Bahan
Bahan yang digunakan adalah sampel darah dan otot dari mencit rumah (M.m castaneus) dari beberapa lokasi di Jakarta (10 ekor), Bandung (11 ekor) dan Surabaya (9 ekor) (lampiran 2). Total sampel 30 ekor.
Metode
Pengambilan sampel. Darah diambil dari jantung menggunakan syringe yang telah berisi ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) 10% yang kemudian disimpan di suhu rendah sebelum diisolasi. Sedangkan untuk sampel dari otot menggunakan otot yang berasal dari femur M.m castaneus yang sudah dikuliti terlebih dahulu.
Ekstraksi dan isolasi DNA. Ekstraksi fenol adalah prosedur umum yang digunakan untuk isolasi sampel DNA (Sambrook & Russel 2001). Sampel darah sebanyak 250- 500 ì l dalam tabung eppendorf 1,5 ml ditambah lysis buffer dengan volume yang sama dan dikocok sampai homogen. Disentrifuse selama 1 menit pada 6500 rpm. E ndapan ditambah dengan 200 ì l rinse buffer
kemudian divortex. 500 ì l digestion buffer ditambahkan pada tabung dan dikocok hingga homogen lalu diinkubasi semalam pada suhu 55oC. Kemudian 500 ì l fenol ditambahkan dan dikocok selama ± 20 menit lalu disentrifuse 3 menit pada 13.000 rpm. Supernatan dipindahkan ke tabung baru lalu ditambahkan 500 ì l Chloroform isoamil alkohol (CIAA) kemudian dikocok selama ± 20 menit. Lalu disentrifuse 13.000 rpm selama 3 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung baru. Jika sampel berasal dari otot, maka perlakuan fenol dan CIAA dilakukan 2 kali. Sebanyak 2 kali volume etanol absolut ditambahkan pada supernatan lalu dikocok perlahan hingga terdapat endapan putih DNA. Campuran disentrifuse pada 13.000 rpm selam 5 menit dan etanol absolut diganti dengan alkohol 70%. Kemudian disentrifuse kembali pada 13.000 rpm selama 5 menit. Alkohol 70% dibuang dan endapan dikeringkan atau di vacuum. 100 ì l buffer T ris E DT A (TE) ditambahkan ke dalam tabung kemudian disentrifuse pelan dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 15 menit lalu disimpan dalam freezer.
Uji kualitas DNA. DNA yang telah diisolasi kemudian dielektroforesis menggunakan gel agarose 1.2 % dalam larutan 1xTBE (89 mM Tris, 89 mM Asam Borat dan 2 mM EDTA, pH 8,0) dalam piranti Submarine Electrophoresis (Hoefer). Pengamatan dilakukan dengan bantuan s inar ultra violet (ë = 300 nm) setelah gel diwarnai dengan ethidium bromide (0.5mg/ml).
Amplifikasi daerah D-loop. Sepasang primer digunakan untuk mengamplifikasi sekuen D-loop dengan metode PCR. Primer yang digunakan adalah CTD F 5’- TAA TAT ACT GGT CTT GTA AAC C- 3’ dan CTD R 5’- GGC TGG CAC GAG ATT TAC CAA CCC- 3’. PCR menggunakan mesin GeneAmp® PCR System 2400 (Perkin-Elmer). Kondisi PCR
Urutan basa ini disebut situs restriksi (Sambrook & Russel 2001). Variasi yang dihasilkan oleh perbedaan panjang fragmen yang dipotong oleh enzim restriksi ini dikenal sebagai Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP) (Duryadi 1994). Gabungan kedua metode tersebut dikenal dengan PCR-RFLP.
Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis keragaman genetik mencit rumah M.m castaneus di Jakarta, Bandung dan Surabaya menggunakan metode PCR-RFLP.
Penelitian ini dilaksanakan mulai Bulan November 2004 sampai April 2005 di Laboratorium Biologi Molekuler, Pusat Studi Ilmu Hayat (PSIH), IPB, Bogor.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan yang digunakan adalah sampel darah dan otot dari mencit rumah (M.m castaneus) dari beberapa lokasi di Jakarta (10 ekor), Bandung (11 ekor) dan Surabaya (9 ekor) (lampiran 2). Total sampel 30 ekor.
Metode
Pengambilan sampel. Darah diambil dari jantung menggunakan syringe yang telah berisi ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) 10% yang kemudian disimpan di suhu rendah sebelum diisolasi. Sedangkan untuk sampel dari otot menggunakan otot yang berasal dari femur M.m castaneus yang sudah dikuliti terlebih dahulu.
Ekstraksi dan isolasi DNA. Ekstraksi fenol adalah prosedur umum yang digunakan untuk isolasi sampel DNA (Sambrook & Russel 2001). Sampel darah sebanyak 250- 500 ì l dalam tabung eppendorf 1,5 ml ditambah lysis buffer dengan volume yang sama dan dikocok sampai homogen. Disentrifuse selama 1 menit pada 6500 rpm. E ndapan ditambah dengan 200 ì l rinse buffer
kemudian divortex. 500 ì l digestion buffer ditambahkan pada tabung dan dikocok hingga homogen lalu diinkubasi semalam pada suhu 55oC. Kemudian 500 ì l fenol ditambahkan dan dikocok selama ± 20 menit lalu disentrifuse 3 menit pada 13.000 rpm. Supernatan dipindahkan ke tabung baru lalu ditambahkan 500 ì l Chloroform isoamil alkohol (CIAA) kemudian dikocok selama ± 20 menit. Lalu disentrifuse 13.000 rpm selama 3 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung baru. Jika sampel berasal dari otot, maka perlakuan fenol dan CIAA dilakukan 2 kali. Sebanyak 2 kali volume etanol absolut ditambahkan pada supernatan lalu dikocok perlahan hingga terdapat endapan putih DNA. Campuran disentrifuse pada 13.000 rpm selam 5 menit dan etanol absolut diganti dengan alkohol 70%. Kemudian disentrifuse kembali pada 13.000 rpm selama 5 menit. Alkohol 70% dibuang dan endapan dikeringkan atau di vacuum. 100 ì l buffer T ris E DT A (TE) ditambahkan ke dalam tabung kemudian disentrifuse pelan dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 15 menit lalu disimpan dalam freezer.
Uji kualitas DNA. DNA yang telah diisolasi kemudian dielektroforesis menggunakan gel agarose 1.2 % dalam larutan 1xTBE (89 mM Tris, 89 mM Asam Borat dan 2 mM EDTA, pH 8,0) dalam piranti Submarine Electrophoresis (Hoefer). Pengamatan dilakukan dengan bantuan s inar ultra violet (ë = 300 nm) setelah gel diwarnai dengan ethidium bromide (0.5mg/ml).
Amplifikasi daerah D-loop. Sepasang primer digunakan untuk mengamplifikasi sekuen D-loop dengan metode PCR. Primer yang digunakan adalah CTD F 5’- TAA TAT ACT GGT CTT GTA AAC C- 3’ dan CTD R 5’- GGC TGG CAC GAG ATT TAC CAA CCC- 3’. PCR menggunakan mesin GeneAmp® PCR System 2400 (Perkin-Elmer). Kondisi PCR
pre-denaturasi pada suhu 94oC selama 5 menit, kemudian dilanjutkan dengan siklus utama yaitu denaturasi pada suhu 94oC selama 45 detik, annealing pada suhu 52oC selama 1 menit, elongasi pada suhu 72oC selama 1 menit yang diulang sebanyak 35 siklus dan post-elongasi pada suhu 72oC selama 7 menit.
Total campuran untuk tiap reaksi PCR adalah 50 ì l dengan kompos is i sampel DNA 2 ì l (10-100 ng), 10X buffer PCR mix 5 ì l, 25 mM MgCl2 3 ì l, 10 mM dNTP mix 1 ì l, 25 pM primer CTDF dan primer CTDR masing- mas ing 2 ì l , dan 5 unit / ì l Taq DNA polymerase 0.2 ì l (Promega) dan air steril s ebanyakl 34.8 ì l.
Pemotongan dengan enzim restriksi. Enzim restriksi yang digunakan dalam penelitian ini merupakan enzim pemotong 4 basa (four-cutter enzyme) yaitu HaeIII (5’- GG*CC-3’), AluI (5’- AG*CT) dan RsaI (5’- GT*AC-3’) (Promega). Pemotongan dilakukan dengan cara menambahkan 3.5 ì l air s teril, 1 ì l Buffer dan 0.5 ì l enzim ke dalam tabung eppendorf 0.5 ml yang beris i 5 ì l produk PCR. Tabung disentrifugasi lemah beberapa detik agar campuran merata. Kemudian diinkubasi selama ± 16 jam pada suhu 37oC (Syafitri 2005).
Analisis hasil PCR-RFLP. Fragmen DNA hasil PCR-RFLP dapat diamati dengan elektroforesis menggunakan agarose 1.2% (85 V/ 1-1.5 jam) dengan pewarnaan EtBr. Untuk mempertajam hasil digunakan PoliAcrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) 5.5% (85 V/ 6 jam) menggunakan buffer 1X TBE dan divisualisasikan dengan silver staining. Standar DNA yang digunakan adalah ladder 100 bp (Promega).
Analisis keragaman. Rekonstruksi dendogram menggunakan program Molecular Evolutionary Genetic Analysis (MEGA) V.3.0 (Kumar et al.1993) dengan metode
unweighted pair-group method using arithmetic averages (UPGMA).