3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan mulai dari bulan Juni 2007 sampai bulan Oktober 2007. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Patologi Klinik Bagian Penyakit Dalam Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patologi; Laboratorium Protozoologi Bagian Parasitologi serta Kandang Hewan Percobaan yang dikelola oleh Unit Pelayanan Teknis Hewan Laboratorium (UPT Helab) Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah kandang kelinci, tempat pakan dan minum kelinci, syringe, kapas, tabung reaksi, rak tabung reaksi, kertas label, spidol, pipet, hemositometer Neubauer, counter, pipet pengencer eritrosit, pipet Sahli, tabung Sahli, mikroskop, cover glass, tabung kapiler hematokrit ukuran 75 mm diameter 1 mm, microhematokrit reader, crestoseal, alat sentrifuse, kain kasa, gunting, dan lakban.
Bahan yang digunakan adalah kelinci lokal berjenis kelamin jantan yang berumur 6-8 bulan, caplak R. sanguineus betina dewasa, pakan kelinci, akuades, alkohol 70%, EDTA, larutan pengencer Hayem, dan HCl 0,1 N.
3.3 Hewan Percobaan
Hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kelinci lokal berjenis kelamin jantan, sudah dewasa dengan umur 6-8 bulan. Jumlah kelinci yang digunakan dalam penelitian delapan ekor. Empat ekor kelinci di lakukan vaksinasi, sedangkan empat ekor lainnya sebagai kontrol (tidak divaksin). Kelinci diberi pakan berupa pelet ikan dan minimal dua hari sekali diberi pakan rumput. Air minum yang diberikan berasal dari air PDAM. Pakan dan minum diganti setiap hari sekali. Kandang terbuat dari kawat besi dan setiap kandang hanya diisi satu ekor kelinci. Kandang dibersihkan setiap hari sekali. Kandang kelinci di tempatkan jauh dari keramaian, karena kelinci hewan yang sangat sensitif dan
mudah stres. Kebersihan kandang selalu dijaga agar kelinci tetap sehat dan tidak terserang skabies, karena kelinci sangat rentan terserang skabies.
3.4 Pembuatan vaksin
Vaksin dibuat dari caplak R. sanguineus betina yang siap bertelur yang dijadikan ekstrak caplak. Pertama caplak diseksi kemudian direndam dalam larutan PBS (pH 7.4) dan disimpan dalam temperatur -20oC. Organ caplak disentrifuse dengan kecepatan 5000 kali grafitasi selama 15 menit, kemudian supernatan dibuang dan organ disuspensikan dalam PBS. Prosedur ini diulang sampai diperoleh supernatan yang jernih, kemudian disonifikasi selama 10 menit dengan 1/10 siklus (60 W). Ekstrak kemudian disentrifuse dengan kecepatan 15000 kali gravitasi selama satu jam pada suhu 4oC. Supernatan difiltrasi dengan miliophore (0.22µm) dan disimpan pada suhu -20oC sampai vaksin digunakan (Bechara et al. 1994).
3.5 Pengambilan Sampel Darah
Sampel darah diambil setiap dua minggu sekali sebanyak empat kali untuk masing-masing kelinci yaitu pada minggu ke nol, dua, empat, dan tujuh. Darah diambil melalui vena auricularis menggunakan syringe 1 ml. Satu mililiter sampel darah dicampur dengan antikoagulan (EDTA). Sampel darah yang dicampur EDTA digunakan untuk menghitung total RBC, menghitung kadar hemoglobin, dan menghitung nilai hematokrit (PCV).
3.6. Vaksinasi
Vaksinasi dilakukan sebanyak dua kali selama penelitian yaitu pada minggu ke dua dan minggu ke empat. Vaksinasi diberikan secara subkutan di bagian leher belakang dengan dosis 125 µg ekstrak caplak dalam 50 µg freund adjuvant sehingga volume akhir 1.0 ml untuk masing-masing kelinci. Vaksinasi dilakukan sesaat setelah pengambilan sampel darah.
3.7 Uji Tantang Caplak Rhipicephalus sanguineus
Infestasi caplak R. sanguineus dilakukan satu minggu setelah vaksinasi terakhir, yaitu pada minggu ke lima. Infestasi caplak dilakukan dengan menginokulasi caplak di salah satu daun telinga kelinci. Caplak yang diinokulasi terdiri dari 10 ekor caplak betina dewasa. Setelah caplak diinokulasi, daun telinga ditutup dengan kain kasa dengan tujuan agar caplak yang sudah diinokulasi tidak pindah dari daun telinga ke bagian tubuh yang lain dan udara masih dapat bersirkulasi, sehingga caplak tidak mati.
3.8 Penghitungan Total Eritrosit
Penghitungan jumlah sel darah merah menggunakan darah yang sudah dicampur dengan EDTA. Darah yang sudah dicampur EDTA dihisap menggunakan pipet pengencer eritrosit sampai batas 0.5, kemudian ditambahkan larutan pengencer Hayem sampai batas skala 101. Campuran ini kemudian dihomogenkan. Campuran yang sudah dihomogenkan kemudian diteteskan pada kamar hitung Neubauer kemudian ditutup dengan cover glass. Campuran harus tersebar merata di seluruh permukaan cover glass. Kemudian amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 400 kali.
Rumus yang digunakan untuk menghitung jumlah sel darah merah per mm3 darah adalah :
Y = R sel x fp x fv
Keterangan : Y : jumlah sel darah merah per mm3 darah
R sel : jumlah sel darah merah yang terhitung dari kelima kotak fp : faktor pengencer (200X)
fv : faktor volume (50X)
3.9 Penghitugan Kadar Hemoglobin
Metode yang digunakan dalam penghitungan kadar hemoglobin adalah metode Sahli dengan larutan pengencer HCl 0.1 N dan akuades. Pengambilan sampel dilakukan dengan menggunakan pipet Sahli sampai batas garis 20 µl. Sampel darah kemudian dimasukkan ke dalam tabung Sahli yang telah diisi HCl 0.1 N sampai garis angka 10 (garis paling bawah pada tabung). Campuran diaduk
agar homogen, kemudian ditambahkan akuades sedikit demi sedikit dengan dilakukan pengadukan sampai warna campuran sama dengan warna standar. Jika warna campuran sudah sama dengan warna standar, kemudian dilihat batas bawah (meniskus bawah) campuran dan dicocokkan dengan skala yang tertulis di tabung. Hasil yang diperoleh berupa angka yang dinyatakan dalam satuan gram%. sebaiknya pembacaan skala dilakukan di tempat yang cukup cahaya agar hasil yang diperoleh lebih akurat.
3.10 Penghitungan Nilai Hematokrit
Metode yang digunakan dalam penghitungan nilai hematokrit adalah metode mikrohematokrit. Pengambilan sampel darah dilakukan dengan menggunakan tabung kapiler hematokrit sampai batas kira-kira duapertiga dari panjang tabung kapiler hematokrit. Bagian bawah tabung disumbat menggunakan crestoseal. Selanjutnya sampel darah disentrifuse dengan kecepatan 1500 rpm selama 5 menit. Kemudian hasilnya dibaca menggunakan microhematocrit reader.
3.11 Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan uji ANOVA kemudian dilanjutkan dengan uji DUNCAN (Mattjik dan Sumertajaya 1999).