Bahan yang digunakan adalah NaCl dingin 0.9%, KCl dingin 1.15%, sodium dodesil sulfat (SDS) 8.1%, NaOH 1 M, asam asetat 20%, asam tiobarbiturat (TBA) 1.0% dalam pelarut asam asetat 50%, akuades, n- butanol:piridin (15:1 v/v), serta 1,1,3,3- tetrametoksi propana (TMP) sebagai larutan standar.
Alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian adalah alat-alat gelas, refluks,
rotary evaporator, oven, juicer, timbangan analitik, gunting, pipet volumetrik,
homogenizer manual, sentrifus klinis, pH meter, spektrofotometer UV-Vis, penangas air, kertas saring, vortex.
Metode Penelitian
Ekstraksi dan Fraksinasi Kulit batang Mahoni (S. macrophylla King).
Ekstrak kulit batang mahoni diperoleh dari penelitian Mardisadora (2009). Pada penelitian tersebut dilakukan pengeringkan kulit batang mahoni dan digiling hingga berbentuk serbuk berukuran 40-80 mesh. Serbuk diekstraksi dengan dua pelarut yang
berbeda. Serbuk kulit batang mahoni sebanyak 3000 g direndam dengan pelarut aseton selama 48 jam pada temperatur ruang hingga menghasilkan ekstrak aseton. Ekstraksi dengan aseton dilakukan 3 kali menggunakan 3 L aseton dan ekstrak yang dihasilkan diuapkan dengan rotary evaporator hingga kering. Residu ekstrak aseton kemudian ditimbang dan diekstraksi dengan metanol. Hasil ekstraksi diuapkan dengan rotary evaporator hingga didapat rendemen metanol sebesar 6.65%. Serbuk kulit batang mahoni sebanyak 500 g direndam dengan pelarut air panas selama 4 jam, kemudian ekstraksi diulang kembali. Air rendaman diuapkan dengan rotary evaporator sampai kering dan didapatkan rendemen sebesar 6.44% (Mardisadora 2009).
Desain Percobaan dan Dosis Penggunaan Ekstrak
Sampel hati, diperoleh dari penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Darminto (2010). Dalam penelitian tersebut digunakan hewan coba yaitu tikus putih jantan galur
Spraque Dawley, sehat dan memiliki aktivitas normal, berusia 8 minggu dengan berat 150-200 gram. Dosis ekstrak kulit batang mahoni yang digunakan didasarkan pada dosis optimum dari uji orientasi toksisitas akut yang dilakukan terhadap mencit dan uji aktivitas antioksidan secara in vitro.
Rancangan penelitian (Darminto 2010) yang dipakai sebagai berikut, yaitu 35 ekor dibagi atas 5 kelompok yaitu kelompok normal, kelompok kontrol hiperurisemia, kelompok pembanding alopurinol, dan dua kelompok perlakuan. Kelompok normal adalah kelompok yang hanya diberi cekok akuades. Kelompok kontrol negatif atau kelompok hiperurisemia merupakan kelompok yang diinduksi dengan jus hati ayam selanjutnya hanya diberi larutan CMC 0.5% sebanyak 25 mg/kg BB. Kelompok alopurinol merupakan kelompok pembanding dengan tikus yang diinduksi jus hati ayam selanjutnya diberi obat antihiperurisemia yaitu alopurinol dengan dosis 3.3 mg/kg BB. Kelompok perlakuan adalah kelompok tikus yang diinduksi dengan jus hati ayam yang selanjutnya dicekok dengan ekstrak. Masing-masing kelompok perlakuan diberi ekstrak mahoni (ekstrak air dan methanol) dengan dosis 25 ppm, dan 50 ppm. Ekstrak yang dicekok pada tikus dilarutkan dengan CMC 0.5%.
Induksi hiperurisemia dilakukan dengan memberikan pakan tikus yang telah dicampur dengan hati ayam. Induksi hiperurisemia dilakukan selama 21 hari dan pakan tetap diberikan selama perlakuan pemberian ekstrak. Sebelum dan selama perlakuan, darah tikus diambil untuk diukur kadar lipid peroksidanya. Pengambilan darah dilakukan 16-17 jam setelah dipuasakan melalui pembuluh darah vena ekor pada hari ke-0, 14, 21 setelah induksi hiperurisemia dan hari ke-28 setelah pemberian ekstrak selama 7 hari.
Dosis ekstrak kulit batang mahoni yang digunakan didasarkan pada dosis optimum dari uji orientasi toksisitas akut yang dilakukan terhadap mencit (Ningsih 2009) dan uji aktivitas antioksidan secara in vitro
(Mardisadora 2009). Nilai LD50 ekstrak air
kulit batang mahoni sebesar 21420.91 mg/Kg BB, dan ekstrak metanol kulit batang mahoni sebesar 16334.52 mg/Kg BB. Oleh karena itu, ditetapkan dosis aman bagi hewan model yang jauh berada di bawah dosis farmakologis sebesar 1/10 dosis letal yaitu 500 mg/Kg BB.
Pengukuran Konsentrasi Lipid Peroksidasi (Yagi 1994)
Pengukuran Panjang Gelombang Maksimum. Panjang gelombang maksimum dapat diperoleh dengan mengukur larutan standar pada suatu selang panjang gelombang. Panjang gelombang yang digunakan adalah 500-550 nm. Ke dalam eppendorf 2 mL dimasukkan 25 µL standar asam urat kemudian ditambahkan 1000 µL pereaksi. Campuran dikocok dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 20-25oC. Nilai absorbansi diukur pada panjang gelombang 500-550 nm dengan selang 5 nm. Nilai absorbansi diplotkan ke dalam kurva sehingga diperoleh puncak. Puncak tersebut merupakan nilai panjang gelombang maksimum.
Pembuatan Kurva Standar. Kurva standar dibuat dengan menggunakan larutan stok pereaksi 1,1,3,3-tetrametoksi propana (TMP) 6 M yang diencerkan dengan akuades menjadi konsentrasi 0.9, 1.5, 2.4, 3, 4.5, dan 6 μM. Larutan masing-masing dipipet sebanyak 4 ml ke dalam tabung reaksi, lalu masing-masing tabung ditambah 1 ml TBA 1.0% dalam pelarut asam asetat 50% dan dipanaskan di penangas air dengan suhu 95ºC selama 60 menit dan didinginkan pada suhu ruang. Kemudian masing-masing tabung ditambahkan 1.0 ml akuades dan 5
ml n-butanol:piridin (15:1 v/v), diaduk dengan vorteks, lalu disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Lapisan atas larutan yang terbentuk diambil, lalu serapanya diukur pada panjang gelombang maksimum yang sudah di cari sebelumnya.
Analisis Lipid Peroksida Hati. Pengukuran kadar lipid peroksida hati dilakukan pada sampel yang telah di bekukan sebelumnya. Sebanyak 1-2 g hati disimpan dalam larutan NaCl dingin 0.9%. Dari hati tersebut dibuat 10% b/v homogenat hati dalam larutan KCl dingin 1.15%. lalu diambil sebanyak 0.1 mL homogenat ke dalam tabung reaksi. Selanjutnya ke dalam tiap tabung ditambahkan 0.2 mL SDS 8.1% dan 1.5 mL asam asetat 20%, serta diatur pHnya dari 2.5 menjadi pH 3.5 oleh NaOH 1 M dengan menggunakan pH meter. Selanjutnya ditambahkan 0.7 mL akuades dan 1.5 mL TBA 1.0% dalam pelarut asam asetat 50%, kemudian dipanaskan ke dalam penangas air mendidih pada suhu 95 °C selama 60 menit, didinginkan pada suhu ruang. Lalu tiap tabung ditambahkan 1 mL akuades dan 5 mL n-butanol:piridin (15:1 v/v), diaduk dengan vorteks, disentrifus pada kecepatan 4000 rpm selama 10 menit, diambil lapisan atasnya, diukur serapannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 532 nm.
Analisis Statistik
Data konsentrasi lipid peroksida hati dianalisis secara statistik menggunakan analisis ragam (ANOVA), untuk korelasi konsentrasi lipid peroksida darah dan hati menggunakan analisis korelasi Pearson. Rancangan yang digunakan pada penelitian adalah rancangan acak lengkap (RAL). Model rancangan tersebut adalah sebagai berikut:
Yij =µ + τi + εij
Keterangan:
µ = pengaruh rataan umum
τi = pengaruh perlakuan ke-i, i =
1,2,3,4,5
εij = pengaruh galat perlakuan ke-i dan ulangan ke j, j= 1,2,3,4,5
Yij= pengamatan perlakuan ke-i dan
ulangan ke-j
i1 = kelompok kontrol normalang hanya
diberi akuades
i2 = kelompok kontrol hiperurisemia yang
diinduksi dengan jus hati dan larutan CMC 0,5%
9
i3 = kelompok kontrol alopurinol yang
diinduksi dengan hati dan diberi alopurinol dengan dosis 3,3 mg/kgBB i4 = kelompok perlakuan yang diberi ekstrak
air kulit batang mahoni
i5 = kelompok perlakuan yang diberi ekstrak
metanol kulit batang mahoni