Metode
Identifikasi keragaman genetik jarak pagar dilakukan menggunakan karakter bunga dan DNA dengan teknik AFLP. Penelitian dilakukan mengikuti bagan alir yang tertera pada Gambar 3.
Gambar 3 Bagan alir penelitian identifikasi keragaman genetik jarak pagar (Jatropha curcas L.) berdasarkan karakter bunga dan DNA
menggunakan teknik AFLP.
Penyiapan bahan tanaman
Identifikasi keragaman genetik
Karakter bunga :
Jumlah bunga jantan Jumlah bunga betina
Daun dari tanaman berumur 2 bulan diambil untuk analisis DNA dengan teknik AFLP
Teknik AFLP: Isolasi DNA Restriksi DNA dan ligasi adaptor Amplifikasi fragmen hasil restriksi
Analisis data karakter bunga dan AFLP :
Analisis similaritas
Analisis Komponen Utama
Penyiapan Bahan Tanaman
Bahan tanaman berupa 10 aksesi jarak pagar yang meliputi aksesi Madiun, Dompu, Bengkulu, Lampung, Bangka, Ponorogo, Kediri, Jember, Subang dan Sukabumi (Lampiran 1). Biji jarak pagar dikecambahkan dengan cara meletakkan biji pada bak plastik yang telah dilapisi dengan kertas tissu basah. Selanjutnya biji ditutup kembali dengan kertas tissu basah dan dibiarkan pada suhu ruang selama dua minggu. Setelah dua minggu kecambah dipindahkan ke polibag ukuran 5x15 cm (0.5 kg) yang berisi tanah latosol dan pupuk kandang dengan perbandingan 1:1, kemudian tanaman diletakkan di rumah kaca. Setelah satu bulan tanaman dipindahkan ke polibag berukuran 25x50 cm (10 kg) yang berisi tanah dan pupuk kandang dengan perbandingan 1:1.
Pengamatan Karakter Bunga
Pengamatan karakter bunga dimulai pada saat tanaman mulai berbunga yaitu 4 bulan setelah tanam (BST). Karakter bunga yang diamati adalah rasio bunga jantan dan betina. Penghitungan rasio bunga jantan dan betina berdasarkan pada jumlah infloresen yang muncul selama bulan Mei sampai Oktober 2007.
Pembuatan Sayatan Melintang Bunga
Bunga difiksasi di dalam larutan FAA [5 bagian formalin, 5 bagian asam asetat glasial, 90 bagian alkohol 70% (v/v)]. Sampel yang telah difiksasi selama 24 jam di dalam larutan FAA, didehidrasi dengan larutan seri n-Butanol III–VII masing-masing selama 1 jam (Nakamura 1995). Parafin diinfiltrasikan secara bertahap, dengan cara menambahkan parafin ke dalam n-Butanol p.a. dengan perbandingan 1:1 dan disimpan di dalam oven pada suhu ruang selama 12 jam. Kemudian disimpan lagi di dalam oven pada suhu 50-60 ºC selama 24 jam. Parafin yang bercampur dengan dehidran diganti dengan parafin murni dan disimpan di dalam oven pada suhu 50-60 ºC selama tiga hari. Sampel kemudian ditanam di dalam parafin. Blok sampel diiris dengan ketebalan 10 m menggunakan mikrotom putar (Yamato RV-240). Pita parafin yang diperoleh direkatkan pada gelas obyek yang telah diolesi dengan larutan albumin-gliserin dan dikeringkan di atas hot plate dengan suhu 40 ºC selama 3 sampai 5 jam.
Sampel diwarnai dengan safranin 2% (b/v) di dalam air dan fastgreen 0.5% (b/v) di dalam alkohol 95% (v/v).
Analisis AFLP
Isolasi DNA. Isolasi DNA dilakukan menggunakan metode CTAB (Cetil Trimetil Amonium Bromida) menurut Doyle dan Doyle (1987) yang dimodifikasi yaitu dengan penambahan PVP (Polyvinyl Pyrrolidon). Sebanyak 0.5 g daun jarak pagar ditambahkan nitrogen cair kemudian digerus dalam lumpang porselin sampai menjadi serbuk. Selanjutnya serbuk daun dimasukkan ke dalam tabung ependorf yang berisi 600 µl campuran bufer ekstrak [CTAB 2% (b/v), EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetic) 0.02 M, Tris-HCl 1 M pH 8, NaCl 1.4 M dan PVP 1% (b/v)] serta 2 l β-merkaptoetanol. Ekstrak diinkubasi pada suhu 65 ºC selama 1 jam. Pemurnian dilakukan di dalam campuran larutan kloroform dan isoamil alkohol (CIAA) dengan perbandingan 24:1 sebanyak 1 kali volume ekstrak. Campuran larutan digoyang merata dengan cara dibolak-balikkan secara perlahan. Larutan disentrifugasi pada kecepatan 10 000 rpm (Jouan BR4i) pada suhu 4 ºC selama 20 menit. Supernatan diambil kemudian ditambahkan isopropanol dingin sebanyak 0.7 kali volume, serta dibolak balik secara perlahan. Ekstrak diinkubasikan di freezer selama 2 jam. Selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 10 000 rpm dengan suhu 4 ºC selama 20 menit. Supernatan yang diperoleh dibuang dan endapan dibilas dengan 500 l alkohol 70% (v/v). Pembilasan dilakukan dengan cara disentrifugasi pada kecepatan 10 000 rpm dengan suhu 4 ºC selama 5 menit. Alkohol 70% (v/v) dibuang dan endapan dikeringkan dengan vakum sampai kering. Pelet yang diperoleh disuspensikan dengan 50 l ddH2O. Ekstrak ditambah dengan 1 kali volume campuran larutan
PCI (fenol:kloroform:isoamilalkohol) dengan perbandingan 25:24:1, selanjutnya digerakkan bolak-balik. Campuran disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm pada suhu 20 ºC selama 20 menit. Supernatan diambil, kemudian ditambah dengan 0.1 kali volume sodium asetat 3 M pH 5.2 dan alkohol absolut sebanyak 2 kali volume. Ekstrak kemudian diinkubasi selama 2 jam pada suhu 4 ºC. Larutan disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 ºC. Supernatan dibuang, selanjutnya endapan yang diperoleh dibilas dengan 500 µl
alkohol 70% (v/v). Pembilasan dilakukan dengan cara disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm pada suhu 4 ºC selama 5 menit. Alkohol 70% (v/v) dibuang, kemudian pelet dikeringkan dengan vakum sampai kering. Endapan disuspensikan dengan 50 l ddH2O. Selanjutnya ditambahkan 0.1 kali RNAse (10
mg/ml), diinkubasi pada suhu 37 ºC selama semalam. Ekstrak yang diperoleh disimpan sebagai stok pada suhu -20 ºC.
Kemurnian DNA ditentukan oleh tingkat kontaminasi RNA dalam larutan. Jumlah RNA yang banyak akan mempengaruhi hasil absorbansi yang diamati pada panjang gelombang 260 nm dengan menggunakan spektrofotometer. Kemurnian DNA ditentukan berdasarkan tingkat kontaminasi protein dalam larutan dengan membandingkan nilai OD260 dengan OD280. Molekul DNA
dikatakan murni apabila rasio keduanya berada antara 1.8 sampai 2.0. Jika nilai rasio lebih kecil dari 1.8 maka di dalam larutan tersebut masih terkontaminasi protein atau fenol dalam larutan, dan nilai rasio yang lebih besar dari 2 menunjukkan adanya akumulasi RNA yang tercampur DNA. Hal ini mengharuskan dilakukan pemurnian kembali menggunakan RNAse. Kemurnian DNA yang tinggi akan menghasilkan cetakan yang baik pada proses PCR. Prinsip kerja spektrofotometer adalah iradiasi sinar ultraviolet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan. Penyerapan sinar tersebut oleh nukleotida secara maksimal dicapai pada panjang gelombang 260 nm, dan penyerapan maksimal oleh protein dicapai pada panjang gelombang 280 nm. Kepadatan optik (optical density) yang disebut OD260 sama dengan 1, maka konsentrasinya setara
dengan 50 g/ml DNA untai ganda atau 40 g/ml RNA dan DNA untai tunggal. Selanjutnya pengamatan keutuhan suatu genom/DNA juga dilakukan menggunakan elektroforesis. DNA hasil ekstraksi sebanyak 1 l ditambahkan 1 l
loading dye dengan komposisi bromofenol biru 0.25% (b/v), silen sianol 0.25% (b/v), sukrosa 40% (b/v) dimasukkan ke dalam sumur gel untuk penempatan DNA
ladder dan dialirkan pada gel agarosa 1% (b/v) di dalam bufer TAE 1 kali dengan komposisi TAE 50 kali adalah Tris-HCl 2 M pH 8.3, asam asetat 0.99 M, EDTA 50 mM. Elektroforesis dilakukan selama 20 menit pada tegangan 110 volt. Hasil elektroforesis diwarnai dengan etidium bromida 0.5 g/ml dan dibilas dengan
akuades (Sambrook et al. 1989). Hasil tersebut kemudian divisualisasikan dengan
UV transiluminator dan dipotret menggunakan kamera.
Analisis Polimorfisme DNA dengan AFLP. Analisis AFLP dilakukan
menurut Vost et al. (1995) yang dimodifikasi yaitu pelabelan primer dengan IRD 700. Tahapan teknik AFLP adalah sebagai berikut:
Restriksi DNA Genomik dan Ligasi Adaptor. Untuk 1 kali reaksi restriksi dan ligasi adaptor (Restriksi Ligasi/RL) dibutuhkan 2.5 l bufer RL 10 kali (Tris-HCl 50 mM pH 7.5, Mg-asetat 5 mM , K-asetat 250 mM), 5 l DNA (250-500 ng/ l), 0.125 l enzim restriksi Pst I (20 unit l) dan enzim restriksi Mse I (10 unit/ l), 0.5 l Pst I adaptor (5 pMol/ l), 0.5 l Mse I adaptor (50 pMol/ l), 0.5 l ATP 10 mM, 0.16 l T4 ligase (3 unit/ l) dan 15.465 l ddH2O sehingga total volume
campuran 25 l. Campuran diinkubasi selama semalam pada suhu 37 ºC. Susunan basa adaptor yang digunakan adalah sebagai berikut:
Adaptor Pst I : 5'CTCGTAGACTGCGTACA3' 3'CATCTGACGCATGTACCT5' Adaptor Mse I : 5'GACGATGAGTCCTGAG3'
3'TACTCAGGACTCAT5'
Amplifikasi Fragmen Hasil Restriksi. Reaksi amplifikasi terhadap hasil ligasi di atas dilakukan dengan alat PCR (Polymerase Chain Reaction) dalam dua tahap reaksi yaitu pre-amplifikasi dan amplifikasi selektif.
Pre-amplifikasi. Proses pre-amplifikasi membutuhkan 5 l hasil RL ditambah dengan 0.6 l primer Pst I (P00) 30 ng/ l dengan sekuen 5'GACTGCGTACATGCAG3', 0.6 l primer Mse I (M02) 30 ng/ l dengan sekuen 5'GATGAGTCCTGAGTAAC3', 0.4 l dNTP 10 mM, 2 l PCR bufer 10 kali, 0.08 l super Tag 5 unit/ l dan 11.32 l ddH2O, sehingga total volume
campuran menjadi 20 l. Semua campuran tersebut di PCR program pre- amplifikasi menggunakan alat PCR PTC-100TM MJ. PCR dilakukan sebanyak 24 siklus pada 94 ºC selama 30 detik (denaturasi), 56 ºC selama 60 detik (penempelan primer), 72 ºC selama 60 detik (ekstensi). Hasil dari proses ini
disebut dilute pre-amp atau template sekunder. Untuk mengetahui hasil proses pre-amplifikasi dilakukan elektroforesis. Penggunaan primer Pst I (P00) dan Mse I (M02) dilakukan setelah sebelumnya dicoba dengan menggunakan Pst I (P00) dan Mse I (M00), akan tetapi tidak berhasil. Dilute pre-amp sebanyak 5 l ditambah dengan 2 l loading dye kemudian dielektroforesis pada gel agarosa 1% (b/v), di dalam bufer TAE 1 kali selama 30 menit pada tegangan 110 volt. Hasil elektroforesis diwarnai dengan etidium bromida 0.5 g/ml dan dibilas dengan akuades. Pre-amplifikasi yang baik menghasilkan pita DNA smear (usapan) setelah diamati pada UV transiluminator.
Amplifikasi Selektif. Produk pre-amplifikasi diencerkan 10 kali untuk digunakan sebagai template dalam amplifikasi selektif. Pada amplifikasi selektif ini digunakan primer Pst I berlabel IRD 700. Penggunaan IRD 700 dilakukan dengan mencampur 10 l dilut pre-amp, 0.6 l primer Mse I (M49) yang tidak dilabel 50 ng/ l dengan sekuen 5'GATGAGTCCTGAAGTAACAG3' dan 1 l primer Pst I berlabel IRD 700 (P11) 1 pmol/ l dengan sekuen 5'GACTGCGTACATGCAGAA3'. Kemudian ditambah dengan 0.4 l dNTP 10 mM, 2 l super bufer 10 kali, 5.92 l ddH2O, 0.08 l Tag DNA polimerase
(5 unit/ l), sehingga volume campuran total 20 l. Campuran bahan-bahan tersebut diamplifikasi dengan program PCR LI-COR. PCR LI-COR dilakukan sebanyak 12 siklus pada 94 ºC selama 30 detik (denaturasi), 56 ºC selama 30 detik (penempelan primer) dengan penurunan suhu 0.7 ºC tiap siklus dan 72 ºC selama 60 detik (ekstensi), kemudian dilanjutkan 24 siklus pada 94 ºC selama 30 detik (denaturasi), 56 ºC selama 30 detik (penempelan primer) dan 72 ºC selama 60 detik (ekstensi).
Visualisasi Fragmen Hasil Amplifikasi. Elektroforesis hasil amplifikasi selektif, menggunakan LI-COR 4300 DNA Analyzer. Gel yang digunakan untuk elektroforesis dibuat dengan cara mencampur 20 ml KB plus 6.5% gel matrix, 15 l TEMED dan 150 l amonium persulfat (APS) 10% (b/v). Campuran tersebut dimasukkan pada plat kaca dan didiamkan selama lebih kurang 1 jam sampai beku. Plat kaca berisi gel dimasukkan ke wadah elektroforesis kemudian
pada bagian atas ditambah bufer TBE 1 kali dengan komposisi TBE 10 kali yaitu Tris-HCl 1 M pH 8.3, asam borak 0.83 M, EDTA 10 mM. Pre-elektroforesis dilakukan selama 20 menit dengan daya 20 watt untuk menaikkan suhu hingga 50 ºC.
Produk amplifikasi selektif sebanyak 10 l, ditambah dengan loading bufer formamid 2 kali [formamid 98% (b/v), EDTA 10 mM, bromofenol biru 0.025% (b/v), silen sianol 0.025% (b/v)] dengan volume yang sama (10 l) sehingga volume campuran menjadi 20 l. Pembuatan marker dilakukan dengan mencampur 1 l DNA ladder 100 pb, 19 l H2O, dan 20 l loading bufer
formamid 2 kali. Sampel dan marker dipanaskan pada suhu 90 ºC selama 3 menit kemudian dipindahkan ke dalam es selama kurang lebih 1 jam.
Permukaan plat kaca yang berisi gel dibersihkan dengan bufer TBE 1 kali menggunakan pipet 1 ml, selanjutnya sisir (comb) dipasang pada gel. Dari masing-masing sampel diambil 1 l kemudian dimasukkan kedalam sela-sela
comb. Selanjutnya dilakukan elektroforesis selama kurang lebih 3 jam dengan daya 40 watt dan tegangan 1500 volt, sehingga terdeteksi pita-pita hasil elektroforesis tersebut pada LI-COR 4300 DNA Analyzer.
Analisis Similaritas dan Analisis Komponen Utama
Data karakter bunga dan hasil amplifikasi DNA dengan metode AFLP dianalisis dengan program NTSYS-pc (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) versi 2.02 (Rohlf 1998) dan Minitab 14.
Analisis Similaritas. Pita-pita DNA yang terbentuk dari hasil amplifikasi dianggap sebagai satu karakter. Semua pita DNA dengan laju migrasi yang sama diasumsikan sebagai lokus yang homolog. Data pita DNA diterjemahkan ke dalam data biner dengan ketentuan nilai 0 (tidak ada pita) dan 1 (ada pita). Data kuantitatif karakter bunga dikelaskan terlebih dahulu kemudian diubah menjadi data biner. Data AFLP dari 10 aksesi jarak pagar dan kombinasi data karakter bunga dengan AFLP dari lima aksesi jarak pagar yang berbunga masing-masing diolah dengan NTSYS-pc versi 2.02 dengan proses Similarity for Qualitative Data (SIMQUAL) dan dihitung berdasarkan metode Simple Matching Coefficient
(SM) menurut Sokal dan Sneath (1963 dalam Rohlf 1998) dengan rumus sebagai berikut: SM = m/N
Keterangan: SM = koefisien similaritas
m = banyaknya data dengan pola yang sama N = jumlah data
Data AFLP dari 10 aksesi jarak pagar dan kombinasi data karakter bunga dengan AFLP dari lima aksesi jarak pagar yang berbunga masing-masing dianalisis menggunakan Sequential, Aglomerative, Hierarchical and Nested
(SAHN)-UPGMA (Unweighted Pair Group Method, Arithmetic) pada program NTSYS-pc versi 2.02. Hasil analisis disajikan dalam bentuk dendrogram.
Analisis Komponen Utama. Apabila jarak genetik antar genotipe cukup dekat (koefisien kemiripan genetik yang tinggi), analisis dilanjutkan dengan Analisis Komponen Utama (AKU) untuk mendapatkan nilai yang dapat digunakan untuk melihat posisi relatif setiap genotipe berdasarkan tiga komponen utama yang memiliki proporsi varians yang tertinggi. Analisis tiga komponen utama melalui prosedur analisis multivariate pada program Minitab 14. Hasil analisis disajikan dalam bentuk plot dua dimensi antara komponen utama 1 (KU 1) dengan komponen utama 2 ( KU 2) ataupun plot tiga dimensi antara KU 1, KU 2 dengan KU 3.