Waktu dan Tempat Penelitian
Survei dan pengambilan sampel tanaman lada dilakukan di Pulau Bangka pada bulan Februari 2005, sedangkan dari tiga tempat lainnya yaitu di Lampung, kebun percobaan Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat (Balitro) Bogor dan di Sukamulya Kabupaten Sukabumi, dilakukan pengambilan sampel pada bulan Maret-Juni 2005. Analisis sampel dilaksanakan di Laboratorium Virologi Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman dan Identifikasi serangga vektor dilakukan di Laboratorium Biosistematika Serangga Departemen Proteksi Tanaman Fakultas Pertanian IPB serta uji penularan dilakukan di rumah kaca Balitro Cimanggu Bogor pada bulan Januari sampai Agustus 2005.
Survei dan Pengambilan Sampel
Survei dilakukan untuk me lihat kondisi tanaman di lapangan sekaligus mengumpulkan sampel tanaman lada. Lokasi survei dilakukan pada beberapa tempat yang merupakan sentra produksi lada dan sentra penyedia dan penelitian tanaman lada. Sampel dari Bangka diambil di sembilan kebun petani dan Kebun Percobaan Balai Penelitian Teknologi Pertanian (BPTP) Bangka yang tersebar pada empat desa yaitu Ciluak, Payung, Cengkong Abang, dan Petaling (Gambar lampiran 1). Pada setiap kebun diambil sebanyak 5 sampel secara acak. Sampel dari daerah Lampung diambil dari tiga lokasi yaitu Desa Gunung Labuan, Desa Simpang, dan Desa Sukamarga.
Pengamatan dilakukan berdasarkan gejala yang tampak. Deskripsi gejala pada tanaman diamati menurut gejala umum yang muncul akibat infeksi virus seperti keriting, mosaik, motel dan kerdil.
Persiapan Vektor dan Tanaman Lada Identifikasi Serangga Vektor
Serangga yang digunakan, sebelumnya diidentifikasi untuk memastikan jenis spesies yang digunakan sebagai vektor. Vektor yang digunakan dalam penelitian ini adalah P. minor, F. virgata dan A. gossypii. Sebelum diperbanyak, serangga tersebut diidentifikasi melalui pengamatan visual untuk tingkat genus dan pengamatan melalui preparat awetan untuk tingkat spesies. Identifikasi kutu putih diidentifikasi menurut William dan de Willink (1992) dan William dan Watson (1988), sedangkan identifikasi kutu daun menggunakan kunci identifikasi menurut Blackman dan Eastop (1994) dan Cottier (1953).
Pembuatan preparat awetan kutu putih. Preparat awetan dibuat menurut metode William dan Watson (1988) yang telah dimodifikasi oleh Sartiami (2004). Pembuatan dimulai dengan memasukkan kutu putih dalam tabung reaksi berisi 2 ml alkohol 95% dan dipanaskan dalam penangas air selama 3-5 menit. Kemudian kutu putih diangkat dan dimasukkan ke dalam cawan sirakus dan ditusuk pada bagian atas abdomen. Serangga kemudian dipanaskan kembali dalam larutan KOH 10% sampai terlihat transparan, selanjutnya diangkat dan diletakkan pada cawan sirakus untuk dikeluarkan isi tubuhnya menggunakan jarum. Tahapan selanjutnya, dilakukan pencucian dengan akuades sebanyak dua kali kemudian dimasukkan ke dalam acid alcohol 50% dan dibiarkan selama 10 menit. Selanjutnya ditambahkan beberapa tetes acid fuchsin dan dibiarkan semalam. Setelah itu, awetan diberi satu tetes acetic acid glacial dan dibiarkan selama 5 menit dan didehidrasi berturut-turut mengunakan alkohol 80% selama 5 menit, dan alkohol 100% selama 10 menit. Kemudian serangga dimasukkan ke dalam carbol xylene selama beberapa saat dan dimasukkan lagi ke dalam alkohol
100% selama 10 menit, lalu ditambahkan tiga tetes minyak cengkeh dan ditunggu selama 10 menit. Tahap akhir, kutu putih yang telah diproses sebelumnya diletakkan pada gelas objek dan ditambahkan balsam kanada, posisinya diatur dan ditutup dengan gelas penutup.
Pembuatan preparat awetan kutu daun. Preparat awetan dibuat menurut metode Blackman dan Eastop (1994). Kutu daun dimasukkan dalam tabung reaksi yang berisi 5 ml alkohol 95% dan dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Se lanjutnya kutu daun diangkat dipindahkan dalam tabung reaksi yang berisi 5 ml KOH 10% dan dipanaskan kembali sampai kutu daun tersebut telihat transparan. Kemudian larutan KOH bersama kutu daun dituang ke dalam cawan sirakus, lalu isi tubuh serangga dikeluarkan dengan cara dilubangi dengan jarum serangga dan ditekan secara perlahan-lahan. Kemudian serangga dicuci dengan akuades sebanyak tiga kali. Perlakuan berikutnya adalah dehidrasi kutu daun dengan cara merendam secara berurut-turut dalam alkohol 50% , 70%, 95% dan 100% masing-masing selama 5 menit. Selanjutnya kutu daun diletakkan di atas gelas obyek dan ditetesi minyak cengkeh dan dibiarkan 2 menit. Kemudian minyak cengkeh dikeluarkan dengan cara diserap menggunakan kertas
tissue. Langkah selanjutnya, kutu daun ditetesi dengan balsam kanada dan diatur posisinya lalu ditutup dengan gelas penutup.
Perbanyakan Vektor
Imago P.minor diperoleh dari tanaman lada di rumah kaca Balitro Cimanggu dan diperbanyak pada umbi kentang yang telah bertunas, sedangkan imago F. virgata diperoleh dari tanaman lada di Kebun Percobaan Balitro Sukamulya dan diperbanyak pada bibit tanaman lada sehat. Imago A. gossypii
diambil dari tanaman tapak dara (Catharathus roseus (L) G.Don.) di halaman Balitro Cimanggu, kemudian dipelihara dan diperbanyak pada jenis tanaman yang sama. Perbanyakan serangga vektor di atas dilakukan di laboratorium hama Balitro Cimanggu. Vektor yang akan digunakan dalam uji penularan adalah generasi ketiga untuk membebaskan vektor dari virus yang mungkin terbawa dari lapangan.
Persiapan Tanaman Lada
Tanaman untuk uji penularan yang digunakan adalah bibit tanaman lada varietas kuching hasil perbanyakan dari benih. Benih disemai pada tanah steril dan ditumbuhkan sampai membentuk 4 - 5 daun (berumur 3 bulan). Bibit yang sudah siap dipindahkan ke polybag dan ditempatkan pada ruang kedap serangga untuk menghindari serangan hama terutama serangga vektor virus.
Penularan Virus
Uji penularan virus dilakukan terhadap kedua jenis virus yang berasosiasi dengan tanaman lada yaitu CMV dan PYMV. Sumber inokulum berasal dari koleksi tanaman sakit Balitro Cimanggu yang positif terinfeksi CMV dan PYMV berdasarkan uji ELISA (Gambar lampiran 2). Penularan dilakukan menggunakan vektor, P. minor, F.virgata dan A.gossypii. Serangga instar pertama hasil perbanyakan dipindahkan ke tanaman sakit dengan periode akuisisi selama satu jam untuk A.gossypii dan 24 jam untuk kedua jenis vektor lainnya. Vektor kemudian dipindahkan ke tanaman sehat dengan periode inokulasi sela ma 24 jam untuk A.gossypii dan 36 jam untuk P. minor dan F.virgata. Penularan virus dilakukan terdiri atas perlakuan tiap jenis serangga dengan jumlah masing-masing serangga vektor yaitu kontrol, 1, 3, 7, dan 10 ekor serangga untuk setiap tanaman yang diulang sebanyak lima kali. Perlakuan kontrol digunakan 10 ekor serangga yang tidak ditularkan ke tanaman sakit (Gambar lampiran 3). Peubah yang diamati adalah masa inkubasi dan persentase tanaman terserang (kejadian penyakit) serta deskripsi gejala yang muncul. Seluruh tanaman hasil penularan dideteksi dengan ELISA untuk konfirmasi terjadinya penularan.
Deteksi CMV dan PYMV dengan Teknik Serologi
Direct Double Antibody Sandwich-Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay
(DAS-ELISA)
Deteksi CMV dan PYMV terhadap sampel tanaman hasil survei dan CMV hasil penularan dilakukan dengan metode DAS ELISA menurut Crowther (1995).
Pelat mikroititer di coating dengan antiserum BSV sebanyak 100 µl (perbandingan antiserum dan coating buffer 1 : 200) lalu diinkubasi pada suhu 4 oC semalam (overnight). Keesokan harinya pelat dicuci dengan PBST (phosphate buffer saline tween-20) [8 g NaCL, 02 g KH2PO4, 1,15 g Na2HPO4, 0,2 g KCL, 0,2 g NaN3, 0,5 ml Tween 20, pH 7,4] sebanyak 5 kali. Daun tanaman bergejala digerus dalam GEB(general extract buffer) [1,3 g Na2SO3, 20 g PVP- 40, 0,2 g NaN3, 2 g Powdered egg albumin, 20 g Tween-20, pH 7,4] yang ditambahkan merkaptoetanol 1% dengan perbandingan 1 : 10 (w:v). Sap tanaman diambil sebanyak 100 µl kemudian dimasukkan kedalam sumuran pelat mikrotiter. Pelat mikrotiter diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37 oC. Selanjutnya pelat mikrotiter dicuci 5 kali dengan PBST. Kemudian enzim konjugat yang dilarutan dalam ECL buffer (Bovine serum albumin 2 g, PVP-40 20 g, NaN3 0,2 g) sebanyak 100 µl dimasukkan ke dalam sumuran (perbandingan konjugat dan ECL buffer 1 : 200) dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 2 jam, kemudian dibilas 5 kali dengan PBST. PNP (P-nitrophenyl-phosphate) yang telah dilarutkan dalam PNP buffer (0.1 g MgCl2, 0.2 g NaN3, 97 ml dietanolamin ), dimasukkan sebanyak 100 µl kedalam sumuran pelat mikrotiter dan diinkubasikan selama 30-60 menit pada suhu ruang.
Setelah waktu inkubasi tersebut akan terjadi perubahan warna pada cairan didalam sumuran pelat mikrotiter, yaitu warna kuning, yang menandakan reaksi positif. Reaksi segera dihentikan dengan penambahan 3M NaOH, selanjutnya dianalisis secara kuantitatif dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 405 nm. Pengujian dinyatakan positif jika nilai absorban 1,5 X nilai kontrol negatif.
Direct Antigen Coating ELISA (DAC-ELISA)
Deteksi PYMV terhadap sampel tanaman hasil uji penularan menggunakan metode direct antigen coating (DAC) ELISA menurut Hobbs et al. (1987). Antiserum untuk PYMV sampai saat ini belum tersedia di pasaran, oleh sebab itu digunakan antiserum yang memiliki hubungan serologi yang dekat dari genus virus yang sama yaitu antiserum BSV.
Daun tanaman bergejala digerus dalam karbonat buffer (1,59 g Na2CO3, 2,93 g NaHCO3, 0,2 g NaN3, pH 9,6) yang ditambahkan merkaptoetanol 1% dengan perbandingan 1 : 10 (w:v). Sap tanaman diambil sebanyak 100 µl kemudian dimasukkan kedalam sumuran pelat mikrotiter. Pelat mikrotiter disimpan semalam pada suhu 4oC. Keesokan harinya, pelat mikroititer dicuci 5 kali dengan PBST. Primary antiserum BSV yang sudah dilarutkan dalam bufer PBSTPO [PBST yang mengandung 2% polyvinyl pyrolidone (PVP) dan 0,2%
ovalbumin] 1 : 200 dimasukkan kedalam sumuran pelat mikrotiter sebanyak 100 µl, kemudian diinkubasikan pada suhu kamar selama 1 jam. Pelat mikrotiter dicuci lagi dengan PBST, kemudian diberi antibodi sekunder yang telah diberi label (alkaline phosphatase goat-anti rabbit enzyme) sebanyak 100 µl, lalu diinkubasi 1 jam pada suhu 37 oC. PNP yang telah dilarutkan dalam PNP buffer, dimasukkan sebanyak 100 µl ke dalam sumuran pelat mikrotiter dan diinkubasikan selama 30-60 menit pada suhu ruang. Setelah waktu inkubasi tersebut akan terjadi perubahan warna pada cairan di dalam sumuran pelat mikrotiter, yaitu warna kuning, yang menandakan reaksi positif. Reaksi segera dihentikan dengan penambahan 3M NaOH, selanjutnya dianalisis secara kuantitatif dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 405 nm. Pengujian dinyatakan positif jika nilai absorban 1,5 X nilai kontrol negatif.
Deteksi Molekuler PYMV dengan PCR Ekstraksi DNA total dari jaringan tanaman terinfeksi PYMV
Ekstraksi DNA total menggunakan prosedur yang dikemukakan oleh Doyle dan Doyle (1990). Daun tanaman lada yang sakit (0,1 g) digerus dalam nitrogen cair dengan mortar sampai menjadi tepung dan dimasukkan dalam tabung eppendorf kemudian ditambahkan 750 µl ml bufer CTAB (hexadecyl trimethyl ammonium bromida) [CTAB 2%; 1,4 M NaCl; 100 mM Tris; 20 mM EDTA; PVP-40 1%] yang mengandung 0,5% mercaptoethanol (V/V) dan diinkubasi dalam penangas pada suhu 65 oC selama 30 menit, lalu dibiarkan mendingin. Kemudain ke dalam tabung eppendorf ditambahkan 1,5 µl RNAse dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit. Setelah itu ditambahkan CI
(Chloroform-isoamyl alcohol – 24 : 1, v/v) dengan volume yang sama dan divortex, lalu disentrifugasi pada kecepatan 12.500 rpm 15 menit pada suhu 4 oC. Proses selanjutnya, supernatan diambil dan dipindahkan ke tabung
eppendorf baru lalu ditambahkan 0,1 volume 10% CTAB, dan ditambahkan CI dengan volume yang sama, divorteks dan disentrifugasi pada kecepatan 12.500 rpm 15 menit pada suhu 4 oC. Supernatan diambil ditambahkan 2/3 volume isopropanol dingin (-20 oC) dan kemudian diinkubasi pada suhu -80 oC selama 30 menit. Presipitasi dilakukan dengan sentrifugasi pada kecepatan 12.500 rpm 15 menit pada suhu 4 oC. Supernatan dibuang sehingga tersisa pelet pada dinding tabung. Pelet dicuci dua kali dengan 150 µl alkohol dingin (-20 oC) dan setiap pencucian dilakukan sentrifugasi pada 12.500 rpm 10 menit. Pele t yang telah dicuci dikeringkan dengan pompa vakum, selanjutnya diresus pensikan dalam 20 µl bufer TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) dan disimpan dalam freezer
sampai digunakan.
Amplifikasi DNA
DNA hasil ekstraksi diamplifikasi dengan teknik PCR mengikut prosedur de Silva et al. (2002), dengan menggunakan sepasang primer yaitu Badna-T (5’- CACCCCCGGGCCAAAGCTCTGATACCA -3’) dan SCBV-R1 (5’-CTCCTTCA TCTCAAGAAGCCT-3’). Primer -primer ini conserved dengan sekuen PYMV ORF-1 dan akan menghasilkan amplikon dengan ukuran 700 bp. Reaksi PCR (total volume 25 µl) terdiri atas 2 µl sampel DNA, 1 µl Badna-T (10 pmol/ µ l), 1 µl SCBV-R1 (10 pmol/µ l), 21 µl dH2O dan Ready To Go PCR Beads (Amhersham pharmacia Biotech) yang mengandung 1,5 mM Taq DNA
polymerase, 10mM Tris-HCl (pH 9,0), 50 mM KCl, 1,5 M MgCl2, 200 mM dNTP, 200 mM stabilizer, dan 200 mM bufer asam sulfat. Tabung-tabung tersebut ditempatkan pada mesin PCR (thermal cycler) pada suhu 92 oC selama 1- 5 menit untuk pemanasan awal. Amplifikasi dengan PCR dilakukan dengan Siklus terdiri atas dua step yaitu : 5 siklus pada suhu 94 oC – 30 detik, 37 oC – 30 detik, 72 oC – 2 menit, 25 siklus pada suhu 94 oC – 30 detik, 58 oC – 30 detik, 72 oC – 2 me nit, diakhir siklus suhu dipertahankan pada 4 oC. Hasil PCR disimpan di dalam freezer untuk digunakan lebih lanjut.
Visualisasi DNA
DNA virus hasil amplifikasi dielektroforesis menggunakan gel agarose 1,5% (w/v) (dalam TBE 1X) yang ditambahkan ethidium bromide (0,5 µl /10 ml TBE). Untuk pengukuran DNA digunakan Marker 100 bp ladder. Sampel disiapkan dengan mencampurkan 12 µl DNA dan 2 µl loading buffer. Selanjutnya masing-masing sampel diisikan dalam sumuran gel dengan pipet mikro (Sambrook et al. 1989). Elektroforesis dilakukan pada tegangan 70 V DC selama 60 menit. Hasil visualisasi elektroforesis tersebut dilihat dibawah transilluminator
ultraviolet dan dipotret menggunakan gel dok.
Purifikasi Virus
Purifikasi virus dilakukan mengikuti prosedur yang dimodifikasi dari de Silva et al. (2002). Daun lada terinfeksi PYMV dihomogenasi selama 90 detik pada suhu 4 oC dalam bufer ekstraksi [0.25 M Tris-HCI pH 7.4 yang mengandung 0.5% (w/v) Na2SO3, 4% (w/v) polyvinyl pyrrolidne (PVP-40), 0,5% (v/v) 2-B mercaptoethanol, 0.25% diethyldithio-carbamic acid (DIECA)]. Perbandingan daun ter hadap bufer adalah 1:10 (b/v).
Sap disaring dengan kain kasa dan kemudian disentrifugasi pada kecepata n 12.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 oC. Partikel PYMV dipresipitasi dengan menambahkan polyethylene glycol (PEG, MW 6000) (konsentrasi PEG 4% dan mengandung 1,75% NaCI) kemudian diaduk dengan stirer selama 1 jam pada suhu 4 oC, lalu dipeletkan dengan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 oC). Pelet yang diperoleh diresuspensikan dalam larutan suspensi semalam [10 ml sap dalam 100 ml bufer suspensi (50 mM Tris- HCI, 150 mM NaCI pH 7.4) ] pada suhu 4 oC. Ekstrak kasar hasil fitrasi ditambahkan 0,25% Triton X-100 sambil diaduk dengan strirer selama 30 menit pada suhu 4 oC, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 oC. Supernatan diambil dan diultrasentrifugasi pada kecepatan 30.000 rpm selama 1,5 jam pada suhu 4o C). Pelet yang merupakan virus murni
sebagian diresuspensi dalam 25 ml bufer suspensi (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI pH 7.4).
Purifikasi akhir dilakukan dengan ultrasentrifugasi gradien CsCl sukrosa (Gumpf et al. 1981). Virus murni sebagian sebanyak 2 ml diletakkan di atas larutan gradien CsCl sukrosa (0-40%) dan diultrasentrifugasi pada kecepatan 35.000 g selama 5 jam pada suhu 10 oC.
Perunutan Susunan Nukleutida
Fragmen DNA hasil PCR ditentukan urutan nukleutidanya dengan menggunakan primer forward Badna -T dan reverse SCBV -R1. Perunutan dilakukan menggunakan mesin sequencer ABI-Prism 3100-Avant Genetic Analyzer di Laboratorium Research and Development Centre PT. Charoen Pokphand, Indonesia. Hasil sekuen dianalisis menggunakan software Blast