Bahan-bahan yang digunakan adalah daun
senggugu, bakteri Gram positif (S. aureus dan
B. subtilis), bakteri Gram negatif (E. coli dan P. aeruginosa), ekstrak yeast, bacto pepton, glukosa, nutrient broth, nutrient agar, metanol, heksana, aseton, pereaksi-pereaksi uji
fitokimia (kloroform, H2SO4, amoniak,
pereaksi Mayer, pereaksi Dragendorf, NaOH
10%, FeCl3 1%, eter, pereaksi Liebermann-
Buchard, dan etanol) dan akuades.
Alat-alat yang digunakan adalah otoklaf, inkubator, pemanas, oven, evaporator vakum, laminar air flow hood, spektrofotometer, hot plate stirrer, pinggan porselin, autopipet, cawan petri, aluminium foil, lemari es, pH meter, jarum ose, neraca analitik, dan alat-alat gelas lainnya.
Metode
Persiapan Sampel dan Uji Pendahuluan Daun segar senggugu dicuci bersih, kemudian dipotong kecil-kecil dan digerus dengan mortar. Filtrat lalu disaring dengan menggunakan kain kassa dan diuji aktivitas antibakterinya.
Penentuan Kadar Air
Penentuan kadar air dilakukan dengan cara mengeringkan daun senggugu yang diletakkan di dalam pinggan porselin, kemudian dimasukkan ke dalam oven selama 3 jam pada suhu 100ºC, lalu didinginkan dalam eksikator, dan ditimbang hingga bobotnya konstan. Pinggan porselin yang digunakan juga harus dalam keadaan benar-benar kering, yaitu dengan cara memasukkan pinggan porselin ke dalam oven selama 30 menit pada suhu 105ºC, kemudian didinginkan dalam eksikator, dan ditimbang bobotnya hingga konstan. Kadar air dihitung dengan persamaan:
Kadar air = W1 – W2 , dengan
W
W1 : bobot pinggan porselin ditambah bobot daun sebelum dikeringkan W2 : bobot pinggan porselin ditambah
bobot daun setelah dikeringkan W : bobot daun
Ekstraksi Daun Senggugu Kering
Daun senggugu dihilangkan airnya dengan
menggunakan oven pada suhu ± 50 oC, setelah
bobotnya konstan lalu dipotong kecil-kecil atau diblender. Setelah itu daun diekstraksi dengan metode maserasi, yaitu sampel direndam dengan pelarut heksana, aseton, dan metanol dengan perbandingan 1:10 selama 18- 24 jam pada suhu ruang. Ekstraksi ini dilakukan tiga kali. Setelah itu sampel tersebut disaring. Filtrat yang didapat kemudian dievaporasi agar terpisah dari pelarutnya, sehingga didapatkan ekstraknya. Ekstrak kemudian digunakan untuk uji antibakteri. Ekstrak yang menunjukkan aktivitas antibakteri dibuat menjadi bubuk dengan cara mengeringkannya dalam oven pada suhu ± 50
o
C sampai bobot konstan. Bubuk ini digunakan untuk uji fitokimia dan penentuan KHTM (Konsentrasi Hambat Tumbuh
Minimum). Rendemen ekstrak dihitung
dengan cara sebagai berikut:
Rendemen = bobot ekstrak x 100% (%b/b) bobot kering sampel
Uji Fitokimia (Harborne 1987)
Uji Flavonoid. Sebanyak 0.5 gram sampel
dilarutkan dalam metanol kemudian dipanaskan. Filtrat kemudian ditambahkan
dengan H2SO4 pekat. Terbentuknya warna
merah menunjukkan adanya flavonoid.
Uji Alkaloid. Sebanyak 0.5 gram sampel
digerus dengan mortar kemudian ditambahkan dengan 10 mL kloroform dan beberapa tetes amoniak. Akan terbentuk dua fase. Fase kloroform kemudian dipisahkan dan
diasamkan dengan H2SO4 sebanyak 10 tetes.
Bagian asamnya dipisahkan dan diuji dengan tiga pereaksi, yaitu pereaksi Dragendorf, Mayer dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan warna merah dengan penambahan pereaksi Dragendorf, endapan putih dengan pereaksi Mayer, dan endapan cokelat dengan pereaksi Wagner.
Uji Steroid dan Triterpenoid. Sebanyak
0.5 gram sampel ditambahkan 25 mL etanol kemudian dipanaskan dan disaring. Filtratnya diuapkan dan ditambahkan eter. Lapisan eter direaksikan dengan pereaksi Liebermann- Buchard (3 tetes asam asetat anhidrat dan 1
tetes H2SO4 pekat). Terbentuknya warna hijau
atau biru menunjukkan adanya steroid dan terbentuknya warna merah atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid.
Uji Saponin. Sebanyak 0.5 gram sampel
fluoresensi kehijauan dengan bau aromatik enak. Bakteri ini hanya bersifat patogen dalam tubuh bila masuk ke daerah yang pertahanan normalnya tidak ada atau berperan dalam infeksi campuran.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan AlatBahan-bahan yang digunakan adalah daun
senggugu, bakteri Gram positif (S. aureus dan
B. subtilis), bakteri Gram negatif (E. coli dan P. aeruginosa), ekstrak yeast, bacto pepton, glukosa, nutrient broth, nutrient agar, metanol, heksana, aseton, pereaksi-pereaksi uji
fitokimia (kloroform, H2SO4, amoniak,
pereaksi Mayer, pereaksi Dragendorf, NaOH
10%, FeCl3 1%, eter, pereaksi Liebermann-
Buchard, dan etanol) dan akuades.
Alat-alat yang digunakan adalah otoklaf, inkubator, pemanas, oven, evaporator vakum, laminar air flow hood, spektrofotometer, hot plate stirrer, pinggan porselin, autopipet, cawan petri, aluminium foil, lemari es, pH meter, jarum ose, neraca analitik, dan alat-alat gelas lainnya.
Metode
Persiapan Sampel dan Uji Pendahuluan Daun segar senggugu dicuci bersih, kemudian dipotong kecil-kecil dan digerus dengan mortar. Filtrat lalu disaring dengan menggunakan kain kassa dan diuji aktivitas antibakterinya.
Penentuan Kadar Air
Penentuan kadar air dilakukan dengan cara mengeringkan daun senggugu yang diletakkan di dalam pinggan porselin, kemudian dimasukkan ke dalam oven selama 3 jam pada suhu 100ºC, lalu didinginkan dalam eksikator, dan ditimbang hingga bobotnya konstan. Pinggan porselin yang digunakan juga harus dalam keadaan benar-benar kering, yaitu dengan cara memasukkan pinggan porselin ke dalam oven selama 30 menit pada suhu 105ºC, kemudian didinginkan dalam eksikator, dan ditimbang bobotnya hingga konstan. Kadar air dihitung dengan persamaan:
Kadar air = W1 – W2 , dengan
W
W1 : bobot pinggan porselin ditambah bobot daun sebelum dikeringkan W2 : bobot pinggan porselin ditambah
bobot daun setelah dikeringkan W : bobot daun
Ekstraksi Daun Senggugu Kering
Daun senggugu dihilangkan airnya dengan
menggunakan oven pada suhu ± 50 oC, setelah
bobotnya konstan lalu dipotong kecil-kecil atau diblender. Setelah itu daun diekstraksi dengan metode maserasi, yaitu sampel direndam dengan pelarut heksana, aseton, dan metanol dengan perbandingan 1:10 selama 18- 24 jam pada suhu ruang. Ekstraksi ini dilakukan tiga kali. Setelah itu sampel tersebut disaring. Filtrat yang didapat kemudian dievaporasi agar terpisah dari pelarutnya, sehingga didapatkan ekstraknya. Ekstrak kemudian digunakan untuk uji antibakteri. Ekstrak yang menunjukkan aktivitas antibakteri dibuat menjadi bubuk dengan cara mengeringkannya dalam oven pada suhu ± 50
o
C sampai bobot konstan. Bubuk ini digunakan untuk uji fitokimia dan penentuan KHTM (Konsentrasi Hambat Tumbuh
Minimum). Rendemen ekstrak dihitung
dengan cara sebagai berikut:
Rendemen = bobot ekstrak x 100% (%b/b) bobot kering sampel
Uji Fitokimia (Harborne 1987)
Uji Flavonoid. Sebanyak 0.5 gram sampel
dilarutkan dalam metanol kemudian dipanaskan. Filtrat kemudian ditambahkan
dengan H2SO4 pekat. Terbentuknya warna
merah menunjukkan adanya flavonoid.
Uji Alkaloid. Sebanyak 0.5 gram sampel
digerus dengan mortar kemudian ditambahkan dengan 10 mL kloroform dan beberapa tetes amoniak. Akan terbentuk dua fase. Fase kloroform kemudian dipisahkan dan
diasamkan dengan H2SO4 sebanyak 10 tetes.
Bagian asamnya dipisahkan dan diuji dengan tiga pereaksi, yaitu pereaksi Dragendorf, Mayer dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan warna merah dengan penambahan pereaksi Dragendorf, endapan putih dengan pereaksi Mayer, dan endapan cokelat dengan pereaksi Wagner.
Uji Steroid dan Triterpenoid. Sebanyak
0.5 gram sampel ditambahkan 25 mL etanol kemudian dipanaskan dan disaring. Filtratnya diuapkan dan ditambahkan eter. Lapisan eter direaksikan dengan pereaksi Liebermann- Buchard (3 tetes asam asetat anhidrat dan 1
tetes H2SO4 pekat). Terbentuknya warna hijau
atau biru menunjukkan adanya steroid dan terbentuknya warna merah atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid.
Uji Saponin. Sebanyak 0.5 gram sampel
selama 5 menit, lalu didinginkan. Filtrat kemudian dikocok selama ± 5 menit. Busa yang terbentuk tidak kurang dari 1 cm dan stabil setelah 15 menit menunjukkan bahwa terdapatnya senyawa saponin.
Uji Tanin. Sebanyak 0.5 gram sampel
ditambahkan air ± 2 mL kemudian dididihkan dan disaring filtratnya. Filtratnya ditambah
dengan FeCl3 1% (b/v). Terbentuknya warna
biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya senyawa tanin.
Pembuatan Media
Media Nutrient Agar (NA). Formulasi
Media NA DIFCO per liter adalah 5 gram
bacto pepton, 3 gram beef extract, 5 gram
NaCl, dan 15 gram bacto agar. Sebanyak 23 gram NA dilarutkan dalam 1 L akuades, lalu dihomogenkan dengan menggunakan
magnetic stirrer sambil dipanaskan.
Kemudian sebanyak 5 ml media yang masih dalam bentuk cair ini dimasukkan ke dalam tabung-tabung reaksi. Media ini disterilkan menggunakan otoklaf pada tekanan 1.5 atm,
121 oC selama 15 menit. Sebelum mengeras
tabung-tabung tersebut dimiringkan lalu biarkan hingga mengeras. Media ini merupakan media agar miring yang digunakan untuk pertumbuhan bakteri.
Media cair Nutrient Broth (NB).
Sebanyak tiga gram beef ekstract, 5 gram
bacto pepton, 5 gram NaCl dilarutkan dalam 1 liter akuades. Kemudian dipanaskan sambil dihomogenkan dengan menggunakan magnetic stirrer. Larutan tersebut dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer sebanyak 10 mL dan ditutup dengan kapas dan alumunium foil. Media ini disterilkan menggunakan otoklaf
pada tekanan 1.5 atm, 121 oC selama 15
menit.
Media agar Pepton Yeast Glukosa
(PYG). Sebanyak 20 gram pepton, 10 gram
ekstrak yeast, 20 gram glukosa, dan 10 gram
agar dilarutkan dalam 1 liter akuades, lalu
dihomogenkan dengan magnetic stirrer dan
pemanasan. Kemudian sebanyak 20 mL masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu disterilkan dengan otoklaf pada tekanan 1.5 atm, suhu 121ºC selama 15 menit. Media ini digunakan untuk pembuatan agar cawan.
Regenerasi Bakteri
Hal pertama yang harus dilakukan adalah membiakkan bakteri dalam agar miring. Biakan digoreskan dari stok ke agar miring, ldiinkubasi pada suhu 37 ºC selama 24 jam.
Biakan ini merupakan biakan awal bakteri yang kemudian disimpan pada suhu 4-5 ºC.
Sebanyak satu mata ose bakteri diambil dari agar miring dan diinokulasikan ke dalam Erlenmeyer yang berisi 10 mL media NB steril. Kemudian diinkubasi dalam inkubator bergoyang pada suhu 37 ºC selama 24 jam,
lalu diukur Optical Density (OD) 25% T pada
panjang gelombang maksimum 600 nm. Uji Aktivitas Antibakteri (Bintang 1993)
Sebanyak 50 μL biakan bakteri yang telah
diregenerasi diambil dan dipindahkan ke dalam cawan petri, Setelah itu sebanyak 20 mL media agar PYG bersuhu ± 45 ºC dituangkan ke dalam cawan petri. Cawan digoyangkan agar bakteri tersebar merata dan dibiarkan pada suhu kamar hingga media agar memadat. Selanjutnya media dilubangi dengan diameter ± 5.5 mm, kemudian ekstrak
daun senggugu sebanyak 50 μL dimasukkan
ke dalam lubang tersebut, lalu diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Zona bening yang terlihat di sekeliling lubang menandakan adanya aktivitas antibakteri ekstrak daun
senggugu. Antibiotik ampisilin 0.4 mg/mL
digunakan sebagai kontrol positif. Penentuan KHTM
KHTM adalah konsentrasi terendah dari
senyawa antibakteri terhadap pertumbuhan
bakteri. Metode yang digunakan adalah metode Bintang (1993). Cara kerjanya adalah dengan membuat berbagai konsentrasi dari ekstrak daun senggugu yang telah dikeringkan, yaitu 500, 250, 125, 100, 50, 40,
30, 20, dan 10 mg/mL. Sebanyak 50 μL
diambil dari masing-masing konsentrasi tersebut dan dimasukkan ke dalam lubang pada media agar PYG yang telah diinokulasi dengan bakteri uji. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 24 jam. Aktivitas antibakteri diukur dengan melihat zona bening disekitar lubang sampel. Zona bening menunjukkan bahwa bakteri tidak tumbuh di sekitar filtrat yang terdapat di lubang agar, dan hal tersebut menandakan bahwa ada aktivitas antibakteri dari daun senggugu. Zona bening diukur diameternya sebanyak empat kali ulangan dengan menggunakan jangka sorong dan nilainya dirata-ratakan.
Analisis Statistik
Analisis statistik yang digunakan adalah rancangan percobaan dua faktor dalam Rancangan Acak Lengkap (RAL).
Model rancangannya adalah sebagai berikut:
Yij = µ + τi + εij
Yij = Diameter zona hambat pada dosis ke-i dan ulangan ke-j
µ = Pengaruh rataan umum
τ = Pengaruh dosis ke-i
ε =Pengaruh acak pada dosis ke-i ulangan
ke-j dengan i: 1 = 500 mg/mL 2 = 250 mg/mL 3 = 125 mg/mL 4 = 75 mg/mL 5 = 30 mg/mL 6 = 15 mg/mL 7 = 10 mg/mL 8 = 5 mg/mL 9 = 2 mg/mL 10 = 1 mg/mL 11= 0.8 mg/mL 12= 0.5 mg/mL 13= 0.2 mg/mL 14= 0.1 mg/mL 15= 0.05 mg/mL j: 1, 2.
Rancangan ini digunakan pada uji
antibakteri penentuan KHTM menggunakan metode Bintang. Data yang diperoleh
dianalisis dengan ANOVA (analysis of
variance) pada tingkat kepercayaan 95% dan
taraf α 0.05. Uji lanjut yang digunakan adalah
uji Tukey. Semua data dianalisis dengan program SPSS 13.0.