Waktu dan Tempat
Penelitian dilakukan mulai bulan April 2007 sampai Oktober 2008, di Laboratorium Kultur Jaringan dan Laboratorium Penyakit Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (Balittro), Laboratorium Pengujian Balai Besar Pasca Panen, dan Laboratorium Mikroteknik Departement Biologi, Fakultas MIPA, IPB
Bahan dan Peralatan
Bahan tanaman yang digunakan adalah meristem jahe putih besar (inner shoot bud) var. Cimanggu 1 hasil perbanyakan vegetatif. Bahan kimia yang digunakan meliputi: unsur hara makro, mikro dan vitamin untuk media dasar Murashige and Skoog (MS), glutamin, L-proline, sukrosa, manitol, zat pengatur tumbuh 2,4-D, BA, acetocarmine, tween 20, clorox, agar, spiritus, alkohol, dithane/benlate, asetic asid (asam asetat), asam salisilat (SA), methanol, H3PO4, xilol, safranin, fast green, paraplast, n-Butanol, etanol, dan etil alkohol. Jenis bakteri yang akan diuji (filtrat) untuk medium selektif yaitu: Isolat bakteri patogen R. solanacearum.
Alat yang digunakan meliputi: Laminar air flow cabinet, autoklaf, timbangan analitik, oven, mikroskop, pH meter, HPLC, sentrifius, mikrotom putar, mikroskop camera, botol kultur, cawan petri, gelas piala, galas ukur, pipet pengaduk, pinset, skapel, lampu spritus dan hand sprayer, kertas saring Whatman 41 (0,45 m), filter steril (Millifore), alumunium foil, karet gelang, dissecting set, slide gelas, dan film.
Metode Penelitian
Penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 10 ulangan. Rancangan perlakuan yang digunakan adalah faktor tunggal, yaitu konsentrasi filtrat bakteri patogen (R. solanacearum). Pada seleksi tahap satu konsentrasi filtrat R. solanacearum yang diuji meliputi: 0 (kontrol), 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 1%,
Konsentrasi filtrat bakteri patogen (R. solanacearum) tahap 2 adalah: 0 (kontrol), 1%, 2%, 3%, 4% ,5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% dalam media MS.
Model matematika yang digunakan adalah model linier rancangan acak lengkap sebagai berikut :
Yij = + i + ij Dimana : i = 1,2,3...,t J = 1,2,3,..., r
Yij = Pengamatan pada perlakuan konsentrasi ke-i dan ulangan ke-j = Rataan umum
i = Pengaruh perlakuan konsentrasi ke-i
ij = Pengaruh acak pada perlakuan ke-i ulangan ke-j.
Pengujian hipotesis dilakukan dengan uji F pada taraf 5%. Sebagai uji lanjut dari uji F, digunakan Uji Jarak Berganda Duncan (UJGD) pada taraf 5%.
Penelitian dilaksanakan lima tahap. Tahap pertama dilakukan untuk mendapatkan kalus embriogenik, tahap kedua menganalisis kalus embriogenik, tahap ketiga untuk menginduksi ketahanan kalus jahe terhadap penyakit layu bakteri yang dilakukan melalui pendekatan medium selektif, tahap keempat menganalisis kandungan asam salisilat pada kalus dan tahap kelima menganalisis kalus hasil seleksi. Tahapan penelitian disesuaikan dengan tahap pertumbuhan dan perkembangan kalus yaitu :
Induksi Kalus Embriogenik
Sebanyak 300 meristem (inner shoot bud) dari mata tunas aksilar jahe putih besar var. Cimanggu-I berumur 3 minggu digunakan sebagai eksplan. Untuk menyeragamkan asal eksplan, jahe yang digunakan dipanen pada umur yang sama. Setelah disterilisasi mata tunas diisolasi di bawah mikroskop untuk mendapatkan meristem tunas. Kalus embriogenik diinduksi dengan mengkulturkan meristem aseptik di dalam medium terbaik hasil penelitian sebelumnya (Rostiana & Syahid 2008) yaitu MS (Murashige and Skoog) dengan penambahan 2% sukrosa, 100 mg/l glutamin, 1,0 mg/l 2,4-D dan 3,0 mg/l BA.
Kalus embriogenik yang berumur 8 minggu lalu disubkultur ke media yang sama untuk memperoleh kalus embriogenik dalam kuantitas yang cukup banyak dan respon induksi kalus embriogenik yang lebih seragam. Diharapkan pada tahapan ini dapat diperoleh satuan eksperimen (kalus embriogenik) dalam jumlah banyak sehingga memungkinkan untuk digunakan pada tahap selanjutnya. Pada tahap ini tidak diterapkan metode perancangan percobaan, karena sudah ditentukan medium dasar terbaik berdasarkan hasil penelitian sebelumnya.
Seleksi Kalus dengan Menggunakan Filtrat Bakteri R. solanacearum
Bahan yang digunakan untuk seleksi adalah kalus embriogenik yang telah diinduksi pada tahap satu. Filtrat bakteri R. solanacearum yang diperoleh dari koleksi laboratorium bakteri Balittro ditambahkan ke dalam medium selektif. Filtrat yang dikulturkan bersama-sama dengan kalus embriogenik digunakan sebagai penyeleksi.
Media selektif yang digunakan sebagai perlakuan yaitu medium dasar MS cair yang ditambahkan manitol 3% dan agen selektif sebagai berikut:
1. MS [Kontrol (kalus dikulturkan di dalam medium MS cair tanpa filtrat)]
2. MS + filtrat bakteri patogen (R. solanacearum) dengan konsentrasi, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5% (tahap 1), dan 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% (tahap 2).
Metode seleksi yang digunakan adalah seleksi bertingkat, yaitu pada setiap tingkat seleksi konsentrasi filtrat ditingkatkan. Pada seleksi tingkat pertama, kalus dikulturkan ke dalam media yang diberi perlakuan filtrat selama 3 minggu. Kalus yang bertahan hidup disubkultur ke dalam medium MS (tanpa filtrat) selama 3 minggu. Pada seleksi tingkat kedua konsentrasi filtrat ditingkatkan sampai 10 kali konsentrasi awal kalus dikulturkan selama 3 minggu, kalus yang bertahan hidup disubkultur ke dalam medium MS (tanpa filtrat) selama 3 minggu.
Tabel 1. Perlakuan filtrat R. solanacearum pada kultur kalus embriogenik jahe Seleksi tahap 1 (3 minggu) Tahap Pemulihan (3 minggu) Seleksi tahap 2 (3 minggu) Tahap Pemulihan (3 minggu) MS (Kontrol) MS MS (Kontrol) MS MS+ filtrat 0,1% MS MS + filtrat 1% MS MS + filtrat 0,2% MS MS + filtrat 2% MS MS + filtrat 0,3% MS MS + filtrat 3% MS MS + filtrat 0,4% MS MS + filtrat 4% MS MS + filtrat 0,5% MS MS + filtrat 5% MS MS + filtrat 1% MS MS + filtrat 10% MS MS + filtrat 2% MS MS + filtrat 20% MS MS + filtrat 3% MS MS + filtrat 30% MS MS + filtrat 4% MS MS + filtrat 40% MS MS + filtrat 5% MS MS + filtrat 50% MS
Keterangan : Tanda panah memperlihatkan tahapan subkultur pada proses seleksi
Analisis Histologi kalus
Analisis jaringan sel dilakukan untuk menentukan sumber eksplan adalah kalus embriogenik dan melihat perbedaan karakter anatomi kalus. Histologi dilakukan sebelum seleksi untuk menentukan kalus yang digunakan merupakan kalus embriogenik, sementara untuk melihat perbedaan karakter anatomi akibat akibat perlakuan filtrat, pengamatan histologi dilakukan setelah kalus diseleksi dengan filtrat bakteri R. solanacearum.
Analisis Kandungan Asam Salisilat (Salicylic Acid/SA)
Analisis total kandungan asam salisilat dalam jaringan kalus ditentukan dengan
menggunakan HPLC (High Performance Liquid Chomography). Total SA ditentukan
dengan cairan khromatograpi. Analisis dilakukan pada saat seleksi tahap kedua selesai dilaksanakan (sebelum disubkultur ke medium MS/tahap pemulihan ke-2). Sebagai pembanding digunakan asam salisilat komersial.
Pelaksanaan Penelitian Pembuatan Media
Bahan kimia yang diperlukan untuk membuat larutan media MS dapat dilihat pada Lampiran 1. Stok larutan baku yang telah dibuat dipipet sesuai keperluan. Ke dalam larutan ditambahkan 2% sukrosa, 100 mg/l glutamin, 1,0 mg/l 2,4-D dan 3,0 mg/l BA pada tahap induksi kalus, sementara untuk tahap seleksi ditambahkan Manitol 30 gram. Larutan diaduk rata, kemudian pH-nya diatur ± 5,7 dengan menggunakan pH meter. Untuk menaikkan dan menurunkan pH media diberikan larutan NaOH 0,1 N atau HCl 0,1 N. Volume larutan dicukupkan hingga 1000 ml dengan menambahkan aquades. Sebagai pemadat ditambahkan 8 gram bacto agar.
Larutan dipanaskan hingga menjadi homogen. Media dituangkan ke dalam botol kultur sebanyak ± 20 ml perbotol. Botol ditutup dengan almunium foil, lalu diikat dengan karet, kemudian diautoklaf selama 20 menit pada suhu 1200C dengan tekanan 17,5 psi. Media yang telah disterilisasi diletakkan pada rak kultur di dalam ruang kultur.
Sterilisasi Eksplan, Isolasi Meristem dan Induksi Kalus
Tunas jahe untuk eksplan dipilih dari rimpang yang sehat. Mata tunas dipotong sepanjang ± 1 cm, dicuci dengan air mengalir lalu direndam larutan marsal 2% selama 1 jam, kemudian dibilas dengan air steril. Selanjutnya direndam larutan dithane 2 g/l dan agrimisin 2 g/l selama 1 jam, dan dibilas air steril. Terakhir eksplan
direndam dengan alkohol 70% dan HgCl2 0,2% selama 5 menit, klorox 20% selama 8
Gambar 4. Tahapan Isolasi Eksplan Meristem Jahe. A. Isolasi meristem jahe B. Kultur meristem jahe (Skala 1 : 2)
Sebanyak 300 mata tunas steril jahe diisolasi di bawah mikroskop untuk mendapatkan meristem tunas. Meristem aseptik dikulturkan di dalam medium MS (Murashige & Skoog 1962) dengan penambahan 2% sukrosa, 100 mg/l glutamin, 1,0 mg/l 2,4-D dan 3,0 mg/l BA untuk diinduksi menjadi kalus embriogenik (Gambar 4).
Setelah selesai pengkulturan, botol kultur diletakkan pada ruang inkubasi pada suhu ± 27 ºC. Rak inkubasi diselimuti dengan kain berwarna hitam untuk menghindari masuknya cahaya.
Kalus yang berumur 8 minggu disubkultur ke media yang sama. Hal ini dilakukan untuk menyeragamkan dan memperbanyak jumlah kalus embriogenik, sehingga diperoleh jumlah yang cukup untuk diperlakukan pada tahapan selanjutnya.
Seleksi Kalus dengan Menggunakan Filtrat Bakteri R. solanacearum
Bahan yang digunakan untuk seleksi adalah kalus embriogenik jahe yang telah diinduksi pada media MS dengan penambahan 2% sukrosa, 100 mg/l glutamin, 1,0 mg/l 2,4-D dan 3,0 mg/l BA. Bakteri R. solanacearum diperoleh dari koleksi laboratorium bakteri Balittro di sub kultur pada media tumbuh SPA, diinkubasi pada suhu 280 C selama 3 hari, kemudian inokulum dimasukkan ke dalam media cair Sukrosa Peptone (SP) pada suhu ruang selama 3 hari. Filtrat dipisahkan dari sel dengan cara sentrifugasi pada 10.000 rpm selama 20 menit. Filtrat disterilkan dengan
cara filtrasi menggunakan filter steril 0,45 m (Whatman). Filtrat disimpan pada suhu 40 C sampai siap digunakan.
Filtrat yang telah steril ditambahkan ke media MS yang ditambahkan manitol 3% sesuai dengan konsentrasi perlakuan. Kalus embriogenik yang telah terbentuk ditimbang masing- masing seberat 0,5 gram. Kalus kemudian dimasukkan ke dalam botol kultur yang telah berisi media MS, 3% manitol dan filtrat R. solanacearum. Botol kultur diletakkan di atas seker di ruang inkubasi dengan suhu ± 27 ºC. Selama proses seleksi, seker diselimuti dengan kain berwarna hitam untuk menghindari masuknya cahaya.
Analisis Histologi Kalus
Analisis histologi kalus menggunakan metode Nakamura (1995). Kalus nodular difiksasi dalam larutan FAA (Formaldehid, Asam asetat glasssal, Alkohol) selama 24 jam. Kalus dihidrasi dalam seri n-butanal dengan waktu perendaman masing- masing tahap 60 menit. Kalus kemudian diinfiltrasi dengan menambahkan paraplas cair dalam n-butanol. Kalus di inkubasi pada suhu kamar selama 12 jam, lalu dipindahkan ke oven dengan suhu 58º C selama 24 jam. Selanjutnya cairan paraplas dibuang diganti dengan paraplas baru dan disimpan dalam oven pada suhu 58oC selama 3 hari. Kalus diblok di dalam paraplas dalam cawan cetakan. Tahapan selanjutnya spesimen tersebut dipotong setebal 10 m dengan mikrotom putar (Yamato RV-240) dan diwarnai dengan pewarnaan ganda yaitu larutan safranin 2 % dan fastgreen 0,5 %. Akhirnya diletakkan pada kaca glass untuk diamati dengan mikroskop cahaya.
Analisis Kandungan Asam Salisilat (Salicylic Acid/SA)
Analisis kandungan asam salisilat menggunakan metode Bevilacgua & Califano (1989). Untuk melihat kandungan asam salisilat pada kalus yang telah diberi perlakuan filtrat R. solanacearum dilakukan dengan cara mengeringkan sampel kalus
kemudian disentrifius pada kecepatan 4000 rpm selama 15 menit. Supernatan selanjutnya diinjek ke dalam HPLC (High Performance Liquid Chomography). Total SA ditentukan dengan cairan khromatografi dengan SA komersial digunakan sebagai pembanding.
Peubah yang Diamati
Peubah yang diamati meliputi: Jumlah kalus yang terbentuk (%), morfologi kalus, bobot segar kalus, diameter kalus, kematian kalus, histologi kalus dan kandungan asam salisilat. Jumlah kalus yang terbentuk diamati pada saat eksplan berumur 8 minggu setelah tanam. Persentasi jumlah kalus yang berhasil terbentuk dihitung dibandingkan dengan jumlah eksplan yang ditanam.
Morfologi kalus dilihat dengan memperhatikan tekstur kalus dan warna kalus yang terlihat pada kalus setelah diperlakukan dengan filtrat R. solanacearum dibandingkan dengan kontrol. Morfologi kalus diamati setelah kalus 3 minggu dalam media selektif filtrat R. solanacearum tahap 1 dan 2.
Untuk bobot segar dan diameter kalus ditimbang dan diukur setiap 3 minggu pada saat kalus telah dimasukkan kemedia perlakuan filtrat R. solanacearum dan sewaktu dipindahkan ke media tahap seleksi selanjutnya. Bobot kalus ditimbang dengan menggunakan timbangan analitik sementara diameter kalus diukur dengan mengukur panjang kalus terpanjang dan kalus terlebar.
Kematian kalus dilihat dengan cara melihat persentase kematian kalus dalam satu botol kultur. Pengamatan kematian kalus dilakukan setelah kalus seleksi tahap 2 dengan filtrat R. solanacearum. Kalus yang telah diseleksi kemudian disubkultur ke dalam media MS + manitol 3% dan kemedia pendewasaan embrio yaitu MS + sukrosa 6%. Untuk mempermudah melihat tingkat kematian kalus dilakukan skoring (penetapan angka) dengan kisaran seperti terlihat pada tabel 2. Kisaran tingkat kematian kalus berdasarkan perbedaan volume permukaan kalus yang mati dan yang hidup dalam satu botol kultur.
Tabel 2. Penetapan angka kematian kalus perbotol kultur Kematian kalus perbotol (%) Skor
0 - 24 1
25 - 49 2
50 - 74 3
75 - 100 4
Histologi kalus dilakukan pada saat kalus sebelum diseleksi dengan R. solanacearum dan pada saat setelah diperlakukan dengan filtrat R. solanacearum (setelah tahap pemulihan kedua). Sementara kandungan asam salisilat dilihat pada saat kalus telah diperlakukan R. solanacearum.