BAHAN DAN METODE

EVALUASI MUTU DAN KESEHATAN BENIH PADI VARIETAS IR 64 YANG BERBEDA VIGOR

Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Pengujian Benih Balai Besar Pengembangan Pengujian Mutu Benih Tanaman Pangan dan Hortikultura (BB-PPMBTPH) Cimanggis, Depok. Penelitian dilaksanakan pada bulan Desember 2007.

Metodologi

Pengambilan Sampel Benih Padi Varietas IR 64

Pengambilan sampel dilakukan di PT. Sang Hyang Seri, Subang, Jawa Barat. Dua sampel yang diambil merupakan benih padi varietas IR 64 yang dipanen pada tanggal 6 Juni 2007 (Lot I) dan 10 September 2007 (Lot II). Sampel benih padi dari PT. Sang Hyang Seri sudah dalam kemasan plastik masing-masing seberat 1 kg, selanjutnya disimpan di Ruang Koleksi Benih BB-PPMBTPH pada suhu 20-25 ºC. Untuk evaluasi mutu dan kesehatan benih, dilakukan pengambilan contoh kerja dengan menggunakan soil devider, dan dilaksanakan analisis kemurnian terlebih dulu untuk memisahkan benih murni dari komponen benih tanaman lain dan kotoran benih.

Pengujian Viabilitas dan Vigor Benih Padi

Pengujian viabilitas dan vigor dilakukan untuk mengetahui mutu fisiologis awal dari sampel benih. Pengujian dilakukan dengan uji antar kertas (between paper). Benih ditabur antara dua lapis kertas basah lalu digulung kemudian dimasukkan dalam kantong plastik. Benih dikecambahkan di germinator pada suhu 25ºC, benih yang digunakan berjumlah 200 benih (empat ulangan @ 50 benih) untuk pengujian viabilitas dan 200 benih untuk vigor. Pengamatan dilakukan terhadap parameter viabilitas dan vigor benih:

1. Daya Berkecambah (DB), menggambarkan viabilitas potensial benih (Sadjad

et al. 1999), dihitung berdasarkan persentase kecambah normal (KN) hitungan pertama yaitu 5 hari setelah tanam (HST) dan kedua (14 HST) dengan rumus:

DB(%) = ∑ KN hitungan I + ∑ KN hitungan II x100% ∑ benih yang ditanam

2. Indeks Vigor (IV), menggambarkan vigor kecepatan tumbuh (Copeland dan

McDonald 1995), dihitung berdasarkan persentase kecambah normal (KN) pada hari hitungan pertama (5 HST) dengan rumus :

IV (%) = ∑ KN hitungan I x 100%

∑ benih yang ditanam

3. Kecepatan Tumbuh (%/etmal)

Pengamatan terhadap persentase kecambah normal per etmal dilakukan setiap

hari hingga pengamatan terakhir (final count) (Sadjad 1993). Rumus yang

digunakan adalah:

KCT = Σ ^N/t

Keterangan : t : waktu pengamatan

N : % KN setiap waktu pengamatan tn : waktu akhir pengamatan

Pengujian Kesehatan Benih

Pengujian kesehatan benih adalah pemeriksaan pada benih dengan menggunakan metode khusus untuk mengetahui adanya mikroorganisme atau penyakit pada benih (ISTA 2006). Pengujian kesehatan benih dilakukan terhadap cendawan dan bakteri patogenterbawa benih.

Identifikasi dan Penghitungan Kerapatan Cendawan Patogen Terbawa Benih

Pengujian cendawan dilakukan dengan metode Blotter test, yaitu menanam 200 benih padi (empat ulangan @ 50 benih) yang sudah didisinfeksi dengan natrium hipoklorit 1 % dan dicuci dengan air steril serta dikeringkan dengan tisu dan dikeringanginkan. Identifikasi dilakukan setelah 7 hari inkubasi pada inkubator suhu 20-25 ºC dengan penyinaran near ultra violet (NUV) 12 jam terang dan 12 jam gelap. Pengamatan dilakukan dengan mikroskop stereo dan

mikroskop compound terhadap semua jenis cendawan terbawa benih dengan

rumus :

% infeksi = Jumlah benih yang terinfesi x 100 % Jumlah benih yang di tanam

Pada pengujian cendawan patogen terbawa benih dihitung pula jumlah kerapatan cendawan dengan haemocytometer dan mikroskop compound. Rumus perhitungan (Mathur 2003) :

= jumlah spora per ml

Cendawan patogen terbawa benih yang berhasil diidentifikasi dimurnikan dengan potato dextrose agar (PDA) untuk digunakan pada pengujian selanjutnya.

Ekstraksi, Isolasi dan Identifikasi Bakteri Patogen Terbawa Benih

Dalam pengujian bakteri patogen terbawa benih langkah yang dilakukan untuk menentukan ada tidaknya bakteri patogen dalam suatu kelompok benih adalah dengan cara ekstraksi bakteri, isolasi dan pemurnian serta identifikasi isolat bakteri.

Jumlah spora x volume dari suspensi spora (ml)

(luas area perhitungan (mm²) x kedalaman (mm) ml

Ekstraksi dan isolasi bakteri langsung dari benih dengan metode penghancuran (liquid assay). Benih sebanyak 400 butir direndam dalam natrium hipoklorit selama 1 menit, selanjutnya dibilas dengan air steril tiga kali, setelah itu benih dihancurkan dengan mortar dan pestle serta ditambahkan air steril sebanyak (1.9 x berat 100 butir) + 50 ml. Hasil ekstraksi diinkubasikan selama 2 jam. Suspensi bakteri diambil dengan pipet steril sebanyak 1 ml dan dimasukkan dalam tabung reaksi yang berisi air steril 9 ml, sehingga diperoleh perbandingan suspensi baru 1:10 (10^-1), kemudian dikocok hingga homogen. Cara pengenceran ini diulang dua kali sehingga mendapatkan tingkat pengenceran 10^-3. Dari pengenceran yang dibuat, diambil 100 µl suspensi dan ditabur pada nutrient agar (NA). Cawan petri diinkubasi dalam keadaan terbalik pada suhu 28-30 ºC selama 2-3 hari (BBPPMBTPH 2007).

Koloni yang diduga sebagai patogen dimurnikan pada media NA/Kings’B, kemudian diinkubasi pada suhu 28-30 ºC selama 2-3 hari. Isolat yang didapat selanjutnya diidentifikasi berdasarkan karakter fisiologi dan biokimi pada patogen Pseudomonas dan patogen Xanthomonas ( Tabel 3 dan 4).

Karakter Morfologi Koloni

Koloni bakteri dapat dilihat dari morfologinya yaitu bentuk koloni cembung, bulat, tepinya licin atau bergerigi (BBPPMBTPH 2007).

Uji Reaksi Gram

Uji reaksi gram dilakukan untuk membedakan antara bakteri yang bersifat gram positif dengan gram negatif dengan cara mencampurkan satu lup bakteri dengan dua tetes larutan KOH 3%, selanjutnya dilakukan pengamatan, apabila terbentuk lendir setelah diaduk dengan jarum ose artinya bakteri tersebut bersifat gram negatif (Mortensen 1989).

Uji Hidrolisis Pati

Koloni bakteri digoreskan pada medium pati, diinkubasi selama 4 hari

pada temperatur 28°C. Koloni yang sudah tumbuh pada goresan disiram dengan

larutan Lugol’s Iodin dan dilakukan pengamatan. Apabila media pati berwarna

Tabel 3. Karakter morfologi dan biokimia yang digunakan untuk membedakan patogen Pseudomonas

Karakter P.s P.f P.a P.g

Warna putih putih-coklat

terang putih seperti kapur putih keabu-abuan Morfologi bundar, licin, timbul bundar, licin, timbul, bening, mengkilap bulat, licin, timbul, lengket, mengkilap bulat, licin, timbul Hidrolisa pati - + +/- +/- Fluoresen + + - - Oksidase - + +/- - Arginin - + - -

Sumber : Mortensen 1989; Mew et al. 1994

Keterangan : P.s : Pseudomonas syringae, P.f : Pseudomonas fuscovaginae,

P.a : Pseudomonas avenae, P.g : Pseudomonas glumae

Tabel 4. Karakter morfologi dan biokimia yang digunakan untuk membedakan patogen Xanthomonas

Karakter Xoo Xco Xcc

Warna kuning keputih-putihan sampai kuning tua kuning keputih-putihan sampai kuning pucat kuning muda sampai kuning

Morfologi cembung, bulat

kecil licin, cembung, bulat bulat kecil, licin, berkilau, berlendir Oksidase - - - Hidrolisa pati - + +

Tumbuh pada suhu 35^o C + + +

Tumbuh pada media SX - + +

Sumber : Mortensen 1989; Mew et al. 1994

Keterangan : Xoo: Xanthomonas oryzae pv. oryzae Xco: Xanthomonas campestris pv.

oryzicola, Xcc: Xanthomonas campestris pv. campestris

Uji Fluorescence

Bakteri digoreskan pada media King’s B yang sudah dituangkan ke dalam cawan petri. Cawan petri yng telah digoree bakteri iinkubasi pada ruang dengan suhu 25-28 ºC. Setelah 48 jam dilakukan pengamatan ada/tidaknya warna fluoresen di tempat gelap di bawah sinar UV (Mortensen 1989).

Uji Oksidase Kovac’s

Bakteri ditumbuhkan pada media nutrient glucose agar (NGA) dengan glukosa tidak boleh lebih dari 0,25% selama 24 jam. Larutan oksidase kovac’s (larutan Tetramethyl-paraphenylene diamine dihydrochloride 1%) dibuat secukupnya dan diletakkan pada tempat yang terhindar dari cahaya. Kertas filter Whatman No.1 diletakkan di dalam cawan petri dan ditetesi larutan tersebut sebanyak 3 – 4 tetes. Isolat bakteri yang tumbuh pada media King’s B sebanyak satu lop diambil dengan ose platina atau tusuk gigi steril, kemudian digoreskan pada tetesan larutan tersebut. Jika dalam waktu ≤ 10 detik terjadi perubahan warna menjadi ungu, maka bakteri tersebut bereaksi positif (Mortensen 1989).

Uji Arginin

Bakteri yang berumur 24-48 jam diinokulasikan dalam tabung reaksi yang berisi media Thornley’s sebanyak 3 ml dengan cara ditusukkan. Tabung reaksi yang sudah diinokulasi kemudian dilapisi dengan 1 ml mineral oil agar kondisinya anaerob. Tabung reaksi diinkubasikan selama 3 hari pada ruang dengan suhu 25-28 ºC. Pengamatan dilakukan terhadap warna media. Jika media berubah menjadi merah maka bakteri tersebut bereaksi positif. Sebaliknya jika tidak ada perubahan warna berarti bakteri tersebut bereaksi negatif (Mortensen 1989).

Penghitungan Jumlah Bakteri Terbawa Benih

Penghitungan jumlah koloni yang tumbuh menggunakan metode plate counting (BBPPMBTPH 2007). Dasar perhitungan dalam metode ini adalah jumlah bakteri yang tumbuh pada media dengan asumsi bahwa satu koloni berasal dari satu sel bakteri. Dengan demikian jumlah koloni yang muncul pada cawan petri merupakan suatu indeks bagi jumlah sel bakteri yang hidup dalam sampel. Oleh karena yang terhitung adalah jumlah koloni yang masing-masing berasal dari satu sel, sehingga satuannya adalah colony forming unit per ml (cfu/ml).

Benih sebanyak 400 butir direndam dengan natrium hipoklorit selama 1 menit, selanjutnya dibilas dengan air steril tiga kali, setelah itu benih dihancurkan serta ditambahkan air steril sebanyak (1.9 x berat 100 butir) + 50 ml.

Hasil ekstraksi diinkubasikan selama 2 jam. Suspensi bakteri diambil dengan pipet steril sebanyak 1 ml dan dimasukkan dalam tabung reaksi yang berisi air steril 9 ml, sehingga diperoleh perbandingan suspensi baru 1:10 (10^-1), kemudian dikocok hingga homogen. Cara pengenceran ini diulang dua kali sehingga mendapatkan tingkat pengenceran 10^-3. Dari pengenceran yang dibuat, diambil 100µl suspensi dan ditabur pada nutrient agar (NA). Cawan petri diinkubasi dalam keadaan terbalik pada suhu 28-30 ºC selama 2-3 hari. Jumlah koloni yang tumbuh pada tiap-tiap pengenceran dihitung berdasarkan karakter morfologi (BBPPMBTPH 2007).

Rumus perhitungan koloni : Y = X . n . 10 Keterangan Y = jumlah bakteri per ml

X = jumlah rata-rata koloni per petri pada suatu tingkat pengenceran

n = tingkat pengenceran

10 = menunjukan per ml karena yang ditabur per petri 0.1 ml

Rancangan Percobaan

Banjai dan Barabas (2002) menyebutkan bahwa data daya berkecambah dan kemurnian mengikuti distribusi binomial. Distribusi binomial ini juga berlaku untuk data pengujian kecepatan tumbuh, indeks vigor, persen infeksi cendawan dan jumlah koloni bakteri.

Untuk pengujian daya berkecambah, kecepatan tumbuh, indeks vigor dan

kesehatan benih digunakan Rancangan Acak Lengkap dengan faktor tunggal yaitu

sampel benih yang terdiri atas dua tanggal panen yang berbeda. Analisis statistik yang digunakan adalah sidik ragam dengan model sebagai berikut:

Yi = μ + αi + εi

Yi : nilai pengamatan pada tanggal panen α ke-i

μ : rataan umum

αi : pengaruh tanggal panen α taraf ke-i €i : galat percobaan tanggal panen α taraf ke-i

Apabila terdapat pengaruh nyata terhadap peubah yang diamati, dilakukan uji lanjut dengan Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada α 5%.

Dalam dokumen Efektivitas matriconditioning plus agens hayati dalam pengendalian patogen terbawa benih, peningkatan vigor dan hasil padi (Halaman 27-34)