Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan April 2009 sampai dengan April 2010. Sampel diperoleh dari Kepulauan Seribu. Identifikasi cacing parasitik dilakukan di Laboratorium Parasitologi Balai Uji Standar Karantina Ikan Jakarta dan Laboratorium Helmintologi, Bagian Parasitologi dan Entomologi Kesehatan, Departemen IPHK Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor (IPB). Analisis patologi dilakukan di Bagian Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi (KRP), Fakultas Kedokteran Hewan - IPB.
Bahan dan Alat Bahan
Sampel ikan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan Bunglon Batik Jepara. Bahan yang digunakan untuk identifikasi cacing parasitik terdiri dari : aquades, larutan garam fisiologis, Alkohol Formalin Acetic acid (AFA), glycerin jelly dan pewarnaan semichon
13
dan kamera foto. Alat untuk pembuatan sediaan histologi adalah 1 set alat bedah, wadah penyimpanan jaringan, tissue prosessor, tissue embedding, inkubator, sliding microtome, waterbath dan gelas objek. Alat yang digunakan untuk pewarnaan HE adalah staining jar, rak slide dan gelas penutup. Selanjutnya untuk pengamatan hasil penelitian digunakan mikroskop cahaya dan kamera foto.
Metode Penelitian Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan 2 (dua) kali berdasarkan musim yaitu pada bulan April (musim kemarau) dan September (musim hujan). Sampel ikan diperoleh dari nelayan binaan CV. Dinar yang melakukan penangkapan disekitar perairan Kepulauan Seribu. Pengambilan sampel ikan dilakukan berdasarkan kelompok ukuran yang diperdagangkan yaitu ukuran small (S), medium (M) dan large (L). Jumlah sampel yang dikumpulkan sebanyak 32 ekor.
Ikan sampel selanjutnya diaklimatisasi di Laboratorium Balai Uji Standar Karantina Ikan Jakarta selama ± 48 jam dalam akuarium dengan ukuran 40 cm x 20 cm x 24 cm. Selama aklimatisasi wadah penampungan diberi sistem sirkulasi air yang cukup. Untuk mempertahankan kelangsungan hidup ikan maka dilakukan pemberian pakan dan pergantian air 50% setiap harinya. Pakan yang diberikan berupa udang rebon sebanyak 2 kali sehari. Air yang digunakan sebagai media pemeliharaan adalah air laut dengan salinitas 32-35 ppm yang diperoleh dari instalasi penyediaan air Balai Uji Standar Karantina Ikan Jakarta.
Pengukuran Sampel
Sampel ikan Bunglon Batik Jepara diukur panjang total (TL) menggunakan penggaris dan berat tubuhnya ditimbang dengan menggunakan timbangan analitik.
Pengamatan Cacing Parasitik
Untuk mengamati cacing parasitik, spesimen cacing diambil dari kulit, sirip, insang dan saluran pencernaan. Pengambilan spesimen cacing pada bagian kulit dan sirip dilakukan dengan cara mengerok lendir yang terdapat pada permukaan
tubuh kemudian diletakkan diatas objek gelas yang telah ditetesi dengan larutan garam fisiologis. Selanjutnya hasil kerokan lendir diamati di bawah mikroskop.
Pengamatan insang dilakukan dengan cara membuka operkulum dan mengeluarkan insang dari rongga kemudian dimasukkan ke dalam cawan petri yang telah berisi larutan garam fisiologis. Lembar-lembar insang tersebut diamati di bawah mikroskop dan spesimen cacing yang ditemukan difiksasi dengan larutan Alkohol Formalin Acetic acid (AFA).
Pengamatan cacing dalam usus dilakukan dengan cara membedah ikan kemudian saluran pencernaan dikeluarkan dari dalam tubuh dan diletakan dalam cawan petri yang telah diisi dengan larutan garam fisiologis. Untuk pemeriksaan parasit yang terdapat di usus, usus dibuka dan dimasukkan ke dalam larutan garam fisiologis selama 5
15
Pewarnaan Nematoda
Metode pewarnaan cacing nematoda dilakukan berdasarkan PKP (1999) yang dimodifikasi. Tahapan kerja pewarnaan cacing Nematoda yaitu pencelupan spesimen pada larutan konsentrasi alkohol 70%, 80% dan 90 % selama 15 menit, kemudian tambahkan minyak cengkeh selama 20 menit, bilas spesimen dalam larutan alkohol 70%, pindahkan spesimen ke dalam larutan alkohol bertingkat (96%, 100%, 100%) masing-masing selama 15 menit. Kemudian dilakukan mounting dengan glycerin jelly.
Identifikasi Cacing Parasitik
Tingkat infestasi cacing parasitik ditentukan dengan mengidentifikasi dan menghitung prevalensi dan intensitas cacing yang ditemukan di insang dan usus. Identifikasi jenis cacing mengacu pada Velasquez (1975), Moller dan Anders (1983), Williams dan Jones (1994), Hoffman (1999), De dan Maity (2000) dan Santos et al. (2001).
Pengamatan Sel darah
Parameter darah yang diamati yaitu diferensial leukosit. Pengamatan diferensial leukosit melalui preparat ulas darah dilakukan untuk menentukan prosentase tiap jenis leukosit yang ada dalam darah.
Pembuatan ulas darah dilakukan dengan cara sampel ikan Bunglon Batik Jepara dianesthesia menggunakan MS 222 selama kurang lebih 3 menit, selanjutnya bagian batang ekor (caudal penducle) dipotong dengan menggunakan pisau bedah yang steril, kemudian darah ditempatkan pada gelas objek pertama, gelas objek kedua digeser ke arah yang berlawanan hingga membentuk lapisan tipis darah. Preparat dibiarkan kering oleh udara, kemudian diwarnai dengan menggunakan larutan hemacolor.
Tahapan pewarnaan hemacolor yaitu slide ulas darah ditetesi dengan larutan I selama 5 detik, kemudian tetesi larutan II selama 3 detik dan selanjutnya ditetesi larutan III selama 6 detik. Untuk selanjutnya, cuci slide ulas darah dengan larutan PBS dan rendam selama 20 menit. Setelah preparat dikeringkan dengan tissue (kertas penyerap), lalu ditetesi entellan dan ditutup dengan cover glass kemudian
jenis-jenis leukosit dan trombosit dihitung sampai berjumlah 100 sel ((Martins et al. 2004).
Patologi Anatomi (PA)
Sampel ikan dinekropsi dengan cara membuat sayatan dari bagian anal hingga bagian posterior insang. Pada saat nekropsi semua kelainan diamati dan dicatat. Pemeriksaan patologi anatomi dilakukan secara makroskopis. Sebagian insang dan usus dimasukan dalam larutan Normal Buffer formalin untuk pemeriksaan histopatologi.
Pembuatan Sediaan Histopatologi
Jaringan insang dan usus difiksasi di dalam Buffer Neutral Formalin (BNF) 10% selama 48 jam. Selanjutnya sampel dimasukkan ke dalam tissue cassette
untuk proses pembuatan sediaan histopatologi dengan menggunakan alat
automatic tissue processor. Proses pembuatan sediaan histopatologi melalui tahapan dehidrasi di dalam larutan alkohol bertingkat (70%, 80%, 90% dan 95%), penjernihan (clearing) dilakukan dengan larutan xylol (I dan II). Selanjutnya dilakukan proses infiltrasi paraffin cair ke dalam jaringan. Pembuatan blok jaringan dilakukan dengan menggunakan tissue embedding console. Blok dipotong menggunakan dengan microtom dengan ketebalan 4-5 µm. Hasil sayatan jaringan diletakkan pada gelas objek dan diinkubasi dalam inkubator dengan suhu 370C selama satu malam.
Sebelum pewarnaan, sayatan jaringan insang dan usus selanjutnya dideparafinisasi dan rehidrasi (lampiran 1). Setelah kedua tahap tersebut, dilakukan proses pewarnaan dengan metode hematoxyllin dan eosin (HE) (Humason 1972).
Preparat yang telah diwarnai diamati di bawah mikroskop cahaya untuk melihat lesio histopatologi pada insang dan usus. Analisis perubahan histopatologi dilakukan dengan menggunakan metode skoring yang mengacu pada Camargo dan Martinez (2007) yang dimodifikasi. Skor lesio ditentukan berdasarkan perubahan patologi yang ditemukan. Hasil skoring digunakan sebagai pendukung
17
dalam menentukan derajat keparahan organ dan status penyakit. Penentuan nilai skor yang diamati dapat di lihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Nilai skor lesio histopatologi organ
Skor Kriteria Lesio
Organ
Insang Usus
1 Kongesti Kongesti
Hyperplasia epithel Hiperplasia sel goblet Edema
2 Hemoragi ringan Hemoragi ringan Peradangan ringan Peradangan ringan Fusi lamella sekunder Nekrosa ringan
Nekrosa ringan
3 Hemoragi sedang Hemoragi sedang Peradangan sedang Peradangan sedang
Nekrosa sedang Nekrosa sedang 4 Hemoragi berat Hemoragi berat Peradangan berat Peradangan berat
Nekrosa berat Nekrosa berat
Analisis Data
Analisis data infestasi cacing parasitik dan ukuran panjang ikan Bunglon Batik Jepara menggunakan metode statistik non parametrik Chi Kuadrat (X2) (Simbolon 2009) sedangkan data prevalensi dan intensitas cacing parasitik, morfologi dan jumlah sel leukosit serta skoring lesio organ insang dan usus dianalisis secara deskriptif. Data ditampilkan dalam bentuk tabel dan histogram.