campuran pada suhu 30oC selama 10 menit, kemudian inkubasi pada suhu 42oC selama 50 menit, inkubasi pada suhu 95oC selama 5 menit dan 20oC selama 5 menit.
Keberhasilan dan kemurnian sintesis cDNA total dan kemurnian cDNA total dari DNA genom diverifikasi dengan menggunakan PCR menggunakan primer forward ActF dan primer reverse ActR yang spesifik untuk ekson1 – ekson2 dari aktin. Reaksi PCR yang digunakan adalah 1 µl cDNA total, Taq buffer 1X, dNTP mix 4 mM, ActF 20 pmol dan ActR 20 pmol, enzim Taq DNA polimerase (RBC) 0,5 U, DMSO 4% dan dH2O sampai volume akhir 10 µl. PCR dilakukan dengan kondisi pra-PCR pada 94oC, 5 menit; denaturasi pada 94oC, 30 detik; penempelan primer pada 55oC, 30 detik; pemanjangan pada 72oC, 1,5 menit; pasca PCR pada 72oC, 7 menit; dan pendinginan 20 oC, 5 menit. PCR dilakukan sebanyak 30 siklus. Amplifikasi gen β actin ekson1-ekson2 dengan menggunakan DNA genom melastoma sebagai cetakan digunakan sebagai kontrol terjadinya kontaminasi terhadap sintesis cDNA. Keberhasilan sintesis cDNA diketahui dari terbentuknya pita berukuran 450 pb. Bila terjadi kontaminasi DNA genom pada cDNA, maka akan didapatkan 2 pita yang masing-masing berukuran 450 pb (dari cDNA) dan 550 pb (dari DNA genom).
3.3.4 Analisis ekspresi gen dengan menggunakan Real Time PCR
Real Time PCR dilakukan dengan komposisi 5 µl cDNA, Power SYBR Green PCR master mix 1X, primer MF atau ActF 50 nM, primer MR1 atau ActR2 50 nM dalam total reaksi 50 µL. Reaksi dilakukan untuk dua jenis gen, yaitu MaMt2 sebagai gen target dan aktin sebagai gen pembaku. Deteksi ekspresi gen dilakukan dengan menggunakan mesin Real Time PCR ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystem). Amplifikasi gen target dengan menggunakan sistem touchdown PCR, yaitu dengan kondisi aktivasi enzim taq pada suhu 95oC selama 10 menit, kemudian diikuti dengan touchdown PCR yaitu denaturasi pada suhu 95oC selama 15 detik, annealing pada suhu 65oC selama 30 detik, dan sintesis DNA pada suhu 72oC selama 30 detik, dimana suhu annealing diturunkan 2oC setiap 3 siklus dari suhu awal 65oC sampai suhu annealing
mancapai 55oC. Saat suhu annealing mencapai 55oC, proses PCR dilakukan sebanyak 30 siklus.
Hasil dari Real Time PCR berupa kurva amplifikasi dari masing-masing reaksi dianalisa dengan menggunakan program Relative Quantification Study dengan metode CT berdasarkan metode Livak (2001). Dari kurva amplifikasi dapat diperoleh nilai CT dari masing-masing reaksi. Nilai CT dari masing-masing perlakuan diperoleh dari normalisasi gen target dengan gen pembaku yaitu dengan cara pengurangan nilai CT gen MT2 sebagai gen target dengan nilai CT gen aktin sebagai gen referensi, sehingga rumus untuk mendapatkan CT adalah : CT = CT MT2 – CT actin. Sedangkan nilai CT diperoleh dengan cara pengurangan nilai CT dari perlakuan dan nilai CT dari kalibrator (kontrol). Dalam penelitian ini terdapat dua kontrol yaitu pH 6 untuk mengetahui pengaruh perlakuan pH pada ekspresi gen MT2 dan pH 4 dengan 0 mM Al untuk mengetahui pengaruh cekaman aluminium pada ekspresi gen MT2. Selanjutnya nilai CT tersebut akan digunakan untuk mengetahui ekspresi (RQ) gen MT2 pada perlakuan relatif terhadap kontrol dengan memasukkannya dalam rumus aritmatika 2 – CT. Analisis ekspresi gen dengan menggunakan Real Time PCR ini diulang 2 kali dan nilai RQ antar perlakuan dianalisis dengan menggunakan program Statistical Product and Service Solution (SPSS) 13.0 for windows. Amplikon hasil dari Real Time PCR, dicek pada gel agarose untuk mendapatkan ekspresi secara semikuantitatif dan kualitas pita DNA.