Penelitian ini menggunakan 28 ekor ayam kampung, 24 ekor ayam arab, serta 4 ekor ayam ras strain CP 909 (berjenis kelamin betina). Ayam-ayam tersebut diambil secara acak dari sekelompok ternak ayam umur 5 bulan dan sudah diketahui genotipe HSP 70-nya menggunakan Polymerase Chain Reaction- Single Strand Conformation Polymorphism.
Uji Tantang Cekaman Panas
Penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap pola Faktorial 2 x 4 (2 tipe ayam dan 4 perlakuan cekaman panas akut) menggunakan 28 ekor ayam kampung betina, dengan rincian masing-masing 4 ekor bergenotipe AA, AB, AC, CC, AD, DD dan BC, serta 24 ekor ayam arab betina, masing-masing 4 ekor bergenotipe AA, AB, AC, CC, AD, dan BC, serta 4 ekor ayam ras betina bergenotipe DD. Masing-masing 1 ekor dari setiap genotipe HSP 70 dari masing- masing tipe ayam (ayam kampung, ayam arab dan ayam ras) diperlakukan sebagai kontrol (tidak diuji tantang), dan masing-masing 1 ekor diuji tantang stres panas akut pada 40oC, selama 0.5 jam, 1 jam, dan 1.5 jam, menggunakan chamber.
Chamber dibuat berbentuk kotak dengan ukuran 33x33x75 cm untuk ukuran panjang x lebar x tinggi menggunakan papan kayu lapis. Chamber dilengkapi dengan heater, thermostat, blower, thermometer digital, ventilasi, tempat pakan dan tempat air minum. Di bagian alas ruangan dilengkapi dengan kawat penyekat, dan di bagian bawahnya ditempatkan aluminium foil yang sudah diketahui bobotnya sebagai penampung feses. Pintu chamber terbuat dari kaca bening, sehingga tingkah laku ayam dalam chamber dapat dipantau dari luar. Ayam ras dalam penelitian ini tidak dimasukkan ke dalam rancangan, karena ayam ras hanya ada satu genotipe, yaitu DD (tidak mempunyai ulangan). Uji tantang stres panas akut dilakukan secara bergilir/bergantian. Dua jam sebelum perlakuan uji tantang, ternak dipuasakan dari pakan, namun air minum diberi ad libitum.
Setelah perlakuan uji tantang cekaman panas, dilakukan pengambilan darah untuk mendapatkan data kadar hormon kortikosteron, eritrosit, hemoglobin, nilai hematokrit, kadar leukosit, dan diferensiasi leukosit (eosinofil, basofil, limfosit, monosit), dan rasio H/L. Darah diambil melalui vena sayap (vena brakhialis) menggunakan spuit insulin 1 cc dan disimpan pada suhu ± 3oC selama 16 jam (sampel untuk pengukuran hormon kortikosteron), sedangkan sampel untuk peubah hematologi dimasukkan ke tabung EDTA 5 mL. Sesaat setelah mengalami uji tantang, ternak disembelih kemudian otaknya diambil menggunakan peralatan steril dan dimasukkan ke dalam nitrogen cair dan selanjutnya disimpan pada suhu - 80oC, untuk selanjutnya dilakukan analisis total RNA.
Pengukuran Hematologi
Peubah hematologi yang diamati dalam penelitian ini adalah kadar eritrosit, hemoglobin, nilai hematokrit, leukosit, diferensiasi leukosit, yaitu persentase heterofil, eosinofil, basofil, monosit, dan limfosit, serta rasio H/L. Pengukuran peubah-peubah ini mengacu pada metode yang dirangkum oleh Koller (1951). Eritrosit
Penghitungan nilai eritrosit dilakukan menggunakan metode Kamar Hitung (Koller 1951). Prosedur kerja dilakukan dengan memasukkan 20 µL darah EDTA ke dalam 4000 µL larutan Hayem menggunakan mikropipet, kemudian dibilas dan dicampur hingga rata, dan diinkubasi selama dua menit. Hasil campuran dimasukkan ke dalam kamar hitung Improved Neubauer, kemudian jumlah eritrosit dapat dihitung pada lima bidang kotak eritrosit dengan pembesaran lensa objektif 40 x. Jumlah eritrosit dapat diketahui dengan mengalikan jumlah eritrosit hasil hitungan dengan 10000 (mm3).
Hemoglobin
Penghitungan jumlah hemoglobin dilakukan menggunakan metode Spekrofotometer (Koller 1951). Prosedur kerja dilakukan dengan cara memasukkan 20 µL darah yang mengandung EDTA menggunakan mikropipet. Berikutnya darah dimasukkan ke dalam larutan drabkin kemudian dibilas dan dicampur hingga rata, selanjutnya diinkubasi selama 3 menit. Berikutnya absorban dibaca pada panjang gelombang 540 nm menggunakan spektrofotometer (UV Visible). Kadar hemoglobin dapat dihitung dengan mengalikan absorban dengan faktor (g/dL).
Hematokrit
Penghitungan nilai hematkrit dilakukan menggunakan metode Microhaematokrit, menurut petunjuk kerja (Koller 1951). Darah dimasukkan ke dalam tabung mikrohematokrit, kemudian bagian bawah tabung ditutup menggunakan lilin. Tabung diletakkan dalam centrifuge hematokrit (Hettick) kemudian disentrifugasi pada 15000 rpm selama lima menit, berikutnya persentase darah dapat dibaca menggunakan alat ukur hematokrit.
Leukosit
Data pengaruh genotipe HSP 70 yang mendapat cekaman panas akut terhadap nilai leukosit dilakukan dengan menggunakan metode kamar Hitung (Koller 1951). Prosedur kerja dilakukan dengan memasukkan 380 µL larutan Turk menggunakan mikropipet ke dalam tabung kaca. Sebanyak 20 µL darah ber EDTA dimasukkan ke dalam larutan Turk dengan menggunakan mikropipet, kemudian dibilas dan dicampur sampai rata, dan selanjutnya diinkubasi selama dua menit. Hasil campuran dimasukkan ke dalam bilik hitung Improved Neubouer
dan leukosit dapat dihitung dalam empat bidang menggunakan pembesaran lensa objektif 10 x. Jumlah leukosit dapat diketahui dengan mengalikan jumlah leukosit hasil hitungan dengan 50 (mm3).
Diferensiasi Leukosit
Penghitungan nilai diferensiasi leukosit dilakukan menggunkan metode Rapid (Koller 1951). Diferensiasi leukosit dapat diketahui dengan meneteskan 5 µL darah menggunakan mikropipet ke ujung objek glas dengan cara
menyentuhkan pada darah kemudian dibiarkan menempel dan menyebar pada pinggir kaca penggeser. Darah dihapus dengan kemiringan 35o, kemudian sediaan dikeringkan dan difiksasi dengan metanol. Tahap selanjutnya adalah melakukan pengecatan dengan cara sediaan hapus dicelupkan pada cat I (eosin) selama 20-30 detik. Selanjutnya dipindahkan dan dicelupkan ke dalam cat II, selama 15-30 detik. Selanjutnya dibilas menggunakan air mengalir hingga bersih, dan dikeringkan. Sediaan dapat dibaca di bawah mikroskop menggunakan minyak emersi. Selanjutnya, persentase masing-masing sel leukosit dihitung dengan menggu- nakan bantuan hand counter.
Hormon Kortikosteron.
Pengukuran kadar hormon kortikosteron dilakukan dengan pengambilan darah lewat vena sayap. Selanjutnya darah dibiarkan selama 16 jam pada suhu ±3oC, kemudian disentrifugasi selama 20 menit pada 2500 rpm untuk mendapatkan serum, selanjutnya dianalisis menggunakan kit ELISA (Enzyme Linked Immonosorbent Assay) produksi Diagnostic Automation. Inc. USA, Ekstraksi Total RNA
Masing-masing jaringan otak sampel diambil untuk mendapatkan total RNA. Ekstraksi total RNA dilakukan menggunakan kit total RNA Mini Kit 50 preps produksi Gene Aid. Sebanyak 25 mg sampel otak dilarutkan dalam tabung 1.5 µL menggunakan 400 µL RB buffer dan 4 µL merkaptoetanol dan selanjutnya diinkubasi selama 3 menit pada suhu kamar. Tahap selanjutnya, dipindah ke filter colum dan disentrifugasi pada 1000 g selama 30 detik. Bagian filter colum
dibuang dan bagian endapan ditambahkan 400 µL etanol 70% dan divorteks sampai homogen. Setelah dipindah ke RB colum disentrifugasi pada 14 000 g selama 1 menit. Setelah bagian endapan dibuang, RB colum dipindah ke tabung 2 mL baru dan ditambahkan WI buffer dan selanjutnya disentrifugasi pada 14 000 g selama 30 detik. Setelah bagian endapan dibuang, selanjutnya ditambahkan 600 µL wash buffer dan disentrifugasi pada 14 000 g selama 30 detik. Setelah bagian endapan dibuang selanjutnya disentrifugasi pada 14 000 selama 2 menit dan
colum dipindah ke tabung 1.5 mL. Setelah penambahan 50 µL RNA-se free water
sampel dibiarkan selama 2 menit dan selanjutnya disentrifugasi pada 14 000 g selama 1 menit, dan setelah itu RNA disimpan selama ± 45 menit, dilanjutkan dengan reaksi reverse transcriptase.
Reverse Transcriptase
Sintesis cDNA utas tunggal dilakukan menggunakan total RNA melalui reaksi reverse transcriptase, menggunakan Transkriptor First Strand cDNA Syntethic Kit. Larutan terdiri atas 5 µL sampel total RNA, 1 µL oligo (dT), dan 15 µL H2O dimasukkan ke dalam tabung 0.2 mL. Larutan dipanaskan pada suhu
65oC selama 10 menit kemudian segera dimasukkan ke dalam ice bath. Berikutnya ditambahkan 6 µL 5 X buffer, 0.5 µL inhibitor RNase, 0.5 µL dNTP, dan 0.5 µL reverse transcriptase. Pada tahap selanjutnya diinkubasi pada suhu 55oC selama 30 menit dan 85oC selama 5 menit. Setelah proses ini cDNA siap digunakan.
Real-time Quantitative PCR (RT-PCR)
Pengujian dilakukan menggunakan Real-time PCR kuantitatif menggunakansampel DNA yang diperoleh dari hasil reaksi reverse transcriptase
tRNA gen HSP 70, menggunakan Kapa Probe Fast Universal 2 x qPCR Master Mix (1 mL). Primer PCR yang dipergunakan adalah primer Forward 5‟- GGCACCATCACTGGGCTTA-3‟ dan Reverse 5”-TCCAAGCCATAGGCAA TAGCA-3‟ serta probe 50-FAM-CGTGATGCGTATTATCAATGAGCCCACA- TAMRA-3‟ (Zhen et al. 2006). Real-time PCR kuantitatif dilakukan menggunakan 20 µL yang terdiri dari 0.4 µM probe, 0.5 µM primer masing- masing, Master Mix dan 2 µL template cDNA yang dirancang berdasarkan pedoman yang dikeluarkan ABI 7000 Sequence Detection System. Siklus program PCR dilakukan selama 2 menit pada suhu 50oC, 10 menit pada suhu 95oC dilanjutkan dengan 40 siklus selama 15 detik pada suhu 95oC, satu menit pada suhu 60oC. Kurva standar ditarik dengan memplot natural log dengan siklus ambang batas (CT) terhadap natural log jumlah molekul yang digunakan pada
sampel DNA standar (pengenceran berkisar antara 9,65 x 105–9,65x109 kopi/µL), dimana CT merupakan siklus, yaitu statistik meningkat nyata terhadap besarnya
sinyal yang dihasilkan oleh reaksi PCR ketika pertama kali terdeteksi. CT dihitung
berdasarkan pengaturan default dari sekuens hasil deteksi software real-time. Persamaan dari grafik digunakan untuk menghitung jumlah molekul cDNA per mikrogram dari total oligo-dT premed cDNA, kemudian diuji dengan reaksi yang sama dengan plat sebagai standar.
Analisis Data
Pengaruh bangsa ayam dan cekaman panas akut (40oC) pada semua peubah yang diamati, dianalisis menggunakan analisis varian, dan uji lanjut LSMEAN. Data pengaruh cekaman panas pada ayam ras, dan pengaruh genotipe HSP 70 terhadap semua peubah yang diamati, dianalisis secara deskriptif, sedangkan untuk mengetahui hubungan antar peubah dilakukan analisis korelasi.