Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Virologi Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor mulai Februari 2009 sampai Juni 2009.
Metode
Sumber Inokulum dan Pengamatan Kejadian Penyakit di Lapang
Untuk mengetahui status penyakit di lapang, dilakukan survei di beberapa tempat untuk mengamati kejadian penyakit yang dihitung dengan menggunakan rumus :
KP =
Keterangan :
KP = Kejadian Penyakit
n = Jumlah tanaman yang menunjukan gejala N = Jumlah tanaman yang diamati
Inokulum awal diambil dari sentra produksi tanaman anggrek di Gunung Sindur yaitu tanaman anggrek yang menunjukkan gejala mosaik, klorotik dan nekrotik yang kemudian diinokulasikan beberapa kali pada tanaman Chenopodium amaranticolor, Nicotiana benthamiana, N. benthamiana dan terakhir pada N. benthamiana lagi untuk mendapatkan virus tunggal ORSV.
Isolasi Virus
Sampel tanaman yang diduga terinfeksi ORSV diisolasi dengan menggunakan tanaman N. benthamiana. Bagian tanaman anggrek yang positif terinfeksi ORSV digerus dengan mortar dan pistil steril. Larutan bufer fosfat 0,05 M pH 7.0, ditambahkan dengan perbandingan 0,1 gram per 0,5 ml larutan bufer fosfat (1:5 b/v). Kemudian cairan sap diinokulasikan ke bagian jaringan daun
n
tanaman N. benthamiana. Setiap tanaman diinokulasi pada 3 helai daun termuda yang telah membuka penuh. Sebelum diinokulasi, permukaan jaringan daun dilukai dengan menggunakan karborundum 600 mesh, kemudian sap dioleskan dengan menggunakan cotton bud yang dilakukan searah tulang daun tanpa digosok berlawanan arah. Setelah itu dilakukan pembilasan sisa- sisa karborundum yang masih melekat pada daun tanaman uji dengan aquades.
Deteksi dengan Double Antibody Sandwich (DAS)-ELISA
Deteksi ORSV hasil penularan secara mekanis pada tanaman indikator dilakukan dengan metode DAS-ELISA menurut Crowther 1995. Plat mikrotiter di beri coating dengan antiserum ORSV sebanyak 100 μl (perbandingan antiserum dan coating buffer 1:500) lalu diinkubasi pada suhu 4º semalam (overnight). Setelah itu plat dicuci dengan PBST (phosphate buffer saline tween-20) [8 g NaCl, 0,2 g KH2PO4, 1,15 g Na2HPO4, 0,2 g KCl, 0,2 g NaN3, 0,5 ml Tween 20, pH 7,4] sebanyak 5 kali. 0,2 g daun tanaman indikator yang bergejala digerus dalam GEB (general extract buffer) [1,3 g Na2SO3, 20 g PVP-40, 0,2 g NaN3, 2 g Powdered egg albumin, 20 g Tween-20, pH 7,4]. Sap tanaman diambil sebanyak
100 μl kemudian dimasukan kedalam sumuran plat mikrotiter. Plat mikrotiter
diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37º. Selanjutnya plat mikrotiter dicuci 5 kali dengan PBST. Kemudian enzim konjugat yang dilarutkan dan ECI buffer (Bovine serum albumin 2 g, PVP-40 20 g, NaN3 0,2 g) sebanyak 100 μl dimasukan kedalam sumuran (perbandingan konjugat dan ECI buffer 1:500) dan diinkubasi pada suhu 37º selama 2 jam, kemudian dibilas 5 kali dengan PBST. PNP (P- nitrophenyl-phosphate) yang telah dilarutkan dalam PNP buffer (0,1 g MgCl2, 0,2 g NaN3, 97 ml dietanolamin), dimasukkan sebanyak 100 μl kedalam sumuran plat mikrotiter dan diinkubasikan selama 30-60 menit pada suhu ruang. Perubahan warna diamati pada masing-masing sumuran.
Reaksi positif ditandai dengan adanya perubahan warna pada cairan yang berada didalam sumuran plat mikrotiter yaitu warna kuning setelah waktu inkubasi. Reaksi segera dihentikan dengan penambahan 3M NaOH, selanjutnya dianalisis secara kuantitatif menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang
405 nm. Pengujian dinyatakan bernilai positif jika nilai absorban sampel 1,5 kali dari nilai kontrol negatif.
Deteksi dengan Reverse Trancriptase (RT)--PCR
Ekstraksi RNA total. RNA total diperoleh dari 0,1 g daun sampel yang bergejala diekstraksi menggunakan RNEasy Plant Mini Kit (Qiagent Inc., Chatsworth, CA., USA) sesuai dengan instruksi first strand complementary DNA (cDNA) dalam mesin PCR. Daun N. benthamiana sumber virus ORSV ditimbang sebanyak 0.1 gram kemudian digerus dengan menggunakan mortar dan pistil dengan bantuan nitrogen cair. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 ml dan ditambahkan 450 µl buffer ekstraksi (buffer RLT) yang mengandung 1% merkaptoethanol kemudian divortex, setelah itu sampel diinkubasi pada suhu 56ºC selama 10 menit. Sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam QIAShredder spin colomn ungu lalu ditempatkan pada tabung 2ml, disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 2 menit. Supernatan diambil dengan menggunakan pipet tanpa menyentuh pellet dalam tabung koleksi, lalu pindahkan ke dalam tabung mikro 2ml, setelah itu ditambahkan sebanyak 0,5 volume ethanol 96% (± 225 µl) campur dengan menaik turunkan pipet. Sampel dimasukkan (± 650 µl termasuk endapan yang terbentuk) ke dalam RNeasy mini colomn pink, tempatkan pada tabung koleksi 2 ml lalu ditutup dengan baik dan disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 15 menit. Cairan yang terdapat pada tabung koleksi dibuang, kemudian ditambahkan 700 µl buffer RW1 ke dalam RNeasy colomn dan ditutup, disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 15 menit untuk mencuci colomn. RNeasy colomn dipindahkan ke dalam tabung koleksi 2 ml baru, buffer RPE dipipet sebanyak 500 µl lalu dimasukan ke dalam RNeasy colomn kemudian ditutup rapat, disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 15 menit. Kemudian cairan yang ada pada tabung koleksi dibuang. Tabung koleksi digunakan kembali, ditambahkan sebanyak 500 µl buffer RPE lalu disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 2 menit. Untuk meyakinkan bahwa colomn telah kering, colomn dipindahkan pada tabung koleksi baru kemudian disentrifugasi kembali pada kecepatan 10000 rpm selama 1 menit. Kemudian
ditambahkan 40 µl RNAse freewater ke dalam tabung RNEasy colomn, didiamkan selama 10 menit lalu disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 1 menit.
Pembuatan cDNA. RNA hasil ekstraksi selanjutnya ditranskripsi balik menjadi DNA komplementer dengan menggunakan teknik RT-PCR. Reaksi RT- PCR dengan total volume 18 μl terdiri atas 2 μl sampel RNA, 2 μl NE buffer RT 10x, 0,7 μl M-MuLV RT, 4μl 10 mM dNTP, 1,5μl 10 μM oligo-dT, 0,7 µl DTT (dithiothreitol), 0,7μl Rnase inhibitor, dan 6,4 μl H2O. Amplifikasi dilakukan
dalam sebuah Automated Thermal Cycler (GeneAmp 9700; Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT) diprogram untuk satu siklus pada 25ºC selama 5 menit, 42ºC selama 60 menit, dan 70ºC selama 15 menit.
Amplifikasi DNA dengan PCR. Amplifikasi DNA virus dilakukan dengan metode PCR dengan menggunakan pasangan primer ORSV CP U 5’- GCTCTAGAATGGGTCGTTTGCGTTTTGTAG-3’ (forward primer) dan ORSV CP D 5’–TCCCCCGGGTCAATACGGATCAGATTGTGC– 3’ (reverse primer). Reaksi PCR dengan total volum 25 μl, terdiri atas 9,5 μl dH2O, 1 μl 10mM primer
ORSV CP U, 1 μl ORSV CP D, 12,5 μl PCR mix, dan 1 μl sampel DNA. Amplifikasi dilakukan dalam sebuah Automated Thermal Cycler (GeneAmp 2400; Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT) diprogram untuk 35 siklus amplifikasi sebagai berikut: pemisahan utas DNA pada suhu 95 oC selama 30 detik, penempelan primer pada DNA 51 oC selama 45 detik dan sintesis DNA pada suhu 72 oC selama 1 menit. Khusus untuk siklus terakhir ditambah tahapan sintesis selama 10 menit, kemudian siklus berakhir pada suhu 4 oC. Elektroforesis dilakukan pada gel agarosa 1,2 % yang dijalankan pada 75 V selama 45 menit. Amplikon divisualisasi dengan 2 μg/ml etidium bromide dalam buffer elektroforesis (40 mM Tris, 20 mM sodium asetat, dan 1 mM EDTA, pH 7.0), kemudian diamati pada UV transiluminator dan difoto untuk dokumentasi.
Deteksi dengan Elektron Mikroskop.
Bentuk dan ukuran partikel virus diamati dengan menggunakan mikroskop elektron transmisi model JEOL 1010 pada 80 kV. Preparat disiapkan dengan mencampur 5 μl sampel dengan 5 μl phosphotungstic acid 2%, selanjutnya grid
berukuran 400 mesh yang telah dilapisi membrane kolodion dan dikarbonisasi ditempelkan pada preparat tersebut selama 1-2 menit. Diharapkan partikel virus yang ada pada preparat sampel akan menempel pada grid. Pengamatan partikel virus dilakukan dengan pembesaran 40.000 kali.
Kajian Kisaran Inang Virus ORSV
Uji penularan virus dilakukan terhadap delapan jenis tanaman yang dijadikan sebagai tanaman indikator, diantaranya Gomphrena globosa, Nicotiana tabacum, Nicotiana benthamiana, Datura mild, Physalis sp, Chenopodium amaranticolor, Chenopodium quinoa,dan cabe IPB 13.
Satu gram daun N.benthamiana yang positif terinfeksi ORSV yang menunjukkan gejala mosaik, dilumatkan dalam 0,5 ml larutan penyangga fosfat 0,05 M pH 7.0 (1:5 b/v) dengan menggunakan mortar dan pistil steril. Permukaan daun tanaman indikator yang akan diinokulasi dilukai dengan serbuk karborondum 600 mesh untuk memudahkan virus masuk ke dalam sel. Sap dioleskan ke permukaan daun tanaman indikator yang dilakukan searah tulang daun dengan menggunakan cotton bud, kemudian dicuci dengan aquades untuk menghilangkan karborondum yang tersisa. Inokulasi dilakukan pada masing – masing tanaman indikator dengan 5 ulangan. Pengamatan dilakukan setiap hari meliputi gejala yang timbul serta masa inkubasi dan persentase kejadian penyakit.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Sumber Inokulum dan Pengamatan Kejadian Penyakit di Lapang Tanaman anggrek yang diduga terinfeksi ORSV diambil dari salah satu sentra pertanaman anggrek yaitu di Gunung Sindur, Jawa Barat, dengan luas lahan minimal sekitar 300-500 m2. Dari tempat tersebut dipilih tiga lokasi pertanaman anggrek secara acak. Dari setiap lokasi diambil 15 tanaman anggrek secara acak sebagai sampel dengan memilih tanaman yang menunjukkan berbagai macam gejala diantaranya mosaik, bercak klorotik, bercak nekrotik dan daun bergelombang atau keriting. Kemudian ke 15 sampel tersebut dilakukan uji serologi dengan metode ELISA untuk mendeteksi keberadaan ORSV. Berdasarkan pada hasil pengamatan pada tanaman anggrek di ketiga lokasi tersebut diperoleh data mengenai jumlah tanaman anggrek yang menunjukkan gejala penyakit akibat virus patogen. Dari 15 tanaman anggrek yang diuji secara serologi dengan metode ELISA untuk deteksi ORSV, ternyata tidak semua sampel tersebut terinfeksi oleh ORSV. Pada lokasi 1, hanya ada satu sampel positif terinfeksi ORSV dengan nilai kejadian penyakit sebesar 6,67%, sedangkan pada lokasi 2 dan 3 memiliki nilai kejadian penyakit yang sama yaitu 26,67%. Data tersebut menunjukkan bahwa ORSV sudah berada di Indonesia walaupun persentase kejadian penyakit yang diperoleh tidak begitu besar. Hal ini dapat dijadikan sebagai indikasi keberadaan ORSV. Sehingga diperlukan tindakan pencegahan agar penyebaran ORSV dapat dikendalikan.
Tabel 4 Data kejadian penyakit virus ORSV di tiga lokasi pengamatan di Gunung Sindur Lokasi Jumlah terinfeksi Total tanaman Kejadian Penyakit (%)
Gejala yang tampak 1 1 15 6.67 Bercak nekrotik, mosaik
2 4 15 26.67 Mosaik