Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Juli 2005 sampai Agustus 2005. Pengambilan sampel di Kawasan Usaha Ternak (KUNAK) Cibungbulang Kabupaten Bogor. Pemeriksaan mikrobiologik dan angka katalase dilakukan di Laboratorium Kesehatan Masyarakat Veteriner (Kesmavet) Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor
Bahan dan alat
Penelitian ini menggunakan 60 sampel susu kandang yang diperoleh dari KUNAK Bogor. Bahan yang digunakan dalam uji jumlah total bakteri (TPC) adalah buffered peptone water (BPW) 0.1 %, Plate Count Agar (PCA), alkohol 70%, dan es. Sedangkan bahan yang digunakan dalam uji Katalase adalah Hidrogen Peroksida (H2O2) 0.5 %.
Peralatan yang digunakan untuk pengambilan sampel adalah botol sampel steril, kantong plastik steril, termos, termometer, tissue, dan kain lap. Peralatan yang digunakan dalam uji jumlah total bakteri (TPC) adalah tabung reaksi steril, pipet 1 ml dan 10 ml, api bunsen, tube shaker, cawan petri steril, lemari es, dan inkubator dengan suhu 370C. Peralatan yang digunakan untuk penghitungan jumlah koloni adalah spidol, alat hitung (counter) dan Quebec Colony Counter. Peralatan yang digunakan dalam uji Katalase adalah tabung katalase steril, kantong plastik steril, api bunsen, dan inkubator dengan suhu 370C.
Metode Penelitian
Pengambilan Sampel
Sampel susu yang digunakan dalam penelitian adalah sampel susu kandang hasil pemerahan pagi, yang diambil dari peternak pada saat disetorkan ke Tempat Pengumpulan Susu (TPS). Sampel susu diambil dari 30 kandang yang berasal dari peternakan KUNAK I dan 30 sampel yang berasal dari peternakan
KUNAK II. Sampel kandang tersebut masing-masing diambil sebanyak ± 30 ml dan dimasukan dalam 2 botol sampel dengan masing-masing ± 15 ml. Satu botol disimpan pada suhu rendah (<100C) dan satu botol lagi disimpan dalam suhu ruangan (±27.50C). Kegiatan pengambilan sampel ini dilakukan secara aseptis untuk meminimalkan kontaminasi.
Pemeriksaan Mikrobiologik
Pemeriksaan status mikrobiologik yang dilakukan adalah jumlah total bakteri dan uji Katalase. Pemeriksaan jumlah total bakteri dilakukan dengan menggunakan metode hitungan cawan atau Total Plate Count (TPC). Setelah itu dilakukan uji Katalase. Jumlah sampel setiap kali pengujian adalah 15 sampel. Pengujian setiap sampel dilakukan 2 kali, dengan selang 3 jam setelah pengujian pertama.
Pemeriksaan Jumlah Total Bakteri
Prinsip
Pemeriksaan jumlah total bakteri dalam penelitian ini menggunakan metode hitungan cawan (Total Plate Count). Prinsip metode hitungan cawan (TPC) adalah jika satu sel bakteri ditumbuhkan pada media agar, maka akan tumbuh menjadi satu koloni yang tampak oleh mata.
Cara Kerja
Pemeriksaan jumlah total bakteri dilakukan dengan pengenceran desimal 10-1, 10-2, 10-3,10-4,10-5.
Pengenceran desimal 10-1 dilakukan dengan cara memindahkan 1 ml sampel susu ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml larutan BPW 0,1%. Kemudian tabung reaksi dihomogenkan dengan menggunakan tube shaker. Kemudian dengan menggunakan pipet 1 ml yang berbeda, pengenceran 10-2 dilakukan dengan memindahkan 1 ml larutan pengenceran 10-1 ke dalam 9 ml larutan BPW 0,1 %. Sehingga didapatkan pengenceran desimal 10-2 kemudian dihomogenkan. Selanjutnya, pengenceran dilakukan dengan cara yang sama untuk memperoleh pengenceran 10-3, 10-4 dan 10-5.
Setelah pengenceran selesai dilakukan, kemudian dilakukan pemupukan. Dalam pemeriksaan jumlah bakteri ini, pemupukan dilakukan dari pengenceran desimal 10-3 sampai pengenceran desimal 10-5. Pemupukan dilakukan dengan cara memasukkan 1 ml masing-masing pengenceran ke dalam cawan petri steril yang telah diberi label sebelumnya, yang disesuaikan dengan angka pengenceran. Masing-masing cawan petri tersebut dituangkan 10-15 ml PCA (suhu 40-45oC). Setelah itu dihomogenkan isinya secara perlahan (perhatikan jangan sampai cairan tersebut keluar dari cawan petri) dan didiamkan pada suhu ruangan agar memadat. Setelah memadat, diinkubasi pada suhu 35-37oC, selama 18-24 jam.
Susu 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 0,1 % 0,1 % 0,1 % 0,1 % 0,1 % 1 ml 1 ml 1 ml cawan petri
15-20 ml agar PCA dituangkan sesudah larutan sample dimasukkan kedalam cawan petri
Gambar 6. Skema metode hitungan cawan (TPC)
Pengamatan dan Penghitungan Jumlah Bakteri
Pengamatan dan penghitungan jumlah bakteri dilakukan setelah 18-24 jam masa inkubasi. Penghitungan bakteri dilakukan dengan melakukan penghitungan jumlah koloni yang tumbuh. Penghitungan jumlah koloni ini menggunakan alat bantu hitung dan Quebec Colony Counter.
Penghitungan jumlah bakteri dilakukan pada semua koloni yang tumbuh dalam setiap cawan petri. Jumlah mikroba per ml dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut :
Jumlah bakteri per gram/ ml = jumlah koloni x 1
faktor pengenceran
Pedoman penghitungan jumlah bakteri (Lukman DW et al. 2007)
Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 25 sampai 250.
Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni yang besar yang jumlah koloni yang diragukan dapat dihitung sebagai satu koloni.
Suatu deretan (rantai) koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni.
Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua, yaitu angka pertama di depan koma dan angka ke dua dibelakang koma. Jika angka ketiga ≥ 5 maka ia harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka yang ke dua.
Jika semua pengenceran yang dipupuk menghasilkan angka kurang dari 25 koloni per cawan petri, maka hitunglah jumlah koloni pada pengenceran terendah. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 25 dikalikan dengan besarnya pengenceran dan cantumkan jumlah sesungguhnya di dalam tanda kurung.
Jika semua pengenceran yang dipupuk menghasilkan angka lebih dari 250 koloni per cawan petri, hanya koloni pada pengenceran tertinggi yang dihitung hasilnya dilaporkan sebagai lebih besar dari 250 dikalikan besarnya pengenceran dan jumlah sesungguhnya dilaporkan di dalam tanda kurung. Jika terdapat dua cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan jumlah koloni antara 25-250 dan perbandingan antara hasil pengenceran tertinggi dan 19
terendah < 2,0 maka dilaporkan rata-rata jumlah kedua cawan petri tersebut dengan memperhitungkan pengencerannya. Jika perbandingan keduanya >2,0 maka dilaporkan hasil dari pengenceran terkecil (dengan memperhitungkan pengencerannya).
Jika digunakan dua cawan petri (duplo) setiap pengenceran, data yang diambil harus dari kedua cawan tersebut, tidak boleh diambil salah satu, meskipun salah satu cawan tidak menghasilkan 25-250 koloni.
Jika pada pengenceran yang terendah menghasilkan angka 0, misal 0 x 101 maka hasilnya dilaporkan sebagai est < 101 di dalam tanda kurung.
Uji Katalase
Prinsip
Bakteri, reruntuhan sel ambing dan sel organis yang ada di dalam susu dapat menghasilkan berbagai enzim. Salah satunya adalah enzim katalase. Enzim katalase akan membebaskan oksigen (O2) dari larutan peroksida-nya (H2O2). Volume gas O2 yang dibebaskan ini yang akan diukur.
Cara Kerja
Dengan menggunakan pipet 10 ml, sampel susu dimasukkan ke dalam tabung katalase steril. Kemudian, 5 ml H2O2 0,5% ditambahkan ke dalamnya dan dihomogenkan dengan cara membolak-balik tabung. Kemudian susu ditempatkan pada bagian vertikal tabung yang terdapat skala di puncaknya. Tabung disumbat dengan kapas, kemudian dimasukkan ke dalam inkubator dengan suhu 37 0C selama 3 jam. Setelah diinkubasi, volume gas O2 yang terbentuk di puncak tabung dihitung. Jumlah ml O2 menunjukkan angka katalase. Bila terdapat busa, maka rasio cairan dan gas adalah 1:1.
Analisis Statistik
Data yang diperoleh diolah dengan analisa metode statistik uji t-Student dan analisa secara deskriptif.