DAN DNA MENGGUNAKAN TEKNIK AMPLIFIED
FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (AFLP)
KURNIA PANCA DEWI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Identifikasi
Keragaman Genetik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) Berdasarkan
Karakter Bunga dan DNA Menggunakan Teknik Amplified Fragment Length
Polymorphism (AFLP) adalah karya saya bersama dengan komisi pembimbing dan belum pernah dipublikasikan kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, September 2008
Kurnia Panca Dewi
KURNIA PANCA DEWI. Genetic Diversity Identification of Physic nut
based on Floral Characters and DNA using AFLP Method. Under direction of
UTUT WIDYASTUTI and JULIARNI.
Physic nut could be an alternative material for biofuel. Information about genetic diversity of physic nut is still limited. The aim of this research was to observe genetic diversity of several accessions of physic nut based on floral characters and DNA using AFLP method. This research were carried out in two stages, the first stage was analysing floral characters such as male and female flower ratio, while the second stage was analysing DNA diversity using AFLP. Phenetic analysis based on floral characters and DNA were done by using NTSYS-pc 2.02 and Minitabs 14 programme.
The amplified products using AFLP provided 91 loci, 32 loci (35.16 %) were monomorphic and 59 loci (64.84 %) were polymorphic. The result of dendrogram cluster analysis based on DNA characters differentiated ten accessions into two groups with 0.66 coefficient similarity. The first group consisted of six accessions including Madiun, Bangka, Jember, Bengkulu, Kediri and Ponorogo, while the second group consisted of four accessions including Dompu, Lampung, Subang and Sukabumi. Accessions Dompu, Lampung, Subang and Sukabumi were in one group due to had loci number in 30, 43 and 50 respectively.
Dendrogram of cluster analysis based on floral characters and DNA differentiated five accessions into two groups with 0.65 coefficient similarity. The first group consisted of three accessions including Dompu, Lampung and Sukabumi, while the second group consisted of two accessions including Bengkulu and Bangka.
RINGKASAN
KURNIA PANCA DEWI. Identifikasi Keragaman Genetik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) Berdasarkan Karakter Bunga dan DNA Menggunakan Teknik Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP). Dibimbing oleh
UTUT WIDYASTUTI dan JULIARNI.
Keanekaragaman hayati di Indonesia sangat tinggi, yang merupakan keunggulan bagi pengembangan bahan bakar yang berasal dari tumbuhan. Salah satu kelompok tanaman non pangan yang direkomendasikan adalah tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.) karena bijinya menghasilkan minyak nabati yang dapat diolah menjadi bahan bakar minyak (biodiesel). Keragaman genetik dapat dipelajari menggunakan penanda morfologi dan molekular (protein dan DNA). Jarak pagar adalah tanaman monoecius, memiliki bunga betina dan jantan terpisah tetapi masih di dalam satu infloresen. Jarak pagar mempunyai jumlah bunga jantan yang lebih tinggi dibandingkan dengan jumlah bunga betina. Penanda DNA yang tergolong mutakhir adalah Amplified Fragment Length Polymorphism
(AFLP). Penanda AFLP dapat digunakan untuk mengenali hubungan kekerabatan yang sangat dekat antar genotip, perbedaan antar klon dalam satu kultivar, keragaman yang disebabkan terjadinya mutasi yang sangat sedikit atau adanya perbedaan genetik yang sangat kecil. Penelitian tentang variasi genetik jarak pagar melalui penggunaan marka molekular masih sangat terbatas. Oleh karena itu dalam upaya mendapatkan informasi genetik yang akurat untuk menunjang program pemuliaan tanaman jarak pagar, maka penggunaan penanda molekular DNA untuk analisis keragaman tanaman jarak pagar perlu dilakukan.
Bahan tanaman yang digunakan berupa 10 aksesi jarak pagar yaitu aksesi Madiun, Dompu, Bengkulu, Lampung, Bangka, Ponorogo, Kediri, Jember, Subang dan Sukabumi. Isolasi DNA menggunakan metode CTAB menurut Doyle dan Doyle yang dimodifikasi yaitu dengan penambahan PVP (Polyvinyl Pyrrolidon). Karakter bunga yang diamati yaitu rasio bunga jantan dan betina. Analisis AFLP menggunakan enzim restriksi Pst I dan Mse I. Tahap preamplifikasi menggunakan primer Pst I (P00) dan Mse I (M02), sedangkan untuk amplifikasi selektif menggunakan primer Pst I berlabel IRD 700 dan primer
Mse I yang tidak dilabel. Sembilan puluh satu karakter hasil AFLP pada 10 aksesi jarak pagar dan dua karakter bunga dengan 91 lokus hasil AFLP pada lima aksesi jarak pagar digunakan untuk menganalisis keragaman genetik. Analisis keragaman menggunakan program NTSYS-pc 2.02 dan Minitabs 14.
berdasarkan tidak adanya lokus ke 30, 43 dan 50. Hasil analisis berdasarkan karakter bunga dan 91 lokus hasil AFLP pada lima aksesi jarak pagar yang berbunga mempunyai nilai koefisien kemiripan berkisar 0.398-0.949. Dendrogram yang dihasilkan berdasarkan karakter bunga dan 91 lokus hasil AFLP pada koefisien kemiripan 0.65 mengelompokkan lima aksesi jarak pagar yang berbunga menjadi dua kelompok. Plot dua dimensi berdasarkan AKU juga mengelompokkan lima aksesi jarak pagar yang berbunga menjadi dua kelompok. Kelompok I terdiri dari aksesi Dompu, Lampung dan Sukabumi. Kelompok II terdiri dari aksesi Bengkulu dan Bangka. Kelompok II mengelompok berdasarkan adanya lokus ke 17, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 43, 48, 64, 65, 75, 77, 78, 79 dan 80. Terdapat keragaman genetik jarak pagar berdasarkan karakter bunga (rasio bunga jantan dan betina) dan 91 lokus hasil AFLP.
© Hak Cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2008
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber.
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulis kritik, atau tinjauan suatu masalah. b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.
DAN DNA MENGGUNAKAN TEKNIK AMPLIFIED
FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (AFLP)
KURNIA PANCA DEWI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada
Departemen Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Penelitian : Identifikasi Keragaman Genetik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) Berdasarkan Karakter Bunga dan DNA Menggunakan Teknik Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)
Nama : Kurnia Panca Dewi NRP : G351060121
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr.Ir. Utut Widyastuti, M.Si. Dr.Ir. Juliarni, M.Agr.
Ketua Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA Prof.Dr.Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga tesis ini berhasil diselesaikan. Penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Febuari 2007 sampai Mei 2008 ini berjudul Identifikasi Keragaman Genetik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) Berdasarkan Karakter Bunga dan DNA Menggunakan Teknik Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP). Penelitian dilaksanakan di rumah kaca, Laboratorium Biotechnology Research Indonesian-The Netherlands (BIORIN) Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, dan Laboratorium Anatomi dan Morfologi Tumbuhan Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor.
Penulis menyadari akanlah sulit untuk dapat menyelesaikan penelitian sampai penyusunan tesis ini tanpa bantuan moril dan semangat dari banyak pihak. Untuk itu penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya pada:
1. Dr.Ir. Utut Widyastuti, M.Si, Ketua Komisi Pembimbing yang selalu memberi bimbingan dalam penelitian dan semangat untuk berkarya dengan sebaik-baiknya serta dalam menyediakan bahan penelitian.
2. Dr.Ir. Juliarni, M.Agr, Anggota Komisi Pembimbing atas bimbingan dan saran yang telah diberikan selama penelitian hingga selesainya tesis ini. 3. Dr.Ir. Muhammad Jusuf, sebagai dosen penguji luar komisi atas saran dan
masukan yang diberikan.
4. Departemen Agama RI, atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti program S-2 di Institut Pertanian Bogor melalui Beasiswa Utusan Daerah.
5. Project HI-LINK DIKTI, PT.TIMAH Kabupaten Bangka Induk atas kepercayaan dan bantuan yang telah diberikan sehingga penelitian ini dapat terlaksana dengan baik.
6. Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), Laboratorium Anatomi dan Morfologi Tumbuhan Departemen Biologi dan Laboratorium Anatomi Hewan Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor atas kemudahan dalam penggunaan fasilitas laboratorium. 7. Unit Usaha Jasa dan Industri (unit Uji), Departemen Biologi, IPB atas Muzuni, Retno, Ucu serta rekan-rekan lain di laboratorium BIORIN PAU dan rekan-rekan BUD DEPAG angkatan 2006 yang tidak bisa penulis sebutkan satu persatu yang telah memberikan bantuan dan semangat. 11.Drs.Much.Machsun, M.Pdi, Kepala MAN 2 Wates Kulon Progo atas izin
dan dukungan dalam melanjutkan studi S2 di IPB. Akhirnya semoga tulisan ini bermanfaat.
Bogor, September 2008
DAN DNA MENGGUNAKAN TEKNIK AMPLIFIED
FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (AFLP)
KURNIA PANCA DEWI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Identifikasi
Keragaman Genetik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) Berdasarkan
Karakter Bunga dan DNA Menggunakan Teknik Amplified Fragment Length
Polymorphism (AFLP) adalah karya saya bersama dengan komisi pembimbing dan belum pernah dipublikasikan kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, September 2008
Kurnia Panca Dewi
KURNIA PANCA DEWI. Genetic Diversity Identification of Physic nut
based on Floral Characters and DNA using AFLP Method. Under direction of
UTUT WIDYASTUTI and JULIARNI.
Physic nut could be an alternative material for biofuel. Information about genetic diversity of physic nut is still limited. The aim of this research was to observe genetic diversity of several accessions of physic nut based on floral characters and DNA using AFLP method. This research were carried out in two stages, the first stage was analysing floral characters such as male and female flower ratio, while the second stage was analysing DNA diversity using AFLP. Phenetic analysis based on floral characters and DNA were done by using NTSYS-pc 2.02 and Minitabs 14 programme.
The amplified products using AFLP provided 91 loci, 32 loci (35.16 %) were monomorphic and 59 loci (64.84 %) were polymorphic. The result of dendrogram cluster analysis based on DNA characters differentiated ten accessions into two groups with 0.66 coefficient similarity. The first group consisted of six accessions including Madiun, Bangka, Jember, Bengkulu, Kediri and Ponorogo, while the second group consisted of four accessions including Dompu, Lampung, Subang and Sukabumi. Accessions Dompu, Lampung, Subang and Sukabumi were in one group due to had loci number in 30, 43 and 50 respectively.
Dendrogram of cluster analysis based on floral characters and DNA differentiated five accessions into two groups with 0.65 coefficient similarity. The first group consisted of three accessions including Dompu, Lampung and Sukabumi, while the second group consisted of two accessions including Bengkulu and Bangka.
RINGKASAN
KURNIA PANCA DEWI. Identifikasi Keragaman Genetik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) Berdasarkan Karakter Bunga dan DNA Menggunakan Teknik Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP). Dibimbing oleh
UTUT WIDYASTUTI dan JULIARNI.
Keanekaragaman hayati di Indonesia sangat tinggi, yang merupakan keunggulan bagi pengembangan bahan bakar yang berasal dari tumbuhan. Salah satu kelompok tanaman non pangan yang direkomendasikan adalah tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.) karena bijinya menghasilkan minyak nabati yang dapat diolah menjadi bahan bakar minyak (biodiesel). Keragaman genetik dapat dipelajari menggunakan penanda morfologi dan molekular (protein dan DNA). Jarak pagar adalah tanaman monoecius, memiliki bunga betina dan jantan terpisah tetapi masih di dalam satu infloresen. Jarak pagar mempunyai jumlah bunga jantan yang lebih tinggi dibandingkan dengan jumlah bunga betina. Penanda DNA yang tergolong mutakhir adalah Amplified Fragment Length Polymorphism
(AFLP). Penanda AFLP dapat digunakan untuk mengenali hubungan kekerabatan yang sangat dekat antar genotip, perbedaan antar klon dalam satu kultivar, keragaman yang disebabkan terjadinya mutasi yang sangat sedikit atau adanya perbedaan genetik yang sangat kecil. Penelitian tentang variasi genetik jarak pagar melalui penggunaan marka molekular masih sangat terbatas. Oleh karena itu dalam upaya mendapatkan informasi genetik yang akurat untuk menunjang program pemuliaan tanaman jarak pagar, maka penggunaan penanda molekular DNA untuk analisis keragaman tanaman jarak pagar perlu dilakukan.
Bahan tanaman yang digunakan berupa 10 aksesi jarak pagar yaitu aksesi Madiun, Dompu, Bengkulu, Lampung, Bangka, Ponorogo, Kediri, Jember, Subang dan Sukabumi. Isolasi DNA menggunakan metode CTAB menurut Doyle dan Doyle yang dimodifikasi yaitu dengan penambahan PVP (Polyvinyl Pyrrolidon). Karakter bunga yang diamati yaitu rasio bunga jantan dan betina. Analisis AFLP menggunakan enzim restriksi Pst I dan Mse I. Tahap preamplifikasi menggunakan primer Pst I (P00) dan Mse I (M02), sedangkan untuk amplifikasi selektif menggunakan primer Pst I berlabel IRD 700 dan primer
Mse I yang tidak dilabel. Sembilan puluh satu karakter hasil AFLP pada 10 aksesi jarak pagar dan dua karakter bunga dengan 91 lokus hasil AFLP pada lima aksesi jarak pagar digunakan untuk menganalisis keragaman genetik. Analisis keragaman menggunakan program NTSYS-pc 2.02 dan Minitabs 14.
berdasarkan tidak adanya lokus ke 30, 43 dan 50. Hasil analisis berdasarkan karakter bunga dan 91 lokus hasil AFLP pada lima aksesi jarak pagar yang berbunga mempunyai nilai koefisien kemiripan berkisar 0.398-0.949. Dendrogram yang dihasilkan berdasarkan karakter bunga dan 91 lokus hasil AFLP pada koefisien kemiripan 0.65 mengelompokkan lima aksesi jarak pagar yang berbunga menjadi dua kelompok. Plot dua dimensi berdasarkan AKU juga mengelompokkan lima aksesi jarak pagar yang berbunga menjadi dua kelompok. Kelompok I terdiri dari aksesi Dompu, Lampung dan Sukabumi. Kelompok II terdiri dari aksesi Bengkulu dan Bangka. Kelompok II mengelompok berdasarkan adanya lokus ke 17, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 43, 48, 64, 65, 75, 77, 78, 79 dan 80. Terdapat keragaman genetik jarak pagar berdasarkan karakter bunga (rasio bunga jantan dan betina) dan 91 lokus hasil AFLP.
© Hak Cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2008
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber.
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulis kritik, atau tinjauan suatu masalah. b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.
DAN DNA MENGGUNAKAN TEKNIK AMPLIFIED
FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (AFLP)
KURNIA PANCA DEWI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada
Departemen Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Penelitian : Identifikasi Keragaman Genetik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) Berdasarkan Karakter Bunga dan DNA Menggunakan Teknik Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)
Nama : Kurnia Panca Dewi NRP : G351060121
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr.Ir. Utut Widyastuti, M.Si. Dr.Ir. Juliarni, M.Agr.
Ketua Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA Prof.Dr.Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga tesis ini berhasil diselesaikan. Penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Febuari 2007 sampai Mei 2008 ini berjudul Identifikasi Keragaman Genetik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) Berdasarkan Karakter Bunga dan DNA Menggunakan Teknik Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP). Penelitian dilaksanakan di rumah kaca, Laboratorium Biotechnology Research Indonesian-The Netherlands (BIORIN) Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, dan Laboratorium Anatomi dan Morfologi Tumbuhan Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor.
Penulis menyadari akanlah sulit untuk dapat menyelesaikan penelitian sampai penyusunan tesis ini tanpa bantuan moril dan semangat dari banyak pihak. Untuk itu penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya pada:
1. Dr.Ir. Utut Widyastuti, M.Si, Ketua Komisi Pembimbing yang selalu memberi bimbingan dalam penelitian dan semangat untuk berkarya dengan sebaik-baiknya serta dalam menyediakan bahan penelitian.
2. Dr.Ir. Juliarni, M.Agr, Anggota Komisi Pembimbing atas bimbingan dan saran yang telah diberikan selama penelitian hingga selesainya tesis ini. 3. Dr.Ir. Muhammad Jusuf, sebagai dosen penguji luar komisi atas saran dan
masukan yang diberikan.
4. Departemen Agama RI, atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti program S-2 di Institut Pertanian Bogor melalui Beasiswa Utusan Daerah.
5. Project HI-LINK DIKTI, PT.TIMAH Kabupaten Bangka Induk atas kepercayaan dan bantuan yang telah diberikan sehingga penelitian ini dapat terlaksana dengan baik.
6. Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), Laboratorium Anatomi dan Morfologi Tumbuhan Departemen Biologi dan Laboratorium Anatomi Hewan Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor atas kemudahan dalam penggunaan fasilitas laboratorium. 7. Unit Usaha Jasa dan Industri (unit Uji), Departemen Biologi, IPB atas Muzuni, Retno, Ucu serta rekan-rekan lain di laboratorium BIORIN PAU dan rekan-rekan BUD DEPAG angkatan 2006 yang tidak bisa penulis sebutkan satu persatu yang telah memberikan bantuan dan semangat. 11.Drs.Much.Machsun, M.Pdi, Kepala MAN 2 Wates Kulon Progo atas izin
dan dukungan dalam melanjutkan studi S2 di IPB. Akhirnya semoga tulisan ini bermanfaat.
Bogor, September 2008
Penulis dilahirkan di Yogyakarta pada tanggal 23 April 1972 dari ayah Damanhuri dan ibu Zunariyah. Penulis merupakan anak kelima dari enam bersaudara.
Tahun 1990 penulis lulus dari SMUN 10 Yogyakarta dan pada tahun yang sama melanjutkan ke IKIP Negeri Yogyakarta, Fakultas Pendidikan MIPA. Penulis memilih jurusan Biologi.
Halaman 1 Rata - rata jumlah bunga jantan dan betina dari lima aksesi jarak
pagar 10 BST ... 18 2 Analisis komponen utama 10 aksesi jarak pagar menggunakan
penanda AFLP ... 24 3 Nilai mutlak komponen utama terbesar dari 91 lokus hasil AFLP
dengan sepasang primer pada 10 aksesi jarak pagar... 25 4 Analisis komponen utama lima aksesi jarak pagar berdasarkan
karakter bunga dan AFLP... 27 5 Nilai mutlak komponen utama terbesar berdasarkan karakter bunga
dan 91 lokus hasil AFLP dengan sepasang primer pada lima aksesi
DAFTAR GAMBAR
Halaman 1 Bunga jantan (a), bunga betina (b) jarak pagar, gambar penampang
membujur bunga jantan (c) dan penampang membujur bunga betina (d) 5 2 Skema teknik AFLP (Mueller & Wolfenbarger 1999)
Pemotongan DNA genom dengan enzim restriksi (1), ligasi adaptor (2), dan amplifikasi selektif (3)... 8 3 Bagan alir penelitian identifikasi keragaman genetik jarak pagar
(Jatropha curcas L.) berdasarkan karakter bunga dan DNA
menggunakan teknik AFLP ... 9 4 Sayatan melintang bunga lima aksesi jarak pagar ... 18 5 Hasil amplifikasi DNA genom jarak pagar dengan sepasang primer.
Aksesi Madiun (1), aksesi Dompu (2), aksesi Bengkulu (3), aksesi Lampung (4), aksesi Bangka (5), aksesi Ponorogo (6), aksesi Kediri (7), aksesi Jember (8), aksesi Subang (9), aksesi Sukabumi (10) ... 21 6 Dendrogram 10 aksesi jarak pagar berdasarkan penanda AFLP yang
dianalisis dengan SAHN-UPGMA pada program NTSYS-pc versi 2.02.. 23 7 Plot tiga dimensi 10 aksesi jarak pagar berdasarkan penanda AFLP ... 24 8 Dendrogram berdasarkan karakter bunga dan 91 lokus hasil AFLP
pada lima aksesi jarak pagar yang dianalisis dengan SAHN-UPGMA
pada program NTSYS-pc versi 2.02 ... 26 9 Plot dua dimensi komponen utama berdasarkan karakter bunga dan
91 lokus AFLP pada lima aksesi jarak pagar ekstraksi KU 1 dengan
Halaman 1 Deskripsi ciri morfologi 10 aksesi jarak pagar pada 9 BST... 33 2 Sembilan puluh satu lokus hasil AFLP ... 34 3 Nilai koefisien kemiripan genetik 10 aksesi jarak pagar berdasarkan
AFLP ... 35 4 Koefisien kemiripan genetik lima aksesi jarak pagar berdasarkan
karakter bunga dan 91 lokus hasil AFLP ... 35 5 Nilai heterozigositas 91 lokus hasil AFLP ... 36
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Indonesia merupakan negara yang memiliki keanekaragaman hayati tumbuhan yang tinggi (Campbell et al. 2006). Hal itu merupakan keunggulan bagi pengembangan bahan bakar yang berasal dari tumbuhan. Salah satu tanaman non pangan yang direkomendasikan adalah jarak pagar (Jatropha curcas L.). Biji jarak pagar menghasilkan minyak nabati yang dapat dijadikan sumber energi (Prihandana & Hendroko 2006).
Di Indonesia terdapat 4 spesies jarak yaitu jarak cina (Jatropha multifida), jarak bali (Jatropha podagrica), jarak ulung (Jatropha gossypifolia) dan jarak pagar (Jatropha curcas L.). Menurut Banerji et al. (1985) biji jarak pagar mempunyai kandungan minyak tertinggi (40-60%) daripada jarak ulung (28.5%) dan jarak cina (32.4%). Selain sebagai sumber energi alternatif, minyak jarak pagar dapat juga digunakan dalam industri farmasi (Becker et al. 2005).
Jarak pagar tumbuh di dataran rendah hingga ketinggian sekitar 500 m dpl. Tanaman ini dapat tumbuh pada daerah dengan curah hujan 300-2380 mm/tahun. Temperatur udara tahunan rata-rata yang dibutuhkan untuk pertumbuhan 20-28 ºC. Tanaman ini dapat tumbuh pada berbagai struktur tanah seperti tanah berbatu, tanah berpasir dan tanah liat. Menurut Alam (2005) pertumbuhan jarak pagar di tanah gembur lebih baik daripada di tanah padat. Selain pada tanah subur jarak pagar dapat tumbuh pada tanah yang ketersediaan air dan unsur-unsur haranya terbatas (lahan marginal). Di Indonesia banyak terdapat lahan marginal yang pemanfaatannya masih kurang optimal. Lahan marginal tersebut dapat digunakan untuk mengembangkan jarak pagar sehingga tidak mengganggu pengembangan tanaman pangan. Waktu yang paling baik untuk menanam jarak pagar adalah pada musim kering atau sebelum musim hujan. Jarak pagar membutuhkan air dan hara yang cukup untuk berproduksi secara optimal (Heller 1996; David et al. 2006).
dibanding dengan bunga betina adalah 29:1 (Raju & Ezradanam 2002). Berdasarkan hasil penelitian Bhattacharya et al. (2005) pada tiap infloresen terdapat bunga jantan yang jumlahnya berkisar antara 17-105 dan bunga betina yang jumlahnya berkisar 2-19. Pola penyerbukan pada jarak pagar dapat terjadi secara geitonogami (penyerbukan tetangga) maupun xenogami (penyerbukan silang)(Raju & Ezradanam 2002). Adanya penyerbukan silang dapat menyebabkan terjadinya keragaman genetik.
Pengetahuan tentang variasi genetik sangat penting bagi program pemuliaan karena memberikan dasar untuk pengembangan tanaman selanjutnya. Variasi genetik dapat digunakan sebagai bahan seleksi genotipe yang dikehendaki. Pengembangan bidang molekular dengan analisis DNA akhir-akhir ini sering digunakan untuk mengkarakterisasi variasi genetik dan kekerabatan dalam satu genus, spesies, kultivar atau aksesi. Informasi tentang keragaman genetik merupakan modal dasar bagi para ahli pemuliaan dan genetika populasi dalam pengembangan dan perbaikan tanaman, terutama sebagai langkah awal dalam seleksi tanaman. Langkah ini penting terutama untuk membedakan individu dalam spesies serta identifikasi genotipe secara tepat dan identifikasi gen-gen yang berpotensi pembawa karakter unggul.
Keragaman genetik dapat dipelajari menggunakan penanda ciri morfologi dan molekular yang meliputi penanda isozim dan penanda DNA. Penggunaan isozim relatif lebih cepat, mudah dan murah, tetapi hasil polimorfisme enzim yang diperoleh terbatas. Sedangkan penanda DNA dapat digunakan untuk menganalisis keragaman genetik lebih baik karena hasilnya konsisten dan tidak dipengaruhi oleh lingkungan (Melchinger 1990).
Saat ini terdapat beberapa metode yang dapat digunakan untuk mendeteksi keragaman genetik pada tingkat DNA. Metode Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) dan
digunakan dalam studi keragaman intraspesies, misalnya pada kedelai, teh, kakao dan kapas. Penanda AFLP dapat digunakan untuk mengenali hubungan kekerabatan yang sangat dekat antar genotipe, perbedaan antar klon dalam satu kultivar, keragaman yang disebabkan terjadinya mutasi yang sangat sedikit atau adanya perbedaan genetik yang sangat kecil (Cabrita et al. 2001). Informasi tentang variasi genetik sangat penting dalam program pemuliaan karena memberi informasi agar dapat digunakan untuk seleksi tanaman.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan mempelajari keragaman genetik aksesi jarak pagar yang berasal dari berbagai wilayah Jawa, Sumatera dan Nusa Tenggara berdasarkan karakter bunga dan DNA menggunakan teknik Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP).
Asal dan Distribusi
Jatropha curcas L. berasal dari Meksiko, Amerika Tengah, menyebar di Malaka dan Filipina setelah tahun 1700-an (Heller 1996). Tumbuhan ini masuk ke Indonesia selama periode penjajahan Jepang (1942-1945), penggunaan biji jarak pagar pada waktu itu sebagai bahan bakar minyak (BBM). Saat ini jarak pagar tumbuh menyebar di berbagai daerah di Indonesia. Beberapa nama lokal jarak pagar adalah jarak kosta, kalake pagar (Sunda), jarak pager (Jawa), kalekhe paghar (Madura), jarak pager (Bali), paku luba, jarak pageh (Nusa Tenggara), paku kase (Timor), kuman nema (Alor), lulunan (Roti), jarak wolanda, tondoutomene (Sulawesi), bintalo (Gorontalo), balacai (Manado), ai huwa kamalo, kadoto (Maluku), nawaih nawas (Nangroe Aceh Darussalam) dan peleng kaliki (Bugis) (Prihandana & Hendroko 2006). Selain itu, jarak pagar dikenal juga sebagai castor oil plant karena bijinya menghasilkan minyak (Makkar et al. 1997).
Karakter Bunga
oleh serangga penyerbuk (lebah dan semut) (Raju & Ezradanam 2002). Jarak pagar biasanya berbunga pada akhir musim kering atau selama musim hujan, tetapi dapat juga berbunga bergantung pada kondisi lingkungan.
(c) (d)
Gambar 1 Bunga jantan (a), bunga betina (b) jarak pagar, gambar penampang membujur bunga jantan (c) dan penampang membujur bunga betina (d).
Analisis Genetik dengan Penanda Molekular
Marka molekular telah banyak digunakan dalam penelitian berbagai disiplin ilmu (taksonomi, filogeni, ekologi, genetika dan pemuliaan). Marka molekular pada tingkat DNA mempunyai kelebihan dibandingkan dengan marka ciri morfologi. Keuntungan penggunaan marka molekular adalah genotipe suatu organisme dapat diuji secara langsung, jumlah polimorfisme yang ada tidak terbatas, dan pengembangan teknik dapat menghasilkan marka yang sesuai dengan tujuan penelitian (Weising et al. 1995). Penggunaan marka DNA dapat mencerminkan perubahan pada tingkat DNA, perbedaan jarak genetik antara individu lebih akurat daripada penggunaan marka ciri morfologi, karena fenotipe yang sama dapat dimunculkan oleh genotipe yang berbeda (Serret et al. 1997).
Penanda molekular mempunyai peranan yang sangat luas untuk memperbaiki efisiensi program pemuliaan tanaman. Marka molekular dalam pemuliaan digunakan dalam analisis pautan dan pemetaan genetik, identifikasi genotipe, estimasi keragaman genetik dan kekerabatan inter dan antar spesies atau
(a) (b)
varietas (Weising et al. 1996). Menurut Ribaut dan Hoisington (1998) keragaman genetik yang dihasilkan dari data sidikjari (fingerprinting) dapat digunakan dalam pengelompokan tumbuhan. Informasi yang diperoleh dapat digunakan untuk mengidentifikasi tetua yang paling sesuai untuk disilangkan. Pengukuran jarak genetik berdasarkan marka DNA diperlukan untuk memproduksi kultivar hibrida. Penanda molekular juga dapat digunakan untuk menentukan lokasi gen yang tepat pada kromosom. Kelebihan utama dari pemuliaan tanaman menggunakan penanda molekular dibandingkan seleksi konvensional adalah seleksi dapat dilakukan pada tanaman yang masih muda, tanpa menunggu pertumbuhan generatif (Sanjaya 2002).
Dasar penanda molekular adalah polimorfisme pada tingkat protein atau DNA. Polimorfisme yang terdeteksi oleh AFLP dan RFLP mengungkapkan variasi ukuran berdasarkan situs restriksi. Polimorfisme berdasarkan RAPD mencerminkan variasi sekuen DNA pada situs perlekatan primer (Powell et al. 1996). RFLP telah digunakan untuk mengevaluasi keragaman genetik pada tanaman, tetapi analisis dengan RFLP membutuhkan DNA dalam jumlah banyak dan kemurnian DNA yang tinggi, selain itu RFLP pada beberapa spesies tanaman kurang baik karena polimorfisme yang terdeteksi rendah (Powell et al. 1996). Teknik RFLP sangat menyita waktu dan relatif mahal, sehingga beberapa peneliti cenderung menggunakan RAPD dan AFLP untuk pemetaan genetik (Ben Chaim
et al. 2001).
Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)
Marka AFLP merupakan jenis marka yang didasarkan pada amplifikasi selektif potongan DNA hasil restriksi genomik total dengan enzim restriksi endonuklease (Vos et al. 1995). Sebenarnya marka ini mirip marka RAPD, tetapi primernya spesifik dan jumlah pitanya lebih banyak. Marka AFLP dikategorikan sebagai marka kodominan, walaupun pada kenyataannya seringkali diperlakukan sebagai marka dominan. Hal ini dikarenakan kesulitan membedakan intensitas pita dominan homozigot dengan heterozigot (Setiawan et al. 2000).
yang sama ketika dilakukan analisis dan dapat diamplifikasikan pada semua organisme termasuk tanaman, hasil amplifikasinya bersifat stabil, tingkat pengulangan dan variabilitasnya sangat tinggi, memiliki efisiensi yang sangat tinggi dalam pemetaan lokus karena sekali amplifikasi dapat meliputi beberapa lokus, dapat digunakan untuk menganalisis sidik jari semua DNA dengan mengabaikan kompleksitas dan asal usulnya, serta dapat bertindak sebagai jembatan antara peta genetik dan peta fisik pada kromosom. Keterbatasan teknik AFLP adalah cara aplikasinya relatif lebih rumit, sehingga memerlukan waktu lebih lama dan keterampilan khusus, serta alat dan bahan yang sangat mahal. Walaupun analisis AFLP relatif lebih mahal dibandingkan dengan analisis RAPD, namun lokus yang diperoleh dalam tiap reaksi lebih banyak (Powell et al. 1996).
AFLP merupakan suatu teknik analisis DNA berbasis PCR (Polymerase Chain Reaction). Sebelum amplifikasi PCR, DNA genom dipotong dengan dua enzim restriksi. Prosedur tersebut melibatkan beberapa tahap yang dimulai dengan memotong DNA genomik dengan sepasang enzim restriksi, satu enzim memotong jarang/rare cutter (karena mempunyai situs pengenalan 6 pasang basa/pb) dan satu enzim memotong sering/frequent cutter (mempunyai situs pengenalan 4 pb). Selanjutnya adaptor oligonukleotida diligasikan untuk menghasilkan potongan fragmen sebagai DNA cetakan dalam PCR (Van Eck et al. 1995). Sekuen adaptor dan situs restriksi di dekatnya bertindak sebagai tempat perlekatan primer untuk reaksi amplifikasi terhadap fragmen tersebut. Nukleotida selektif terletak pada ujung 3' primer PCR, sehingga hanya dapat mengawali sintesis DNA dari satu bagian situs restriksi tersebut (Gambar 2). Hanya fragmen restriksi yang nukleotidanya mengapit situs restriksi yang cocok dengan nukleotida selektif yang akan diamplifikasi (Vos etal. 1995).
Reaksi amplifikasi pada AFLP umumnya menggunakan dua primer. Desain primer yang baik merupakan faktor yang sangat menentukan dalam amplifikasi PCR. AFLP fingerprinting untuk genom yang kompleks pada umumnya melibatkan reaksi amplifikasi sebanyak dua tahap yaitu reaksi preamplifikasi dan reaksi amplifikasi. Preamplifikasi dilakukan dengan dua primer AFLP yang memiliki satu nukleotida selektif, kemudian hasil reaksi diencerkan dan digunakan sebagai cetakan untuk reaksi amplifikasi berikutnya (Vos et al. 1995).
Polimorfisme terdeteksi berupa ada atau tidaknya fragmen sehingga merupakan marka dominan. Metode AFLP menghasilkan sejumlah besar fragmen DNA, tanpa memerlukan pengetahuan tentang sekuen nukleotida. Setiap pasangan primer selektif dapat memvisualisasikan sekitar 50-100 fragmen DNA hasil restriksi pada sekuensing gel. Oleh karena setiap fragmen dianggap mewakili satu karakter tertentu, maka sejumlah besar karakter dapat divisualisasikan untuk setiap pasangan primer (Haris 2006).
Keberhasilan teknik AFLP juga dipengaruhi oleh keberhasilan teknik PCR. Teknik PCR didasarkan pada prinsip amplifikasi sekuen DNA secara enzimatis (in vitro). Amplifikasi sekuen DNA genom pada mesin PCR melibatkan pengaturan suhu yang terjadi secara berulang. Reaksi terdiri dari denaturasi DNA menjadi utas tunggal (suhu 94 ºC), penempelan primer (annealing) pada sekuen DNA genom (suhu 56 ºC), dan pemanjangan primer (elongation) pada suhu 72 ºC. Pengulangan siklus 25-50 kali akan meningkatkan jumlah fragmen DNA yang diamplifikasi secara eksponensial (Weising et al.1995).
Gambar 2 Skema teknik AFLP (Mueller & Wolfenbarger 1999)
BAHAN DAN METODE
Metode
Identifikasi keragaman genetik jarak pagar dilakukan menggunakan karakter bunga dan DNA dengan teknik AFLP. Penelitian dilakukan mengikuti bagan alir yang tertera pada Gambar 3.
Gambar 3 Bagan alir penelitian identifikasi keragaman genetik jarak pagar (Jatropha curcas L.) berdasarkan karakter bunga dan DNA
menggunakan teknik AFLP.
Penyiapan bahan tanaman
Identifikasi keragaman genetik
Karakter bunga :
Jumlah bunga jantan Jumlah bunga betina
Daun dari tanaman berumur 2 bulan diambil untuk analisis DNA dengan teknik AFLP
Teknik AFLP: Isolasi DNA Restriksi DNA dan ligasi adaptor Amplifikasi fragmen hasil restriksi
Analisis data karakter bunga dan AFLP :
Analisis similaritas
Analisis Komponen Utama
Penyiapan Bahan Tanaman
Bahan tanaman berupa 10 aksesi jarak pagar yang meliputi aksesi Madiun, Dompu, Bengkulu, Lampung, Bangka, Ponorogo, Kediri, Jember, Subang dan Sukabumi (Lampiran 1). Biji jarak pagar dikecambahkan dengan cara meletakkan biji pada bak plastik yang telah dilapisi dengan kertas tissu basah. Selanjutnya biji ditutup kembali dengan kertas tissu basah dan dibiarkan pada suhu ruang selama dua minggu. Setelah dua minggu kecambah dipindahkan ke polibag ukuran 5x15 cm (0.5 kg) yang berisi tanah latosol dan pupuk kandang dengan perbandingan 1:1, kemudian tanaman diletakkan di rumah kaca. Setelah satu bulan tanaman dipindahkan ke polibag berukuran 25x50 cm (10 kg) yang berisi tanah dan pupuk kandang dengan perbandingan 1:1.
Pengamatan Karakter Bunga
Pengamatan karakter bunga dimulai pada saat tanaman mulai berbunga yaitu 4 bulan setelah tanam (BST). Karakter bunga yang diamati adalah rasio bunga jantan dan betina. Penghitungan rasio bunga jantan dan betina berdasarkan pada jumlah infloresen yang muncul selama bulan Mei sampai Oktober 2007.
Pembuatan Sayatan Melintang Bunga
Sampel diwarnai dengan safranin 2% (b/v) di dalam air dan fastgreen 0.5% (b/v) di dalam alkohol 95% (v/v).
Analisis AFLP
Isolasi DNA. Isolasi DNA dilakukan menggunakan metode CTAB (Cetil Trimetil Amonium Bromida) menurut Doyle dan Doyle (1987) yang dimodifikasi yaitu dengan penambahan PVP (Polyvinyl Pyrrolidon). Sebanyak 0.5 g daun jarak pagar ditambahkan nitrogen cair kemudian digerus dalam lumpang porselin sampai menjadi serbuk. Selanjutnya serbuk daun dimasukkan ke dalam tabung ependorf yang berisi 600 µl campuran bufer ekstrak [CTAB 2% (b/v), EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetic) 0.02 M, Tris-HCl 1 M pH 8, NaCl 1.4 M dan PVP 1% (b/v)] serta 2 l β-merkaptoetanol. Ekstrak diinkubasi pada suhu 65 ºC selama 1 jam. Pemurnian dilakukan di dalam campuran larutan kloroform dan isoamil alkohol (CIAA) dengan perbandingan 24:1 sebanyak 1 kali volume ekstrak. Campuran larutan digoyang merata dengan cara dibolak-balikkan secara perlahan. Larutan disentrifugasi pada kecepatan 10 000 rpm (Jouan BR4i) pada suhu 4 ºC selama 20 menit. Supernatan diambil kemudian ditambahkan isopropanol dingin sebanyak 0.7 kali volume, serta dibolak balik secara perlahan. Ekstrak diinkubasikan di freezer selama 2 jam. Selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 10 000 rpm dengan suhu 4 ºC selama 20 menit. Supernatan yang diperoleh dibuang dan endapan dibilas dengan 500 l alkohol 70% (v/v). Pembilasan dilakukan dengan cara disentrifugasi pada kecepatan 10 000 rpm dengan suhu 4 ºC selama 5 menit. Alkohol 70% (v/v) dibuang dan endapan dikeringkan dengan vakum sampai kering. Pelet yang diperoleh disuspensikan dengan 50 l ddH2O. Ekstrak ditambah dengan 1 kali volume campuran larutan
PCI (fenol:kloroform:isoamilalkohol) dengan perbandingan 25:24:1, selanjutnya digerakkan bolak-balik. Campuran disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm pada suhu 20 ºC selama 20 menit. Supernatan diambil, kemudian ditambah dengan 0.1 kali volume sodium asetat 3 M pH 5.2 dan alkohol absolut sebanyak 2 kali volume. Ekstrak kemudian diinkubasi selama 2 jam pada suhu 4 ºC. Larutan disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 ºC. Supernatan dibuang, selanjutnya endapan yang diperoleh dibilas dengan 500 µl
alkohol 70% (v/v). Pembilasan dilakukan dengan cara disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm pada suhu 4 ºC selama 5 menit. Alkohol 70% (v/v) dibuang, kemudian pelet dikeringkan dengan vakum sampai kering. Endapan disuspensikan dengan 50 l ddH2O. Selanjutnya ditambahkan 0.1 kali RNAse (10
mg/ml), diinkubasi pada suhu 37 ºC selama semalam. Ekstrak yang diperoleh disimpan sebagai stok pada suhu -20 ºC.
Kemurnian DNA ditentukan oleh tingkat kontaminasi RNA dalam larutan. Jumlah RNA yang banyak akan mempengaruhi hasil absorbansi yang diamati pada panjang gelombang 260 nm dengan menggunakan spektrofotometer. Kemurnian DNA ditentukan berdasarkan tingkat kontaminasi protein dalam larutan dengan membandingkan nilai OD260 dengan OD280. Molekul DNA
dikatakan murni apabila rasio keduanya berada antara 1.8 sampai 2.0. Jika nilai rasio lebih kecil dari 1.8 maka di dalam larutan tersebut masih terkontaminasi protein atau fenol dalam larutan, dan nilai rasio yang lebih besar dari 2 menunjukkan adanya akumulasi RNA yang tercampur DNA. Hal ini mengharuskan dilakukan pemurnian kembali menggunakan RNAse. Kemurnian DNA yang tinggi akan menghasilkan cetakan yang baik pada proses PCR. Prinsip kerja spektrofotometer adalah iradiasi sinar ultraviolet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan. Penyerapan sinar tersebut oleh nukleotida secara maksimal dicapai pada panjang gelombang 260 nm, dan penyerapan maksimal oleh protein dicapai pada panjang gelombang 280 nm. Kepadatan optik (optical density) yang disebut OD260 sama dengan 1, maka konsentrasinya setara
dengan 50 g/ml DNA untai ganda atau 40 g/ml RNA dan DNA untai tunggal. Selanjutnya pengamatan keutuhan suatu genom/DNA juga dilakukan menggunakan elektroforesis. DNA hasil ekstraksi sebanyak 1 l ditambahkan 1 l
loading dye dengan komposisi bromofenol biru 0.25% (b/v), silen sianol 0.25% (b/v), sukrosa 40% (b/v) dimasukkan ke dalam sumur gel untuk penempatan DNA
akuades (Sambrook et al. 1989). Hasil tersebut kemudian divisualisasikan dengan
UV transiluminator dan dipotret menggunakan kamera.
Analisis Polimorfisme DNA dengan AFLP. Analisis AFLP dilakukan
menurut Vost et al. (1995) yang dimodifikasi yaitu pelabelan primer dengan IRD 700. Tahapan teknik AFLP adalah sebagai berikut:
Restriksi DNA Genomik dan Ligasi Adaptor. Untuk 1 kali reaksi restriksi dan ligasi adaptor (Restriksi Ligasi/RL) dibutuhkan 2.5 l bufer RL 10 kali (Tris-HCl 50 mM pH 7.5, Mg-asetat 5 mM , K-asetat 250 mM), 5 l DNA (250-500 ng/ l), 0.125 l enzim restriksi Pst I (20 unit l) dan enzim restriksi Mse I (10 unit/ l), 0.5 l Pst I adaptor (5 pMol/ l), 0.5 l Mse I adaptor (50 pMol/ l), 0.5 l ATP 10 mM, 0.16 l T4 ligase (3 unit/ l) dan 15.465 l ddH2O sehingga total volume
campuran 25 l. Campuran diinkubasi selama semalam pada suhu 37 ºC. Susunan basa adaptor yang digunakan adalah sebagai berikut:
Adaptor Pst I : 5'CTCGTAGACTGCGTACA3' 3'CATCTGACGCATGTACCT5' Adaptor Mse I : 5'GACGATGAGTCCTGAG3'
3'TACTCAGGACTCAT5'
Amplifikasi Fragmen Hasil Restriksi. Reaksi amplifikasi terhadap hasil ligasi di atas dilakukan dengan alat PCR (Polymerase Chain Reaction) dalam dua tahap reaksi yaitu pre-amplifikasi dan amplifikasi selektif.
Pre-amplifikasi. Proses pre-amplifikasi membutuhkan 5 l hasil RL ditambah dengan 0.6 l primer Pst I (P00) 30 ng/ l dengan sekuen 5'GACTGCGTACATGCAG3', 0.6 l primer Mse I (M02) 30 ng/ l dengan sekuen 5'GATGAGTCCTGAGTAAC3', 0.4 l dNTP 10 mM, 2 l PCR bufer 10 kali, 0.08 l super Tag 5 unit/ l dan 11.32 l ddH2O, sehingga total volume
campuran menjadi 20 l. Semua campuran tersebut di PCR program pre-amplifikasi menggunakan alat PCR PTC-100TM MJ. PCR dilakukan sebanyak 24 siklus pada 94 ºC selama 30 detik (denaturasi), 56 ºC selama 60 detik (penempelan primer), 72 ºC selama 60 detik (ekstensi). Hasil dari proses ini
disebut dilute pre-amp atau template sekunder. Untuk mengetahui hasil proses pre-amplifikasi dilakukan elektroforesis. Penggunaan primer Pst I (P00) dan Mse I (M02) dilakukan setelah sebelumnya dicoba dengan menggunakan Pst I (P00) dan Mse I (M00), akan tetapi tidak berhasil. Dilute pre-amp sebanyak 5 l ditambah dengan 2 l loading dye kemudian dielektroforesis pada gel agarosa 1% (b/v), di dalam bufer TAE 1 kali selama 30 menit pada tegangan 110 volt. Hasil elektroforesis diwarnai dengan etidium bromida 0.5 g/ml dan dibilas dengan akuades. Pre-amplifikasi yang baik menghasilkan pita DNA smear (usapan) setelah diamati pada UV transiluminator.
Amplifikasi Selektif. Produk pre-amplifikasi diencerkan 10 kali untuk digunakan sebagai template dalam amplifikasi selektif. Pada amplifikasi selektif ini digunakan primer Pst I berlabel IRD 700. Penggunaan IRD 700 dilakukan dengan mencampur 10 l dilut pre-amp, 0.6 l primer Mse I (M49) yang tidak dilabel 50 ng/ l dengan sekuen 5'GATGAGTCCTGAAGTAACAG3' dan 1 l primer Pst I berlabel IRD 700 (P11) 1 pmol/ l dengan sekuen 5'GACTGCGTACATGCAGAA3'. Kemudian ditambah dengan 0.4 l dNTP 10 mM, 2 l super bufer 10 kali, 5.92 l ddH2O, 0.08 l Tag DNA polimerase
(5 unit/ l), sehingga volume campuran total 20 l. Campuran bahan-bahan tersebut diamplifikasi dengan program PCR LI-COR. PCR LI-COR dilakukan sebanyak 12 siklus pada 94 ºC selama 30 detik (denaturasi), 56 ºC selama 30 detik (penempelan primer) dengan penurunan suhu 0.7 ºC tiap siklus dan 72 ºC selama 60 detik (ekstensi), kemudian dilanjutkan 24 siklus pada 94 ºC selama 30 detik (denaturasi), 56 ºC selama 30 detik (penempelan primer) dan 72 ºC selama 60 detik (ekstensi).
pada bagian atas ditambah bufer TBE 1 kali dengan komposisi TBE 10 kali yaitu volume campuran menjadi 20 l. Pembuatan marker dilakukan dengan mencampur 1 l DNA ladder 100 pb, 19 l H2O, dan 20 l loading bufer
formamid 2 kali. Sampel dan marker dipanaskan pada suhu 90 ºC selama 3 menit kemudian dipindahkan ke dalam es selama kurang lebih 1 jam.
Permukaan plat kaca yang berisi gel dibersihkan dengan bufer TBE 1 kali menggunakan pipet 1 ml, selanjutnya sisir (comb) dipasang pada gel. Dari masing-masing sampel diambil 1 l kemudian dimasukkan kedalam sela-sela
comb. Selanjutnya dilakukan elektroforesis selama kurang lebih 3 jam dengan daya 40 watt dan tegangan 1500 volt, sehingga terdeteksi pita-pita hasil elektroforesis tersebut pada LI-COR 4300 DNA Analyzer.
Analisis Similaritas dan Analisis Komponen Utama
Data karakter bunga dan hasil amplifikasi DNA dengan metode AFLP dianalisis dengan program NTSYS-pc (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) versi 2.02 (Rohlf 1998) dan Minitab 14.
Analisis Similaritas. Pita-pita DNA yang terbentuk dari hasil amplifikasi dianggap sebagai satu karakter. Semua pita DNA dengan laju migrasi yang sama diasumsikan sebagai lokus yang homolog. Data pita DNA diterjemahkan ke dalam data biner dengan ketentuan nilai 0 (tidak ada pita) dan 1 (ada pita). Data kuantitatif karakter bunga dikelaskan terlebih dahulu kemudian diubah menjadi data biner. Data AFLP dari 10 aksesi jarak pagar dan kombinasi data karakter bunga dengan AFLP dari lima aksesi jarak pagar yang berbunga masing-masing diolah dengan NTSYS-pc versi 2.02 dengan proses Similarity for Qualitative Data (SIMQUAL) dan dihitung berdasarkan metode Simple Matching Coefficient
(SM) menurut Sokal dan Sneath (1963 dalam Rohlf 1998) dengan rumus sebagai berikut: SM = m/N
Keterangan: SM = koefisien similaritas
m = banyaknya data dengan pola yang sama N = jumlah data
Data AFLP dari 10 aksesi jarak pagar dan kombinasi data karakter bunga dengan AFLP dari lima aksesi jarak pagar yang berbunga masing-masing dianalisis menggunakan Sequential, Aglomerative, Hierarchical and Nested
(SAHN)-UPGMA (Unweighted Pair Group Method, Arithmetic) pada program NTSYS-pc versi 2.02. Hasil analisis disajikan dalam bentuk dendrogram.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakter Bunga
Satu tahun setelah tanam dari 10 aksesi baru lima aksesi yang berbunga yaitu aksesi Dompu, Bengkulu, Lampung, Bangka dan Sukabumi. Lima aksesi lain yang belum berbunga yaitu aksesi Madiun, Ponorogo, Kediri, Jember dan Subang. Usia tanaman berbeda-beda pada saat mulai berbunga : aksesi Sukabumi mulai berbunga pada usia 4 BST, aksesi Bengkulu 5 BST, aksesi Lampung 6 BST, aksesi Bangka 5 BST dan aksesi Dompu 7 BST. Berdasarkan laporan Kebun Induk Jarak Pagar (KIJP) Pakuwon, Sukabumi, Jawa Barat, Muktiharjo, Pati, Jawa Tengah dan Asembagus, Situbondo, Jawa Timur, jarak pagar yang ditanam di ketiga daerah tersebut mulai berbunga 4 BST. Daerah dengan curah hujan terlalu tinggi seperti Bogor menyebabkan jarak pagar memiliki pertumbuhan vegetatif lebat dengan pembentukan bunga dan buah sedikit (Mulyani et al. 2006). Faktor lingkungan ini diduga menjadi penyebab usia berbunga jarak pagar yang ditanam dalam penelitian ini lebih lambat dibandingkan dengan jarak pagar yang ditanam di KIJP Pakuwon, Asembagus dan Muktiharjo.
Tabel 1 Rata-rata jumlah bunga jantan dan betina dari lima aksesi jarak pagar 10 BST
No Aksesi Rata-rata jumlah bunga jantan Rata-rata jumlah bunga betina
1 Dompu 4.333 0.333
2 Bengkulu 39.536 2.214
3 Lampung 12.406 1.531
4 Bangka 25.667 1.273
5 Sukabumi 22.471 0.941
Ukuran bunga jantan lebih kecil dibandingkan dengan bunga betina. Bunga betina mempunyai bakal buah yang terdiri atas tiga karpel, masing-masing karpel memiliki satu bakal biji. Berdasarkan hasil eksplorasi pendahuluan oleh Pusat Penelitian dan Pengembangan Perkebunan (Puslitbangbun) terhadap aksesi yang berasal dari Sumatera Barat, Lampung, Banten, Jawa Barat, Jawa Tengah, Jawa Timur, Nusa Tenggara Barat (NTB), Nusa Tenggara Timur (NTT), dan Sulawesi Selatan di Kebun Induk Jarak Pagar (KIJP) Pakuwon, Sukabumi, Jawa Barat terdapat variasi jumlah biji per buah kapsul yaitu 1-4 (Hasnam & Hartati 2006). Berdasarkan sayatan melintang bunga diketahui lima aksesi jarak pagar yang berbunga memiliki 3 bakal biji (Gambar 4).
Aksesi Dompu Aksesi Bengkulu Aksesi Sukabumi
Aksesi Bangka Aksesi Lampung Gambar 4 Sayatan melintang bunga lima aksesi jarak pagar.
Aksesi Dompu, Bangka dan Bengkulu memiliki bunga yang termasuk kategori protandri karena bunga jantan mekar terlebih dahulu daripada bunga betina. Sedangkan aksesi Lampung dan Sukabumi, bunganya termasuk kategori protogini (bunga betina mekar terlebih dahulu daripada bunga jantan). Menurut Raju dan Ezradanam (2002) tanaman jarak memiliki bunga yang bersifat protandri. Berdasarkan hasil pengamatan di lapangan, baik pada tipe protandri maupun protogini, ditemukan bunga jantan yang mekar bersamaan dengan bunga betina. Bunga betina mekar selama 2 sampai 5 hari, hal ini mendorong terbukanya peluang penyerbukan tetangga (geitonogami) yang dibantu oleh polinator.
Induksi pembungaan pada dasarnya merupakan interaksi antara faktor internal (genetik, hormon) dan faktor lingkungan/eksternal. Faktor eksternal yang berpengaruh pada pembungaan antara lain suhu, cahaya, kelembaban, dan unsur hara. Intensitas cahaya berhubungan dengan fotosintesis yang merupakan sumber energi bagi proses pembungaan (Kimball 1999). Keberadaan unsur hara dalam tanah juga berhubungan dengan proses pembentukan dan perkembangan bunga (Salisbury & Ross 1995)
Analisis Penanda AFLP
Isolasi DNA dilakukan berdasarkan metode CTAB menurut Doyle dan Doyle (1987) yang dimodifikasi yaitu dengan penambahan PVP yang berfungsi untuk mencegah reaksi oksidasi yang dapat menyebabkan pencoklatan jaringan. Bufer CTAB digunakan untuk memisahkan polisakarida yang terdapat bersama asam nukleat, karena adanya polisakarida dapat menghambat proses enzimatis. Penggunaan bufer CTAB akan menghasilkan DNA dengan kemurnian yang lebih baik (Doyle & Doyle 1987). Hasil isolasi genom dari sepuluh aksesi jarak pagar dielektroforesis pada gel agarosa 1% (b/v). Berdasarkan hasil elektroforesis pita DNA terlihat utuh. Kemurnian DNA yang digunakan untuk amplifikasi merupakan faktor yang harus diperhatikan karena akan berpengaruh terhadap amplifikasi. DNA dengan kualitas dan kuantitas yang baik diperlukan dalam pelaksanaan metode AFLP (Vos et al. 1995). Hal ini disebabkan sebelum proses amplifikasi dilaksanakan terdapat beberapa tahapan yang cukup kritis seperti pemotongan DNA genom dengan dua macam enzim restriksi serta pemasangan
adaptor pada ujung-ujung fragmen yang telah terpotong yang dilaksanakan melalui proses ligasi. DNA kualitas tinggi diperlukan untuk mencegah terjadinya pemotongan DNA genom secara tidak sempurna karena hilangnya situs-situs yang dikenali oleh enzim restriksi, sehingga dapat menyebabkan kesalahan dalam amplifikasi (Vos et al. 1995)
Tahap restriksi dan ligasi pada analisis AFLP menggunakan enzim restriksi
Pst I dan Mse I. Sebelum digunakan enzim restriksi Pst I dan Mse I telah dicoba digunakan enzim restriksi Eco R I dan Mse I akan tetapi DNA genom tidak terpotong dengan baik. Hal ini dapat disebabkan DNA genom terdapat pada situs yang tidak dikenali oleh enzim restriksi sehingga genom tidak terpotong dengan sempurna. Teknik AFLP membutuhkan beberapa tahapan antara lain restriksi dan ligasi adaptor. Penggunaan adaptor yang diligasikan pada ujung fragmen restriksi dalam teknik AFLP adalah untuk membuat situs perlekatan primer dalam reaksi amplifikasi fragmen. Sejumlah fragmen restriksi diamplifikasi secara spesifik menggunakan nukleotida selektif pada ujung 3' primer AFLP (Vos et al. 1995), karena dengan penambahan nukleotida selektif akan menyebabkan amplifikasi fragmen DNA cetakan menjadi lebih spesifik.
Marker 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Analisis similaritas dan AKU dalam penelitian ini dibatasi pada ukuran 50-255 pb dan 300-460 pb, pita dengan ukuran di bawah 50 pb kurang jelas terlihat amplifikasinya, sedangkan di atas 460 pb pita terlihat samar-samar dan hanya terdapat beberapa saja. Jumlah pita antara 50-255 pb adalah 582 dan jumlah pita antara 300-460 pb adalah 70, sehingga total pita yang dianalisis adalah 652 (Gambar 5). Analisis AFLP dengan sepasang primer terhadap 10 aksesi jarak pagar dapat mendeteksi 91 lokus (Lampiran 2) yang terdiri atas 32 lokus (35.16%) bersifat monomorfisme dan 59 lokus (64.84%) bersifat polimorfisme. Nilai heterozigositas berdasarkan polimorfisme pada 91 lokus tersebut diperoleh sebesar 0.1132 (Lampiran 5). Apabila lokus yang monomorf tidak diperhitungkan maka nilai heterozigositas yang diperoleh sebesar 0.1675. Nilai heterozigositas yang kecil ini menunjukkan kemiripan yang besar antar aksesi.
Analisis kemiripan
Hasil matriks koefisien kemiripan penanda AFLP antara 10 aksesi jarak pagar berdasarkan 91 lokus yang teramplifikasi rentang nilainya berkisar 0.396-0.989 (Lampiran 3). Nilai koefisien terendah ditemukan antara aksesi Lampung dan Bengkulu, sedangkan nilai koefisien tertinggi ditemukan antara aksesi Jember dan Bengkulu. Hal ini berarti bahwa jarak genetik antara aksesi Lampung dan Bengkulu jauh, karena antara aksesi Lampung dan Bengkulu hanya mempunyai kemiripan 39.6%. Aksesi Jember dan Bengkulu mempunyai jarak genetik yang dekat, karena mempunyai kemiripan 98.9%.
Analisis Gerombol (Cluster)
Analisis gerombol berdasarkan data AFLP membentuk dendrogram dengan koefisien kemiripan berkisar 0.59-0.99 atau terdapat keragaman 1-41%
DENDROGRAM AFLP
Koefisien kemiripan
0.59 0.62 0.64 0.66 0.69 0.71 0.73 0.76 0.78 0.80 0.83 0.85 0.87 0.90 0.92 0.94 0.97 0.99
dianalisis dengan SAHN-UPGMA pada program NTSYS-pc versi 2.02.
Pembagian menjadi dua kelompok ini berdasarkan ada tidaknya lokus ke 30, 43 dan 50. Kelompok I yaitu aksesi Madiun, Bengkulu, Jember, Bangka, Kediri, dan Ponorogo mempunyai lokus ke 30, 43 dan 50. Kelompok II yaitu aksesi Dompu, Lampung, Subang dan Sukabumi tidak mempunyai lokus-lokus tersebut.
Analisis Komponen Utama
AKU bertujuan untuk menyederhanakan variabel sehingga variabel baru menjadi lebih sedikit, namun informasi yang diperoleh relatif tidak berubah. Hasil AKU berdasarkan AFLP dapat ditampilkan dalam bentuk plot tiga dimensi. AKU berdasarkan penanda AFLP menunjukkan bahwa karakter yang diamati nilai keragaman minimum 70% diperoleh pada karakter ketiga (Tabel 2). Berdasarkan analisis ini terdapat 88 karakter yang diasumsikan tidak berpengaruh terhadap keragaman 10 aksesi. Berdasarkan hasil AKU dibuat plot tiga dimensi berdasarkan ekstraksi Komponen Utama (KU) 1, KU 2 dengan KU 3 (Gambar 7).
I
II
Tabel 2 Analisis komponen utama 10 aksesi jarak pagar menggunakan penanda AFLP
Karakter Nilai ciri Persentase keragaman Persentase akumulasi keragaman
1 6.3438 43.6 43.6 dikelompokkan menjadi dua kelompok. Pola pengelompokan 10 aksesi jarak pagar berdasarkan AKU (Gambar 7) serupa dengan pola pengelompokan berdasarkan dendrogram pada koefisien kemiripan 0.66. Hasil AKU berdasarkan data 91 lokus hasil AFLP terhadap 10 aksesi jarak pagar menunjukkan nilai ciri lebih dari satu diperoleh pada karakter satu sampai karakter lima (Tabel 3). KU I dapat menerangkan keragaman lokus hasil AFLP dengan sepasang primer sebesar 43.6%, sedangkan KU II, KU III dan KU IV berturut-turut sebesar 19.1%, 10.4%, 8.6% dan 7.2%, sehingga kelima KU tersebut menjelaskan keragaman sebesar
Gambar 7 Plot tiga dimensi 10 aksesi jarak pagar berdasarkan penanda AFLP. AKU dari matriks peragam data biner hasil AFLP menggunakan sepasang primer pada 10 aksesi jarak pagar berhasil mengidentifikasi 14 lokus yang mempunyai nilai mutlak KU terbesar pada komponen I, II, III, IV dan V (Tabel
Bengkulu
3). Nilai terbesar pada KU I terdapat pada lokus ke 30, 43 dan 50. Nilai KU II terbesar terdapat pada lokus ke 14, 23, 24, 58 dan 71. Nilai KU III terbesar terdapat pada lokus ke 81, 85 dan 87. Nilai KU IV terbesar terdapat pada lokus ke 83 dan 89, serta nilai terbesar pada KU V terdapat pada lokus ke 29.
Tabel 3 Nilai mutlak komponen utama terbesar dari 91 lokus hasil AFLP dengan sepasang primer pada 10 aksesi jarak pagar
No Lokus ke KU I (43.6%) KU II (19.1%) KU III (10.4%) KU IV (8.6%) KU V (7.2%)
Untuk mengelompokkan aksesi Dompu, Lampung, Sukabumi dan Subang ke dalam satu kelompok digunakan lokus ke 30, 43 dan 50, karena lokus-lokus tersebut tidak terdapat pada aksesi Dompu, Lampung, Sukabumi dan Subang. Lokus ke 14, 23, 24, 58 dan 71 dapat digunakan untuk membedakan antara aksesi Madiun dan Sukabumi dengan aksesi-aksesi yang lain. Karena aksesi Madiun dan Sukabumi tidak mempunyai lokus ke 14, 23, 24, 58 dan 71, sedangkan aksesi yang lain mempunyai lokus-lokus tersebut.
Analisis Karakter Bunga dan AFLP
Analisis kemiripan
Hasil matriks koefisien kemiripan pada lima aksesi jarak pagar berdasarkan karakter bunga dan 91 lokus hasil AFLP menunjukkan rentang nilai berkisar 0.398-0.849 (Lampiran 3). Nilai koefisien terendah ditemukan antara aksesi Lampung dan Bengkulu, sedangkan nilai koefisien tertinggi ditemukan antara aksesi Bangka dan Bengkulu. Hal ini berarti bahwa jarak genetik antara aksesi Lampung dan Bengkulu jauh, karena antara aksesi Lampung dan Bengkulu hanya
mempunyai kemiripan 39.8%. Aksesi Bangka dan Bengkulu memiliki jarak genetik yang dekat karena mempunyai kemiripan 84.9%.
Analisis Gerombol (Cluster)
Analisis gerombol data gabungan karakter bunga dan 91 lokus hasil AFLP dari lima aksesi jarak pagar membentuk dendrogram dengan koefisien kemiripan berkisar 0.53-0.85 atau keragaman 15-47% (Gambar 8). Pada koefisien kemiripan 0.65 dapat dibentuk dua kelompok. Kelompok I terdiri dari aksesi Dompu, Lampung dan Sukabumi. Kelompok II terdiri dari aksesi Bengkulu dan Bangka.
DENDROGROGRAM MORFOLOGI DAN AFLP
Koefisien
0.53 0.55 0.57 0.59 0.61 0.63 0.65 0.67 0.69 0.71 0.73 0.75 0.77 0.79 0.81 0.83 0.85
pada lima aksesi jarak pagar yang dianalisis dengan SAHN-UPGMA pada program NTSYS-pc versi 2.02.
Analisis Komponen Utama
Hasil AKU pada lima aksesi jarak pagar berdasarkan karakter bunga dan AFLP menunjukkan bahwa nilai keragaman 70% diperoleh pada karakter kedua (Tabel 4), sehingga dibuat plot dua dimensi ekstraksi KU 1 dengan KU 2. Berdasarkan analisis ini terdapat 91 karakter yang diasumsikan tidak mempengaruhi pengelompokan dari lima aksesi jarak pagar yang berbunga. Tipe pengelompokan lima aksesi jarak pagar yang berbunga berdasarkan AKU menunjukkan pola yang serupa dengan hasil pengelompokan berdasarkan dendrogram pada koefisien kemiripan 0.65 (Gambar 9).
I
Tabel 4 Analisis komponen utama lima aksesi jarak pagar berdasarkan karakter bunga dan AFLP
Karakter Nilai ciri Persentase keragaman Persentase akumulasi keragaman
1 9.8286 54 54
2 4.3133 23.7 77.7
3 2.5167 13.8 91.5
4 1.5415 8.5 100
5 0 0 100
Berdasarkan analisis komponen utama yang diturunkan dari matriks peragam data karakter bunga dan 91 lokus hasil AFLP dengan sepasang primer pada lima aksesi jarak pagar yang berbunga, diperoleh empat komponen utama yang memiliki nilai ciri lebih dari satu (Tabel 4).
KOMPONEN PERTAMA
Gambar 9 Plot dua dimensi komponen utama berdasarkan karakter bunga dan 91 lokus AFLP pada lima aksesi jarak pagar ekstraksi KU 1 dengan KU 2 yang dianalisis dengan multivariate pada program Minitab 14.
AKU berdasarkan matriks peragam data karakter bunga dan AFLP lima aksesi jarak pagar yang berbunga berhasil mengidentifikasi 33 lokus yang mempunyai nilai mutlak KU terbesar pada komponen I, II, III dan IV (Tabel 5). AKU berdasarkan matriks peragam data biner karakter bunga dan AFLP menggunakan sepasang primer pada lima aksesi jarak pagar berhasil mengidentifikasi 33 lokus yang mempunyai nilai mutlak KU terbesar pada komponen I, II, III dan IV (Tabel 5). Nilai terbesar pada KU I terdapat pada lokus ke 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 13, 16, 17, 20, 21, 22, 23 dan 24. Nilai KU II terbesar terdapat pada jumlah bunga jantan, lokus ke 4, 35, 51, 59, 66 dan 67. Nilai KU III
terbesar terdapat pada lokus ke 47, serta nilai terbesar pada KU IV terdapat pada lokus ke 81, 82, 83, 84, 85, 87, 88, 89 dan 90.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Berdasarkan karakter bunga (rasio bunga jantan dan betina) dan 91 lokus pada DNA hasil AFLP pada lima aksesi jarak pagar yang berbunga ditemukan keragaman genetik. Dendrogram berdasarkan penanda AFLP, menggolongkan 10 aksesi jarak pagar ke dalam dua kelompok pada koefisien kemiripan 0.66. Kelompok I terdiri atas aksesi Madiun, Bangka, Jember, Bengkulu, Kediri dan Ponorogo yang mengelompok berdasarkan adanya lokus ke 30, 43 dan 50. Sedangkan kelompok II terdiri atas aksesi yang tidak memiliki ketiga lokus tersebut, yang meliputi aksesi Dompu, Lampung, Subang dan Sukabumi. Hasil Analisis Komponen Utama (AKU) ekstraksi Komponen Utama (KU) 1, KU 2 dan KU 3 menghasilkan plot tiga dimensi yang pola pengelompokkannya sama dengan pengelompokkan pada dendrogram.
Dendrogram hasil analisis kombinasi karakter bunga dan 91 lokus hasil AFLP pada lima aksesi jarak pagar yang berbunga menghasilkan dua kelompok pada koefisien kemiripan 0.65. Kelompok I terdiri atas aksesi Dompu, Lampung dan Sukabumi karena tidak memiliki 16 lokus DNA (lokus 17, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 43, 48, 64, 65, 75, 77, 78, 79 dan 80). Sedangkan kelompok II terdiri atas aksesi Bengkulu dan Bangka yang memiliki ke-16 lokus tersebut. Hasil AKU ekstraksi KU 1 dan KU 2 menghasilkan plot dua dimensi yang pola pengelompokkannya serupa dengan pola pengelompokkan dengan pengelompokan pada dendrogram.
Saran
Alam NS. 2005. Biodiesel jarak pagar. Jakarta: Agromedia Pustaka. Banerji et al. 1985. Jatropha seed oils for energy. Biomass 4: 277-282.
Becker K, Martinez HJ, Sidduraju P, Francis G, Davila OG. 2005. Chemical composition, toxic/antimetabolic constituents and effects of different treatments on their levels, in four provenances of Jatropha curcas L. from Mexico. Food Chem 96: 80-89.
Ben Chaim et al. 2001. Qtl mapping of fruit-related traits in pepper (Capsicum annuum). TAG 102: 1016-1028.
Bhattacharya A, Datta K, Kumar DS. 2005. Floral biology, floral resource constraints and pollination limitation in Jatropha curcas L. Pakistan J of Biol Sci 8: 456-460.
David A, Mahmud Z, Rivaie AA, Effendi DS, Mulyani A. 2006. Peta kesesuaian lahan dan iklim jarak pagar (Jatropha curcas L.). ProsidingStatus Teknologi Budidaya Jarak Pagar (Jatropha curcas L.). Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Jakarta: 11-12 April 2006. 14 hlm.
Doyle JJ, Doyle JL. 1987. Isolation of plant DNA from fresh tissues. Focus 12: 13-15.
Haris N. 2006. Ekspresi gen – gen responsive terhadap Corynespora cassiicola
pada tanaman karet (Hevea brasiliensis Muell.Arg.).[disertasi]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Hasnam, Hartati S. 2006. Penyediaan benih unggul harapan jarak pagar. Prosiding Status Teknologi Budidaya Jarak Pagar. Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Jakarta: 11-12 April 2006. 12 hlm.
Heller J. 1996. Physic nut (Jatropha curcas L.). Rome: International Plant Genetic Resources Institute. 66 hlm.
