Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Penyakit Tumbuhan dan Rumah Kaca Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara, pada bulan April hingga Desember 2014.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: oven, autoklaf, laminar air flow, rotary shaker, inkubator, mikroskop, timbangan digital, kompor, erlenmeyer, cawan petri, tabung reaksi, rak tabung, api bunsen, gelas ukur, kain saring, kertas saring, plastik pembungkus, aluminium foil, cling wrap, pipet tetes, pinset, coke borer, spatula, gunting, pisau, kertas koran, plastik, kapas, kertas label, spidol, membran filter 0,22 µm dan 0,45 µm (Millipore), holder dan penggaris.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah biakan bakteri
Xathmonas albilinieans. Jamur endofit yang diisolasi dari akar, batang dan daun tanaman tebu yang sehat, medium PDA (Potato Dextroce Agar), larutan NaOCl 1% (Sodium Hipoklorit), PDB (Potato Dextroce Broth), media YDCA (Yeast Extract Dextrose Calcium Carbonate Agar), air suling steril, spirtus, kapas, alkohol 96%, kertas cakram, kertas saring Wattman 41, dan tissu .
Pelaksanaan Penelitian Sterilisasi Alat dan Bahan
Sebelum penelitian dimulai terlebih dahulu menyeterilkan alat dan bahan, untuk alat-alat gelas dan cawan petri dicuci terlebih dahulu kemudian dikeringkan.
Alat-alat dan bahan kemudian dibungkus dan memasukkannya ke dalam autoklaf pada suhu 121 °C selama 15 menit.
Isolasi bakteri Xanthomonas albilineans
Bagian tanaman tebu yang terserang penyakit vaskular bakteri X. albilineans dibersihkan dengan air mengalir, lalu dipotong dengan ukuran 2-3 cm. Setelah itu sampel direndam dengan etanol 70% selama 30 detik, kemudian direndam dengan 0.1% HgCl selama 3 menit dan dibilas dengan air suling steril 2-3 kali (Gagne et al. 1987). Selanjutnya sampel digerus dengan mortal steril dan diberikan sedikit air (1ml), lalu tambahkan 9 ml air suling steril untuk
pengenceran. Pengenceran dilakukan 10⁻³ - 10-5, kemudian dihomogenkan selama 2 menit. Selanjutnya disebar 0,1 ml di atas media YDCA, diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam (Hung dan Annapurna, 2004).
Pewarnaan Gram Bakteri
Bakteri yang berhasil diisolasi dan telah murni dibiakan dalam media NA.
Setelah diinkubasi selama ± 48 jam kemudian diamati morfologi koloni bakteri tersebut. Biakan murni bakteri yang telah ditanam pada cawan petri diidentifikasi morfologi sel nya dengan pewarnaan gram. Bila bakteri tetap berwarna ungu diakhir pewarnaan, berarti bakteri bersifat Gram-positif, tetapi bila setelah di beri larutan pemucat (alkohol/etanol) berubah warna menjadi merah maka bakteri bersifat Gram-negatif.
Postulat Koch
Uji Postulat Koch dilakukan untuk mengisolasi bakteri patogen melalui gejala penyakit yang ditimbulkannya. Uji Postulat Koch dilakukan dengan mengencerkan isolat murni X. albilineans berumur 2x24 jam menggunakan air
suling steril hingga kerapatan 106. Inokulan kemudian diinokulasikan pada tanaman tebu yang sehat menggunakan metode gunting. Metode gunting
dilakukan dengan mencelupkan gunting pada suspensi bakteri dan diguntingkan pada daun tanaman (±0.5-2 cm), setiap pergantian inokulan gunting dibilas dengan alkohol agar kemurnian inokulan yang diinokulasikan terjaga (Cottyn et al., 1994). Pada pengujian ini digunakan tanaman tebu stadia bibit berumur 1-2 bulan setelah tanam varietas BZ 134. Pengamatan dilakukan 1-4 minggu setelah inokulasi (Rachmawati, 2009).
Eksplorasi Jamur Endofit dari Tanaman Tebu
Isolat jamur endofit diperoleh dengan cara mengisolasi langsung dari tanaman tebu yang sehat dari suatu pertanaman tebu, karena diduga pada tanaman tebu yang sehat terdapat jamur yang bersifat antagonis terhadap bakteri patogen, itulah yang menyebabkan tanaman tebu tersebut bebas dari penyakit yang disebabkan oleh bakteri patogen. Tebu varietas BZ 134 yang akan dijadikan sampel diambil dari beberapa lokasi di PTPN II Sei Semayang.
Jamur endofit diperoleh dengan mengisolasi akar, batang, dan daun tanaman tebu yang sehat. Sterilisasi bagian tanaman dilakukan secara bertahap dengan merendam selama 60 detik dalam alkohol 70%, NaOCl 3% selama 60 detik, dan etanol 70% selama 30 detik. Kemudian dibilas sebanyak dua kali dengan aquades steril dan dikeringkan di atas kertas saring steril. Bagian tanaman dibelah untuk ditumbuhkan dalam media PDA. Jamur yang tumbuh dari dalam jaringan tanaman dimurnikan dalam media PDA (Rodriques, 1994).
Identifikasi isolat jamur endofit
Semua jamur endofit yang didapat selanjutnya diidentifikasi dengan melihat ciri makroskopis dan mikroskopis, dengan mengacu pada buku petunjuk klasifikasi Illustrated Genera Imperfect Fungi menurut Barnett dan Hunter (1972)
dan Illustrated Manual on Identification of Seed-borne Fungi menurut Hyun et al (2004).
Seleksi Jamur Endofit Penghasil Crude Antibiotik
Produksi metabolit antimikroba oleh jamur endofit dilakukan dengan cara menumbuhkannya di dalam medium PDB. Koloni jamur endofit yang telah
diinkubasi pada medium PDA selama 48 jam pada suhu 25oC, diambil 5 cork bore dengan menggunakan jarum ose dan diinokulasikan ke medium PDB dalam Erlenmeyer 100 ml. Kemudian diinkubasi pada suhu 25oC dalam shaker
incubator 130 rpm (Sunarmi, 2010) selama 5-7 hari lalu disaring dengan kertas saring Wattman 041 untuk mendapatkan suspensi antibiotik. Suspensi antibiotik disentrifugasi dengan kecepatan 3800 rpm selama 20 menit. Supernatan dibagi menjadi dua bagian (A dan B) dan diambil untuk sterilisasi dengan cara yaitu sterilisasi autoklaf dan membran filter (Pavithra et al., 2012) :
a. Sterilisasi Autoklaf
Supernatan A dimasukkan ke erlenmeyer kemudian ditutup dengan kapas steril dan aluminium foil, disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121oC selama 15 menit. Hasil tersebut adalah suspensi antibiotik yang digunakan dapat melakukan ekstraksi crude antibiotik.
b. Sterilisasi Membran Filter
Supernatan B disterilisasi dengan membran filter ukuran pori 0,45µm dan 0,22µm sehingga mikroba tertahan dalam pada filter tersebut. Filter ini sebelumnya telah disterilkan dengan autoklaf.. Hasil tersebut adalah suspensi
antibiotik yang telah steril digunakan agar dapat melakukan ekstraksi crude antibiotik (Abimbola, 2014).
Ekstraksi Crude Antibiotik
Suspensi antibiotik diekstraksi dengan pelarut Chloroform dengan
perbandingan 1:1 (v/v). Campuran pelarut dan suspensi antibiotik dihomogenkan sebelum dimasukkan ke dalam corong pemisah, kemudian didinginkan kedalam lemari pendingin selama 4 jam pada suhu 9-10oC untuk optimalisasi pengikatan pelarut terhadap antibiotik (Tawiah et al., 2012). Campuran pelarut dan suspensi antibiotik ditampung dalam beaker glass (yang telah ditimbang beratnya) dan diuapkan sampai kering di dasar beaker glass, endapan ini adalah crude antibiotik yang perlu diketahui beratnya dengan cara menimbang kembali berat kotor beaker glass untuk menekan berat antibiotik yang diperoleh. Endapan crude antibiotik yang didapatkan diencerkan dengan alkohol 96 % dan simpan botol universal sebagai cairan stok (Abimbola, 2014; Anggraini, 2012).
Berat crude antibiotik = berat kotor beaker glass – berat bersih beaker glass.
Pengujian antagonis crude antibiotik jamur endofit dengan bakteri patogen
Pengujian dilakukan antara X. albilnieans dengan antibiotik jamur endofit yang didapat dalam satu cawan petri yang berdiameter 9 cm. Uji antagonisme dilakukan dengan cara memasukkan koloni dari biakan murni X. albilnieans ke dalam media NA kemudian dituang pada satu cawan petri. Uji aktivitas
antibakteri isolat jamur terhadap bakteri patogen dilakukan dengan metode uji Kirby-Bauer menggunakan kertas cakram. Kertas cakram dibuat dari kertas saring Whatman dengan cara mengguntingnya dengan alat pembolong kertas sehingga didapatkan kertas cakram dengan diameter 6 mm (Cappucino dan Sherman, 1996).
Secara aseptik, kertas cakram yang sudah disterilkan direndam di dalam supernatan kultur jamur endofit selama 30 menit. Kertas cakram diambil dengan menggunakan pinset steril dan diletakkan di atas medium uji aktivitas antimikroba (medium plat NA). Kemudian diinkubasi selama 18 – 24 jam pada suhu 37oC.
Setelah masa inkubasi selesai, dilakukan pengamatan terhadap zona jernih yang terbentuk dan diukur diameternya. Sampel yang mempunyai potensi
menghasilkan zat antimikroba ditunjukkan dengan adanya zona jernih.
Pertumbuhan jamur diamati setiap hari mulai 1 hari setelah inokulasi (hsi).
Media yang telah dituang dengan bakteri patogen.
Kertas saring yang telah dicelupkan pada suspensi crude antibiotik
Ulangan
Gambar 2. Uji antagonis crude antibiotik dengan patogen
Uji Hipersensitif
Uji hipersensitif adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui patogenesitas jamur endofit (kemampuan menyebabkan penyakit). Teknik pengujian ini dilakukan dengan cara menginokulasikan suspensi jamur endofit pada tanaman sukulen muda menggunakan tanaman tembakau sebagai tanaman indikator untuk uji hipersensitif. kemudian menginkubasikan tanaman tersebut dalam suhu yang sesuai (Schaad, et al., 2000; Suswanto et al. 1996) yaitu suhu 24-260C dan ditempatkan di depan Laboratorium Penyakit Tumbuhan Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara.
Dalam uji ini, respon hipersensitif ditunjukkan yaitu tidak terdapat gejala penyakit pada tanaman tembakau (tanaman tetap sehat). Jaringan daun tembakau
yang telah diinokulasi dengan suspensi jamur endofit tetap terlihat sehat dan tidak menunjukkan adanya gejala setelah diinkubasi 7 hari (Gambar 6). Berdasarkan uji tersebut, diketahui bahwa, jamur yang berhasil diisolasi dari akar, batang dan daun tanaman tebu tidak menimbulkan gejala pada tanaman tembakau (bersifat tidak patogenik).
Gambar 3. Uji hipersensitif pada daun tembakau setelah inkubasi 7 hari J1 (jamur endofit 1), J2 (jamur endofit 2), J3 (jamur endofit 3), J4 (jamur endofit
4), J5 (jamur endofit 5), J6 (jamur endofit 6), J7 (jamur endofit 7), J8 (jamur endofit 8).
Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) Faktorial dengan 3 faktor penelitian yaitu :
1. Faktor pertama Jamur Endofit (J) dengan 8 jenis jamur endofit yaitu : J1 : Jamur Endofit 1 J5 : Jamur Endofit 5
J2 : Jamur Endofit 2 J6 : Jamur Endofit 6 J3 : Jamur Endofit 3 J7 : Jamur Endofit 7 J4 : Jamur Endofit 4 J8 : Jamur Endofit 8
2. Faktor kedua konsentrasi filtrat kultur media jamur endofit/air steril yaitu dengan 4 taraf yaitu :
P1 : 1 x 10 -1
P2 : 1 x 10 -2 P3 : 1 x 10 -3 P4 : 1 x 10 -4
3. Faktor ketiga metode sterilisasi dengan 2 taraf yaitu : autoklaf (A) dan membran filter (M).
Banyak ulangan yang digunakan adalah tiga (Sudjana, 2005).
Model linear yang digunakan adalah sebagai berikut :
Yijkl = µ + Ki + αj+ βk + ᵧl + (αβ)jk + (αᵧ)jl + (β ᵧ)kl + (α β ᵧ)jkl + ∑ijkl ; Dimana :
Yijk = nilai pengamatan dari kelompok ke-I yang memperoleh taraf ke-j dari faktor 1, taraf ke-k dari faktor 2 da taraf ke-l dari faktor 3.
μ = efek nilai tengah populasi
Ki = pangaruh aditif dari kelompok ke-i αj = pangaruh aditif dari taraf ke-j faktor 1 βk = pangaruh aditif dari taraf ke-k faktor 2 ᵧl = pangaruh aditif dari taraf ke-l faktor 3
(αβ)jk = pengaruh interak taraf ke-j faktor 1 dan taraf ke-k faktor 2 (αᵧ)jl = pengaruh interak taraf ke-j faktor 1 dan taraf ke-l faktor 3 (β ᵧ)kl = pengaruh interak taraf ke-k faktor 1 dan taraf ke-l faktor 3 (α β ᵧ)jkl = pengaruh interak taraf ke-j faktor 1, taraf ke-k faktor 2 dan taraf
ke-l faktor 3
∑ijkl = efek error
(Sastrosupadi, 2000).
Pengujian bio-assay X. albilnieans dan jamur endofit 1. Persiapan media persemaian
Media persemaian yang digunakan adalah tanah top soil yang terlebih dahulu disterilkan, dimasukkan ke dalam polibeg ukuran 40 cm x 25 cm.
2. Penanaman bibit tebu
Ditanam satu bibit tebu yang berasal dari persemaian berusia 75 hari setiap satu polibeg. Bibit tebu diambil dari Kebun Sei semayang PTPN II dalam bentuk bud chip.
3. Pemeliharaan tanaman
Bibit tebu varietas Bz 134 yang telah tumbuh disiram setiap hari dan dilakukan pencabutan gulma yang tumbuh pada setiap polibag.
4. Aplikasi Crude Antibiotik di lapangan
Aplikasi crude antibiotik dilakukan saat tanaman tebu berumur 21 hari dan isolat X. albilineans dilakukan saat tanaman tebu berumur 28 hari dengan menuang crude antibiotik yang telah diencerkan pada daerah perakaran.
Peubah amatan
1. Identifikasi isolat jamur endofit
Semua jamur endofit yang didapat diidentifikasi dengan melihat ciri makroskopis dan mikroskopis dengan mengacu pada buku petunjuk klasifikasi Illustrated Genera Imperfect Fungi menurut Barnett dan Hunter (1972) dan Illustrated Manual on Identification of Seed-borne Fungi menurut Hyun et al (2004).
2. Zona hambat (mm)
Pengamatan dilakukan dengan mengukur zona bening yang dihasilkan jamur endofit terhadap X. albilnieans. Setelah masa inkubasi diameter zona bening di sekitar cakram diukur dengan menggunakan kertas millimeter.
Aktifitas ekstrak dapat dilihat dengan adanya zona bening di sekitar cakram.
Zona hambat yang terbentuk di sekitar cakram diukur diameter vertikal dan diameter horizontal dengan satuan milimeter (mm). Diameter zona hambat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Zona hambat = A – B Keterangan :
A = Diameter zona bening yang terbentuk (mm) B = Diameter kertas cakram (mm)
(Rante et. al, 2013).
3. Pertambahan Tinggi Tanaman
Pengamatan tinggi tanaman dimulai sebelum aplikasi jamur endofit dan setelah 1-8 Minggu Setelah Aplikasi (MSA). Pengamatan dilakukan dengan mengukur dari batang di atas permukaan tanah hingga titik tumbuh tertinggi tanaman. Pengamatan dilakukan dengan interval 1 minggu sekali. Pertambahan tinggi tanaman didapat dengan mencari selisih antara tinggi tanaman dua MSA dengan tinggi tanaman satu MSA.
4. Kejadian penyakit (%)
Pengamatan kejadian penyakit dilakukan mulai 1 sampai 8 minggu setelah aplikasi (MSA) X. albilnieans, yaitu dengan mengamati tanaman terserang akibat patogen X. albilnieans pada tanaman tebu. Persentase kejadian penyakit dapat dihitung dengan menggunakan rumus:
Keterangan :
P : persentase serangan penyakit (kejadian penyakit) a : jumlah tanaman yang terserang penyakit
b : jumlah tanaman yang sehat (Champoiseau et al., 2006).
5 . Keparahan penyakit (%)
Pengamatan keparahan penyakit dilakukan mulai 1 MSA sampai terdapat
tanaman mati, yaitu dengan mengamati respon layu tanaman akibat inokulasi X. albilnieans. Persentase keparahan penyakit dapat dihitung dengan
menggunakan rumus:
Keterangan :
I : intensitas serangan penyakit (keparahan penyakit) ni : jumlah tanaman yang terserang
vi : nilai kategori dari tanaman terserang N : nilai kategori tertinggi
Z : jumlah seluruh tanaman yang diamati
Skala intensitas penyakit layu vaskular bakteri tebu adalah:
0 : tidak ada gejala
1 : gejala nekrotik ringan (panjang < 10 cm) pada satu daun 2 : gejala nekrotik ringan lebih dari satu daun
3 : lebih besar dari gejala nekrotik ringan dan lebih dari satu daun
4 : gejala nekrotik ringan lebih dari satu daun dan gejala nekrotik berat (panjang >
10 cm) pada satu daun
5 : gejala nekrotik berat lebih dari satu daun (Champoiseau et al., 2009).
6. Bobot Basah Akar
Akar dicuci bersih dengan air mengalir kemudian akar ditiriskan, setelah akar kering kemudian akar ditimbang dengan menggunakan timbangan analitik.
7. Bobot Kering Akar
Masing-masing akar diberi label, kemudian dimasukkan kedalam amplop dan diberi label masing-masing perlakuan. Setelah itu akar dikering ovenkan dengan suhu 700C selama 48 jam. Setelah kering akar ditimbang kembali.