Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan September 2006 sampai Desember 2007. Larva L. vannamei
dipelihara di Hatchery Marine Research Center PT. Central Pertiwi Bahari Lampung. Proses kultur bakteri dan ekstraksi DNA dilakukan di Marine Research Center PT. Central Pertiwi Bahari Lampung. Analisis T-RFLP dan ARDRA serta identifikasi isolat dan klon dilakukan di R and D PT. Charoen Phokphand Indonesia, Jakarta.
Pengambilan dan Perlakuan Sampel
Sampel yang diambil berasal dari siklus produksi yang sama, masing-masing terdiri dari telur, nauplii, zoea, mysis, dan post larva (Gambar 3.). Perlakuan perendaman dengan povidone iodine 20 ppm dilakukan pada sebagian telur dan nauplii yang kemudian dipelihara terpisah dari yang tidak mendapat perlakuan.
Untuk telur, dilakukan 2 kali sampling, yaitu sesaat setelah spawning (E0) dan 5 jam kemudian saat dipanen untuk dipindahkan ke hatching tank (E5). Bersamaan dengan sampling telur atau larva, juga diambil sampel air pemeliharaannya. Selain itu juga dilakukan sampling air pada spawning tank sebelum induk dimasukkan dan 3 jam setelah induk dimasukkan.
Ekstraksi DNA Dari Sampel
Untuk isolasi DNA, telur atau larva diambil sebanyak 0,1 g, dicuci 3 kali dengan 100 ml air laut steril di atas kertas saring steril. Untuk ekstraksi DNA bakteri, telur atau larva diberi perlakuan lysozim 10 mg/ml, kemudian selanjutnya ekstraksi dilakukan dengan
Soil DNA kit (MoBio, CA) mengikuti prosedur yang dianjurkan.
Ekstraksi DNA juga dilakukan pada sampel air tangki pemeliharaan larva. Air sebanyak 1 l disaring dengan membran nilon berpori 0,45 µm. Selanjutnya membran dipotong kecil, kemudian dilakukan proses ekstraksi DNA yang sama dengan pada sampel telur atau larva.
Amplifikasi Gen 16S rRNA Untuk T-RFLP
Amplifikasi Gen penyandi 16S rRNA dilakukan dengan primer forward 5’- (6FAM)CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’ dan primer reverse 5’-CCCGGG AACGTATTCACCGC-3’ (Marchesi et al. 1998) dengan campuran reaksi sebagai berikut: DNA 100 ng, 1x buffer (NEB, MA), 2 µl 10 mM dNTP Mix, 2 U Taq DNA Polymerase (NEB, MA), 5 pmol masing-masing primer, ddH2O sampai 50 µl. Program PCR terdiri dari 1 siklus pada 94°C selama 3 menit; 30 siklus pada 94°C selama 1 menit, 55°C selama 1 menit, 72°C selama 1 menit; 1 siklus pada 72°C selama 7 menit; diakhiri dengan penyimpanan pada 4°C. Bagian DNA utas tunggal dari amplikon didigesti dengan Mung Bean Nuclease (NEB, MA) kemudian dipurifikasi dengan QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Germany).
Gambar 3. Skema pengambilan sampel dalam satu siklus produksi benur di hatchery E5 Nauplii Zoea Mysis Post larva E0 +iodine -iodine
Digesti Amplikon
Amplikon didigesti dengan enzim restriksi yang memotong dengan frekuensi tinggi, yaitu RsaI dan Sau3AI (NEB,MA) secara terpisah dengan kondisi reaksi : 5U enzim, 1x buffer, 100-200 ng DNA, ddH2O sampai 20 µl, dan diinkubasi pada 37°C semalam. Selanjutnya dilakukan desalting dengan QIAquick Nucleotide Removal Kit (Qiagen, Germany). DNA hasil digesti dilarutkan dalam 30 µl elution buffer.
Analisis T-RFLP
DNA hasil digesti dicampur dengan 1 µl HD-400[ROX] sebagai standar ukuran internal. DNA didenaturasi dengan pemanasan pada 95°C selama 5 menit kemudian segera ditempatkan pada es selama 5 menit. Selanjutnya campuran dimasukkan dalam 96-well plate dan dimasukkan dalam sistem elektroforesis kapiler pada ABIprism™ 310
Automated DNA Sequencer (PE Applied Biosystem). Panjang fragmen terlabel dideterminasi dengan program GeneScan® (Perkin Elmer). Ukuran TRF yang diketahui dicocokkan dengan database pada situs Ribosomal Database Project II (Marsh et al., 2000). Untuk konfirmasi TRF hasil pemotongan dengan 2 enzim restriksi digunakan program Fragsort (www.oardc.ohio-state.edu/trflpfragsort).
Penghitungan Jumlah Bakteri
Sampel telur atau larva sebanyak 10 mg dicuci 3 kali dengan 100 ml 0,85% NaCl steril di atas kertas saring steril kemudian dihomogenisasi dalam 100 μl 0,85% NaCl steril. Dari homogenat sampel dibuat pengenceran berseri. Untuk tiap pengenceran, 0,1 ml disebar pada medium padat SWC 100% (Sea Water Complete; komposisi per liter medium terdiri dari Yeast extract 1 g, pepton 5 g, gliserol 3 ml, agar 15 g, air laut 750 ml, akuades sampai 1 l) dan medium TCBS (Oxoid) untuk menghitung kelompok Vibrio, kemudian diinkubasi semalam pada 28°C. Cawan dengan jumlah koloni antara 30-300 dipilih kemudian dihitung jumlah koloninya. Koloni dengan penampakan morfologi yang berbeda kemudian diambil dan dimurnikan. Isolat diidentifikasi dengan sekuens gen penyandi 16S rRNA. Pengkulturan juga dilakukan dari air tangki pemeliharaan larva.
Amplifikasi Gen 16S rRNA untuk ARDRA
Amplifikasi dilakukan dengan primer universal untuk kelompok bakteri, 63F (5’- CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’) dan 1387R (5’-CCCGGGAACGTATTC ACCGC -3’) (Marchesi et al. 1998). Kondisi PCR terdiri dari 1 siklus pada 94°C selama3 menit; 30 siklus pada 94°C selama 1 menit, 55°C selama 1 menit, 72°C selama 1 menit; 1 siklus pada 72°C selama 10 menit; diakhiri dengan penyimpanan pada 4°C. Produk PCR dilarikan pada gel agarosa 0,8% kemudian pita berukuran sekitar 1500 bp dipotong dan dipurifikasi dengan QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Germany).
Kloning Produk PCR 16S rRNA
Produk PCR diklon pada plasmid pGEM-T Easy Vector (Promega) dengan mengikuti prosedur yang dianjurkan, kemudian ditransformasikan ke dalam E.coli JM109 menggunakan CaCl2 dingin dan heat shock untuk membuat sel kompeten.
Seleksi Klon dilakukan pada medium LA yang ditambah Ampisilin 50 mg/ml dan substrat X-Gal. Selanjutnya, klon berwarna putih diambil, ditumbuhkan pada medium LB dengan Ampisilin 50 mg/ml pada 37°C, dikocok, selama 3-5 jam. Media yang mengandung sel ini digunakan sebagai template untuk amplifikasi insert menggunakan primer M13 dengan campuran reaksi yang terdiri dari 10% kultur, 0,8 mM dNTP, 1μM masing-masing primer,0,1 U/μl Taq DNA Polymerase, 1xbuffer. Kondisi PCR terdiri dari 3 siklus pada 94°C selama 70detik, 56°C selama 45 detik, 72°C selama 90 detik; 23 siklus pada 90°C selama 15 detik, 56°C selama 30 detik, 72°C selama 1 detik; 1 siklus pada 72°C selama 10 menit diakhiri dengan penyimpanan pada 4°C. Klon yang positif mengandung insert berukuran sekitar 1500 bp dipilih secara acak sebanyak 100 klon untuk digunakan dalam analisis berikutnya.
ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis)
Insert didigesti dengan enzim restriksi yang memotong dengan frekuensi tinggi, yaitu
MspI dan RsaI (NEB, MA) dengan campuran reaksi 5U enzim, 1x buffer, 100-200 ng DNA, ddH2O sampai 20 µl, kemudian diinkubasi pada 37°C semalam. Selanjutnya DNA hasil digesti dilarikan pada gel agarose 2%, dengan voltase 70V, selama 2 jam.
masing dari keseluruhan klon yang dianalisis, selanjutnya klon dengan pola restriksi yang dominan disekuens gen penyandi 16S rRNA nya untuk identifikasi.
Sekuensing Gen Penyandi 16S rRNA
Sekuensing dilakukan dengan menggunakan ABI Big Dye Terminator kit (Perkin Elmer) dengan primer 63F dan 1387R secara terpisah. Siklus sekuensing dilakukan pada ABIprism™ 310 Automated DNA Sequencer (PE Applied Biosystem). Sekuens gen penyandi 16S rRNA berukuran sekitar 1300 bp dibandingkan dengan database menggunakan program BLAST pada situs web National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST/). Pohon filogenetika dikonstruksi berdasar sekuens yang telah dijajarkan dengan program MEGA 4 (www.megasoftware.net). Pohon konsensus dikonstruksi dengan metode neighbor- joining dan 1000 kali bootstrap.
Analisis Keragaman
Bacterial phylotype richness (S) merupakan total puncak TRF berbeda/tipe restriksi yang berbeda yang ditemukan pada tiap sampel. Indeks Shannon-Wiener (H’) dan
evenness (E) dihitung untuk menggambarkan keragaman komunitas dan nilai penting relatif dari tiap filotipe dalam keseluruhan komunitas. H’ dihitung dengan rumus sebagai berikut: H’= -Σ (pi) (ln pi) dengan pi adalah kemelimpahan relatif dari fragment i.
Diagram Alur Pekerjaan Dalam Penelitian Ini
Sampel telur,larva, dan air
SWC 100%