HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

Amplifikasi daerah D-loop.

Penggandaan in vitro sekuen D-loop pada mitokondria M.m castaneus menggunakan primer CTDF yang didesain terletak di tRNA Threonin untuk forwardnya dan CTDR yang terletak di 12S rRNA pada reversenya menghasilkan produk sebesar 1384 pasang basa (pb) untuk semua sampel. Hal ini sesuai dengan hasil BLAST GeneBank Database (NCBI) M.m castaneus dengan nomor akses AJ286323 (Lampiran 3) dan AY057792 (Lampiran 4) yang telah disisipkan sekuen gen tRNA phenil alanin sebesar 68 pb (Lampiran 5). Oleh karena sekuen asli tRNA phenil alanin dari M.m castaneus belum diketahui, maka sekuen tRNA phenil alaninnya diambilkan dari sekuen tRNA phenil alanin M.m musculus (GenBank nomor akses NC005089). Dengan demikian produk PCR tersebut terdiri dari sekuen tRNA threonin, prolin, D-loop, tRNA phenil alanin dan 12S rRNA. Besarnya sekuen utuh D-loop M.m castaneus adalah sebesar 952 pb.

Keragaman fragmen D-loop dengan menggunakan Enzim Restriksi.

Untuk mengetahui keragaman produk PCR tersebut maka dilakukan dengan menggunakan tiga jenis enzim restriksi yaitu HaeIII, AluI dan RsaI yang merupakan enzim restriksi empat basa. Dasar pemilihan penggunaan enzim restriksi empat basa adalah dengan harapan setiap 256 pb ditemukan satu situs restriksi. Maka dalam 1384 pb diharapkan terdapat lima situs restriksi.

pre-denaturasi pada suhu 94oC selama 5 menit, kemudian dilanjutkan dengan siklus utama yaitu denaturasi pada suhu 94oC selama 45 detik, annealing pada suhu 52oC selama 1 menit, elongasi pada suhu 72oC selama 1 menit yang diulang sebanyak 35 siklus dan post-elongasi pada suhu 72oC selama 7 menit.

Total campuran untuk tiap reaksi PCR adalah 50 ì l dengan kompos is i sampel DNA 2 ì l (10-100 ng), 10X buffer PCR mix 5 ì l, 25 mM MgCl2 3 ì l, 10 mM dNTP mix 1 ì l, 25 pM primer CTDF dan primer CTDR masing- mas ing 2 ì l , dan 5 unit / ì l Taq DNA polymerase 0.2 ì l (Promega) dan air steril s ebanyakl 34.8 ì l.

Pemotongan dengan enzim restriksi. Enzim restriksi yang digunakan dalam penelitian ini merupakan enzim pemotong 4 basa (four-cutter enzyme) yaitu HaeIII (5’- GG*CC-3’), AluI (5’- AG*CT) dan RsaI (5’- GT*AC-3’) (Promega). Pemotongan dilakukan dengan cara menambahkan 3.5 ì l air s teril, 1 ì l Buffer dan 0.5 ì l enzim ke dalam tabung eppendorf 0.5 ml yang beris i 5 ì l produk PCR. Tabung disentrifugasi lemah beberapa detik agar campuran merata. Kemudian diinkubasi selama ± 16 jam pada suhu 37oC (Syafitri 2005).

Analisis hasil PCR-RFLP. Fragmen DNA hasil PCR-RFLP dapat diamati dengan elektroforesis menggunakan agarose 1.2% (85 V/ 1-1.5 jam) dengan pewarnaan EtBr. Untuk mempertajam hasil digunakan PoliAcrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) 5.5% (85 V/ 6 jam) menggunakan buffer 1X TBE dan divisualisasikan dengan silver staining. Standar DNA yang digunakan adalah ladder 100 bp (Promega).

Analisis keragaman. Rekonstruksi dendogram menggunakan program Molecular Evolutionary Genetic Analysis (MEGA) V.3.0 (Kumar et al.1993) dengan metode

unweighted pair-group method using arithmetic averages (UPGMA).

Hasil

Amplifikasi daerah D-loop.

Keragaman fragmen D-loop dengan menggunakan Enzim Restriksi.

Pemotongan dengan HaeIII.

HaeIII merupakan enzim restriksi yang yang akan memotong pada sekuen GG*CC. Pada ketigapuluh sampel yang dipotong dengan HaeIII menghasilkan tiga pola potong A, B dan C. Pola A menghasilkan empat fragmen (X1, X4, X5 dan X6). Pola B menghasilkan empat fragmen (X1, X3, X5 dan X7). Sedangkan pola C hanya menghasilkan tiga fragmen (X2, X7 dan X8). Total ragam fragmen yang dihasilkan oleh HaeIII adalah sebanyak delapan fragmen (Tabel 1).

Tabel 1 Pola pemotongan dengan enzim restriksi.

Pemotongan dengan AluI.

AluI merupakan enzim restriksi yang akan memotong pada sekuen AG*CT. Sampel yang dipotong dengan AluI menghasilkan tiga pola yang berbeda yaitu D, E dan F. Pada pola D hasil pemotongan terdiri dari enam fragmen (X1, X2, X3, X4, X5 dan X7). Pada pola E menghasilkan lima fragmen (X1, X3, X4, X6 dan X7). Sedangkan pada pola F menghasilkan empat fragmen ( X1, X2, X4 dan X8). Total ragam fragmen yang dihasilkan oleh AluI adalah sebanyak delapan fragmen (Tabel 1).

Pemotongan dengan RsaI.

RsaI merupakan enzim restriksi yang akan memotong pada sekuen GT*AC. Sampel yang dipotong dengan RsaI menghasilkan tiga pola yang berbeda yaitu G, H dan I. Pada pola G hasil pemotongan terdiri dari tiga fragmen (X1, X7 dan X9). Pola H terdiri dari lima fragmen (X1, X3, X4, X5 dan X8). Pola I terdiri dari tiga fragmen (X2, X6 dan X9). Total ragam fragmen yang dihasilkan oleh RsaI adalah sebanyak sembilan fragmen (Tabel 1).

Analisis keragaman haplotipe

Semua data dianalisis menggunakan program MEGA untuk merekonstruksi pohon filogenetik, maka didapatkan sembilan haplotipe berdasarkan pemotongan dengan tiga enzim restriksi. Penentuan haplotipe berdasarkan pada pola pemotongan tiap enzim restriksi, sehingga haplotipe yang dihasilkan merupakan gabungan tiga pola potong masing-masing enzim (Tabel 2). Haplotipe 1 dan 2 hanya ditemukan pada sampel di wilayah Jakarta dan Bandung. Sedangkan haplotipe 4 dan 6 ditemukan pada sampel di Bandung dan Surabaya. Haplotipe 5 dan 7 hanya ditemukan pada sampel di Bandung, sedangkan haplotipe 8 dan 9 hanya terdapat pada sampel di Surabaya. Haplotipe 3 ditemukan pada sampel yang berasal dari ketiga kota tersebut (Tabel 2).

Enzim Restriksi Hasil pola pemotongan sampel (pb) Ragam & besar fragmen sampel (pb) A B C HaeIII X1 X1 X2 X1 = 136 GG*CC X4 X3 X7 X2 = 264 X5 X5 X8 X3 = 283 X6 X7 X4 = 290 X5 = 470 X6 = 488 X7 = 495 X8 = 625 D E F AluI X1 X1 X1 X1 = 96 AG*CT X2 X3 X2 X2 = 123 X3 X4 X4 X3 = 140 X4 X6 X8 X4 = 200 X5 X7 X5 = 277 X7 X6 = 400 X7 = 548 X8 = 965 G H I RsaI X1 X1 X2 X1 = 140 GT*AC X7 X3 X6 X2 = 155 X9 X4 X9 X3 = 184 X5 X4 = 255 X8 X5 = 320 X6 = 445 X7 = 460 X8 = 485 X9 = 784

Tabel 2 Haplotipe dan penyebarannya

Pembahasan

DNA mitokondria (mtDNA) hewan merupakan molekul sirkular yang berukuran sekitar 16.000 pb dan diwariskan secara maternal (Ryan et al. 2000). MtDNA berevolusi jauh lebih cepat dibandingkan dengan laju evolusi DNA inti. Tetapi karena pentingnya fungsi mitokondria bagi kehidupan hewan, maka ada faktor-faktor yang menghambat laju evolusinya. Brown et al. 1979 mengatakan bahwa semakin penting fungsi suatu gen atau protein maka laju evolusi gen atau protein tersebut akan berjalan lebih lambat. Evolusi molekular didominasi oleh mutasi–mutasi yang terakumulasi dengan laju yang stabil pada garis keturunan yang masih bertahan hidup (Vigilant et al. 1991).

MtDNA sebagian besar terdiri atas 90% sekuen yang menyandikan, sedangkan sekuen D-loop merupakan sekuen yang tidak menyandikan. Daerah D-loop merupakan daerah non-coding utama pada mtDNA. Sekuen D-loop memiliki peran dalam proses replikasi utas berat ( Heavy strand) dan transkripsi mtDNA (Clayton 1982). D-loop terletak di antara gen tRNA prolina dan tRNA Phenil alanin (Anderson et al. 1982). Oleh karena daerah tRNA threonin, prolin, phenil alanin dan 12S rRNA relatif conserved dan

memiliki variasi yang relatif rendah maka daerah D-loop yang menjadi tumpuan kemungkinan keragaman dapat terdeteksi dengan mendesain primer yang terletak di daerah tersebut.

Tabel 3 Perbandingan hasil PCR-RFLP dengan sekuens acuan

# Hasil BLAST AY057792 dan AJ286323 dengan phenil alanin M.m castaneus no. akses NC005089 Haplotipe Penyebaran Haplotipe

Jakarta Bandung Surabaya Total 1. ADG 3 1 0 4 2. ADH 5 4 0 9 3. BEH 2 2 2 6 4. AEG 0 1 1 2 5. BDG 0 1 0 1 6. AEH 0 1 2 3 7. BDH 0 1 0 1 8. BEG 0 0 2 2 9. CFI 0 0 2 2 Total 10 11 9 30 Enzim Restriksi Ragam & besar fragmen acuan (pb) # Ragam & besar fragmen sampel (pb) HaeIII X1 = 62 X1 = 136 GG*CC X2 = 121 X2 = 264 X3 = 229 X3 = 283 X4 = 456 X4 = 290 X5 = 516 X5 = 470 X6 = 488 X7 = 495 X8 = 625 AluI X1 = 91 X1 = 96 AG*CT X2 = 116 X2 = 123 X3 = 188 X3 = 140 X4 = 445 X4 = 200 X5 = 544 X5 = 277 X6 = 400 X7 = 548 X8 = 965 RsaI X1 = 8 X1 = 140 GT*AC X2 = 17 X2 = 155 X3 = 17 X3 = 184 X4 = 35 X4 = 255 X5 = 121 X5 = 320 X6 = 392 X6 = 445 X7= 794 X7 = 460 X8 = 485 X9 = 784

Dari hasil amplifikasi D-loop dengan menggunakan sepasang primer CTDF dan CTDR menghasilkan produk PCR yang seragam dan sesuai dengan besar sekuen M.m castaneus acuan. Dapat disimpulkan bahwa pada sekuen daerah target tidak mengalami insersi atau delesi panjang sehingga produk PCR ketiga puluh sampel berukuran sama, yaitu sebesar 1384 pb.

Douzery dan Randi 1997 menyebutkan bahwa daerah D-loop memiliki central conserved region (CCR) yang diapit oleh daerah tepi (peripheral) kiri dekat dengan gen tRNA prolin dan daerah tepi kanan dekat dengan gen tRNA phenil alanin. Daerah CCR mengalami mutasi titik, insersi dan delesi (indel) yang terakumulasi secara

lamban. Sedangkan pada daerah tepinya terjadi mutasi titik, indel, dan sejumlah pengulangan tandem (Variable number of tandem repeats / VNTRs) yang laju akumulasinya terjadi dengan cepat.

Adanya perbedaan pola pemotongan pada tiap-tiap enzim restriksi dapat dijelaskan dengan penambahan atau kehilangan salah satu atau beberapa situs restriksi karena adanya substitusi basa. Selain itu faktor lain yang menyebabkan perbedaan pola potong karena adanya adisi atau delesi satu atau beberapa basa . Perbedaan metilasi pada tiap individu dapat juga merupakan sumber terjadinya variasi (Brown 1980).

Gambar 1 Dendogram dari 9 haplotipe

B 7 B 8 B 2 B 1 J 1 0 J 9 J 8 J 6 J 2 B 9 S 4 S 5 B 1 1 J 4 J 5 B 4 B 1 0 S 3 S 9 S 2 S 8 B 5 B 3 S 1 J 1 J 3 J 7 B 6 S 6 S 7 0.05

H-2

H-6

H-9

H-5

H-4

H-1

H-8

H-7

H-3

0.166

0.350

0.064

0.060

0.040

0.060

0.080

0.060

Vigilant et al. 1991 menyatakan perbedaan sekuen mtDNA pada daerah D- loop dapat pula disebabkan karena transisi dan transversi. Pada simpanse dan manusia pemunculan transisi dengan transversi memiliki perbandingan 15 : 1. Sehingga dari 189 individu yang diamati ditemukan 135 tipe mtDNA (daerah D-loop).

Transisi dan transversi tersebut dapat menerangkan adanya perbedaan letak situs restriksi antara M.m castaneus acuan untuk masing-masing enzim dengan sampel yang ada (Tabel 3). Substitusi basa yang terjadi pada mtDNA dapat menyebabkan perbedaan letak situs restriksi sehingga besar dan jumlah fragmen yang dihasilkan dapat berbeda-beda. Ohno 1997 mengatakan bahwa pada manusia laju substitusi basa di daerah D-loop sebesar 7 x 10-8/ situs pertahun.

Hal ini dapat dilihat pada hasil pemotongan dengan ketiga enzim restriksi. Pada pola A dan B dengan pemotongan menggunakan enzim HaeIII dapat dilihat bahwa pembagian menjadi dua blok sebesar 606 pb dan 778 pb. Pada blok 606 pb merupakan penjumlahan dari 136 pb dan 470 pb (X1 + X5). Sedangkan pola C merupakan pengecualian yang merupakan kemungkinan terjadinya substitusi basa (Lampiran 6).

Pada pola E dari pemotongan enzim AluI meghasilkan fragmen berukuran 400 pb yang merupakan penjumlahan fragmen 123 pb dan 277 pb pada pola D (penambahan situs restriksi). Sedangkan pada pola F fragmen sebesar 965 pb merupakan penjumlahan fragmen 140 pb, 277 pb dan 548 pb pada pola D. Dengan demikian pola F kehilangan dua situs restriksi (Lampiran 7).

Pemotongan dengan enzim RsaI menghasilkan dua blok fragmen sebesar 784 pb dan 600 pb. Pada pola G fragmen

berukuran 600 pb didapatkan dari penjumlahan fragmen 140 pb dan 460 pb. Sedangkan pada pola I fragmen 600 pb merupakan penjumlahan fragmen 155 pb dan 445 pb. Pada pola H fragmen sebesar 759 pb merupakan penjumlahan fragmen 184 pb, 255 pb dan 320 pb. Fragmen 759 pb disetarakan dengan fragmen 784 pb pada pola G dan I (Lampiran 8).

Adanya sembilan haplotipe yang ditemukan di tiga populasi menunjukkan tingkat polimorfisme yang cukup tinggi pada M.m castaneus (Gambar 1). Ryan et al. 2000 menyebutkan pada M.m domesticus di Irlandia memiliki polimorfisme yang tinggi karena dalam satu sarang ditemukan beberapa haplotipe. Dibandingkan dengan populasi di Jakarta dan Surabaya, populasi di kota Bandung memiliki lebih banyak haplotipe yaitu tujuh haplotipe (Tabel 2). Hal ini mungkin disebabkan adanya emigrasi dari M.m castaneus dari wilayah lain dan beradaptasi dengan lingkungan sekitar. Kota Bandung juga memiliki kondisi cuaca yang cukup berbeda dibandingkan Kota Jakarta dan Surabaya yang memiliki kondisi cuaca relatif sama. Haplotipe lokal 8 dan 9 pada populasi Surabaya diperkirakan karena daya adaptasi yang tinggi terhadap lingkungan sekitar, kemungkinan adanya genetic drift dari wilayah lain ( pulau lain) yang terbawa melalui alat transportasi (kapal laut / feri) dan perbedaan jarak geografis yang cukup jauh dari dua populasi lainnya.

Ryan et al. 2000, menyebutkan bahwa distribusi haplotipe mtDNA dapat disebabkan karena emigrasi dari suatu kondisi padat yang menyebabkan suatu individu harus meninggalkan populasinya. Distribusi haplotipe dapat berubah seiring waktu dan ditemukannya korelasi antara keragaman sekuen dengan jarak geografis yang ada. Distribusi mtDNA haplotipe dapat

dijelaskan dengan founder effect dan genetic drift.

SIMPULAN DAN SARAN

Dalam dokumen Analisis keragaman D-Loop Dna mitokondria mencit rumah (Mus Musculus Castaneus) di daerah Jakarta, Bandung dan Surabaya dengan Pcr-Rflp (Halaman 33-39)