Pengambilan Contoh Tanah
Contoh tanah diambil dari lahan pertanian di Nusa Tenggara Timur, Lampung, Papua Barat, Sumatera Barat, Bali, dan Bangka Belitung (Tabel 1).
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Quorum sensing (QS) adalah komunikasi antar sel bakteri yang dimediasi oleh autoinduser (AI) pada quorum populasi tertentu untuk mengatur ekspresi gen-gen tertentu (Rukayadi & Hwang 2009). AI adalah senyawa berbobot molekul rendah yang disekresikan bakteri dan diakumulasikan sehingga AI dikenali sel bakteri lainnya kemudian diserap kembali. AI bakteri Gram negatif berbeda dengan Gram positif. Gram negatif menggunakan N-acyl homoserine lactone (AHL), sedangkan Gram positif menggunakan senyawa peptida yang dihasilkan melalui jalur ATP Binding Cassette
(ABC) (Rukayadi & Hwang 2009). Sistem QS bekerja pada gen-gen yang berhubungan dengan perilaku populasi bakteri seperti pembentukan biofilm, virulensi pada inang, bioluminescence, dan pembentukan antibiotik (Gera & Srivastava 2006).
Anti-quorum sensing (anti-QS) merupakan salah satu alternatif pengendalian penyakit tanpa mematikan bakteri patogen. Senyawa anti-QS dapat memblok atau mengacau proses QS. Senyawa anti-QS dapat dikelompokkan menjadi tiga jenis, yaitu: (1) senyawa pendegradasi (degradator) yaitu senyawa yang dapat mendegradasi AI atau komponen pengatur QS lainnya dan senyawa ini biasanya berupa enzim, (2) senyawa antagonis, dan (3) senyawa kompetitor yaitu senyawa yang dapat berkompetisi dengan AI membentuk kompleks dengan protein reseptor (Rukayadi & Hwang 2009). Proses QS juga dapat dicegah oleh reaksi laktonolisis (terbukanya cincin lakton) akibat peningkatan pH >7 di sekitar sel target. Namun ketika pH kembali turun (asam) cincin lakton kembali terbentuk (Rasmussen & Givskov 2006). Degradasi enzimatik molekul AHL merupakan cara yang efektif dalam mengcegah proses QS. Ada dua jenis enzim pendegradasi AHL, yaitu AHL– acylase dan AHL-laktonase.
AHL-acylase adalah enzim penghidrolisis ikatan peptida pada rantai acyl molekul AHL dan menghasilkan asam lemak bebas serta
homoserine lacton. Produk degradasi tersebut digunakan kembali untuk proses metabolisme bakteri yaitu sebagai sumber energi, nitrogen, dan karbon. Beberapa gen yang menyandikan AHL-acylase telah ditemukan yaitu aiiD dari
Ralstonia eutropha, PvdQ dan QuiP dari
Pseudomonas, AhlM dari Streptomyces sp.,
dan aiiC dari Anabaena sp. PCC7120 (Czajkowski & Jafra 2009).
AHL-laktonase merusak proses QS melalui hidrolisis enzimatis cincin lakton molekul AHL. Salah satu gen penyandi AHL-laktonase adalah gen aiiA. Gen aiiA pertama kali ditemukan pada Bacillus sp. strain 240B1 (Dong et al. 2000). AHL-laktonase terdiri dari dua klaster yaitu klaster aiiA pada genus
Bacillus dan Attm pada Agrobacterium tumefaciens, Arthrobacter sp., dan Klebsiella pneumonia (Dong & Zhang 2005). Homologi
aiiA kemudian ditemukan pada beberapa spesies Bacillus lainnya yaitu B. subtilis, B. cereus, B. mycoides dan beberapa strain dari
B. thuringiensis (Dong et al. 2002).
Kemampuan suatu bakteri dalam mendegradasi AHL dapat diuji dengan menggunakan Chromobacterium violaceum
sebagai bioindikator. Chromobacterium violaceum menggunakan proses QS untuk mengatur ekspresi gen Vio yang menyandikan pigmen berwarna ungu yang disebut violacein (August et al. 2000).
Penelitian mengenai QS memiliki potensi dan manfaat yang sangat besar karena dapat dijadikan alternatif pengendalian bakteri patogen yang ramah lingkungan dan tidak memicu resistensi. Isolasi dan karakterisasi bakteri penghasil AHL-laktonase dari lahan pertanian dapat dijadikan sebagai langkah awal memanfaatkan mekanisme anti-QS untuk mengendalikan bakteri patogen terutama pada tanaman.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi bakteri penghasil AHL-laktonase asal lahan pertanian di luar Pulau Jawa.
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan November 2010 sampai Mei 2011 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB.
BAHAN DAN METODE
Pengambilan Contoh Tanah
Contoh tanah diambil dari lahan pertanian di Nusa Tenggara Timur, Lampung, Papua Barat, Sumatera Barat, Bali, dan Bangka Belitung (Tabel 1).
2
Tabel 1 Sampel tanah bahan isolasi bakteri
No. Provinsi Desa/Kecamatan/Kabupaten Jumlah
sampel Kode sampel 1. Bangka
Belitung
Kelubi, Manggar, Belitung
Timur 1 BLT1
2. Bali Tibubiyu, Kerambitan,
Tabanan 1 BAL1
3. Bali Beraban, Selemadeg, Tabanan 1 BAL2 4. Sumatera
Barat
Ladang Darek, Kamang
Magek, Agam 1 PAD1 5. Papua Barat Danaweria, Fak-Fak 2 PAP1, PAP2 6. Lampung Bandung Baru, Adiluwih,
Pringsewu 2 LMP1, LMP2 7. Nusa Tenggara
Timur
Lambanapu, Kambera, Sumba
Timur 8
NTT1, NTT2, NTT3, NTT4, NTT5, NTT6, NTT7, NTT8
Isolasi dan Penyimpanan Bakteri
Sebanyak 1 g tanah disuspensikan dengan garam fisiologis 0.85% kemudian diencerkan secara serial sampai pengenceran 10-6, 10-7, dan 10-8. Masing-masing hasil pengenceran
diambil 100 µl dan disebarkan pada media nutrient agar (NA) (Lampiran 1). Sisa hasil pengenceran dipanaskan pada suhu 80º C
selama 10 menit lalu diambil sebanyak 100 µl
untuk disebarkan ke media NA yang baru. Media NA yang telah diinokulasi kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37º C. Koloni tunggal yang tumbuh dimurnikan dengan metode cawan gores pada media dengan bahan komposisi yang sama. Setelah didapatkan koloni murni, isolat dipindahkan pada media NA miring kemudian disimpan dalam lemari pendingin sampai saat digunakan.
Bioesai Aktivitas Degradasi AHL
Sebanyak satu lup kultur bakteri diinokulasikan ke dalam 3 ml media luria broth (LB) (Lampiran 1) lalu diinkubasi pada suhu ruang. Setelah 16-18 jam, kultur disentrifugasi (12000 rpm, 10 menit) untuk diambil supernatannya. Sebanyak 100 µL
supernatan diteteskan pada paper disc di atas media luria agar (LA) semi-padat (Lampiran 1) yang telah diinokulasikan dengan 1% kultur Chromobacterium violaceum. Selanjutnya cawan LA tersebut diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Paper disc
yang dikelilingi oleh zona berwarna tidak ungu menunjukkan adanya aktivitas degradasi AHL oleh enzim yang dieksresikan oleh isolat bakteri yang diuji.
Isolasi Genom dan Amplifikasi Gen Penyandi AHL-laktonase
DNA bakteri diisolasi menggunakan metode Lazzo (Sambrook & Russell 2001). DNA total yang diperoleh digunakan sebagai
template untuk amplifikasi gen penyandi AHL-laktonase menggunakan primer aiiAF (5’- ATC GGA TCC ATG ACA GTA AAG AAG CTT TAT TTC G-3’) dan aiiAR (5’-GTC GAA TTC CTC AAC AAG ATA CTC CTA ATG ATG T-3’) (Dong et al. 2000). Campuran reaksi PCR yang digunakan terdiri
dari 32 µl ddH2O, 5 µl 10x buffer, 3 µl 25
mM MgSO4, 5 µl dNTPS, 1,5 µl masing-masing primer, 1 µl template, dan 1 µl DNA polymerase (KOD hot start). Amplifikasi dilakukan selama 32 siklus dengan kondisi pra-denaturasi (94ºC, 10 menit), denaturasi (94ºC, 30 detik), annealing (52ºC, 30 detik), elongasi (72ºC, 1 menit), dan post-elongasi (72ºC, 5 menit) (Chan et al. 2007). Hasil PCR kemudian dilarikan pada 1% gel elektroforesis dan diwarnai dengan Ethidium Bromide
(EtBr).
Identifikasi Isolat Pendegradasi AHL Isolat-isolat yang menunjukkan hasil positif bioesei degradasi AHL dan amplifikasi gen penyandi AHL-laktonase diidentifikasi secara molekuler. Amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan menggunakan primer 63f (5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’) dan 1387r (5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3’) (Marchesi et al. 1998). Amplifikasi dilakukan selama 30 siklus dengan kondisi pra-denaturasi (95ºC, 5 menit), denaturasi (95ºC, 30 detik), annealing (55ºC, 1 menit), elongasi (72ºC, 5 menit), dan post-elongasi (72ºC, 5 menit). Hasil amplifikasi gen 16s rRNA kemudian dikirim ke perusahaan penyedia jasa sekuensing.
HASIL
Isolasi dan Penyimpanan Bakteri
Sebanyak 58 isolat berhasil diisolasi dan enam di antaranya memiliki aktivitas degradasi AHL (Tabel 2). Keenam isolat tersebut merupakan bakteri Gram positif berbentuk batang. Lima di antaranya membentuk endospora (Tabel 3) (Lampiran 2 & 3).
Tabel 2 Isolat bakteri yang diperoleh dari setiap sampel tanah
No. Kode sampel Isolat yang diperoleh Jumlah isolat positif bioesei 1. BLT1 4 - 2. BAL1 3 - 3. BAL2 2 1 4. PAD1 1 1 5. PAP1 4 - 6. PAP2 2 - 7. LMP1 6 - 8. LMP2 3 - 9. NTT1 2 - 10. NTT2 - - 11. NTT3 6 2 12. NTT4 2 - 13. NTT5 9 - 14. NTT6 11 2 15. NTT7 1 - 16. NTT8 2 - Total 58 6
Bioesai Aktivitas Degradasi AHL
Isolat PAD1a menunjukan diameter zona degradasi AHL terbesar yaitu 0.9 cm. Sedangkan isolat NTT3a, NTT3e, dan NTT6B7 memiliki diameter zona degradasi AHL yang paling kecil yaitu sebesar 0.3 cm (Tabel 3) (Gambar 1).
Amplifikasi Gen Penyandi AHL-laktonase Hasil amplifikasi gen aiiA menunjukkan terdapat dua isolat yang mengandung gen
aiiA. Dua isolat tersebut adalah NTT3a dan NTT3e. Ukuran amplikon 800 bp (Gambar 2). Hasil analisis BLAST-N dan BLAST-X menunjukkan gen aiiA isolat NTT3a dan NTT3e homolog dengan AHL-laktonase
Bacillus sp. 91 (Lampiran 4) (Tabel 4).
Tabel 3 Diameter zona degradasi AHL enam isolat terpilih No. Kode isolat Diameter zona degradasi (cm) Morfologi sel
1. PAD1a 0.9 Gram positif, batang, tidak berendospora 2. BAL2a 0.4 Gram positif,
batang, berendospora 3. NTT3e 0.3 Gram positif,
batang, berendospora 4. NTT3a 0.3 Gram positif,
batang, berendospora 5. NTT6B6 0.5 Gram positif, batang, berendospora 6. NTT6B7 0.3 Gram positif, batang, berendospora
Gambar 1 Zona degradasi AHL oleh supernatan isolat PAD1a (A), BAL2a (B), NTT3e (C), NTT3a (D), NTT6B6 (E), NTT6B7 (F), dan kontrol negatif (G). A B D E G F C
4
Tabel 4 Hasil analisis gen aiiA pada isolat NTT3a dan NTT3e Kode isolat Homologi bakteri
(BLAST-N) (a)
Homologi protein (BLAST-X)
(b) Nilai identitas NTT3a Bacillus sp. 91 AHL-lactonase gene Length= 753 AHL-lactonase [Bacillus sp. 91] Length= 250 724/725 (99%) (a), 239/240 (99%) (b) NTT3e Bacillus sp. 91 AHL-lactonase gene Length= 753 AHL-lactonase [Bacillus sp. 91] Length= 250 724/725 (99%) (a), 239/240 (99%) (b)
Tabel 5 Hasil analisis gen 16S rRNA isolat-isolat pendegradasi AHL Kode isolat Homologi bakteri
(BLAST-N) Nilai identitas PAD1a Microbacterium sp. Bg-7 Length=1383 1025/1039 (99%) BAL2a Uncultured bacterium clone ncd1261e03c1
Length=1372
609/683 (89%)
NTT3a Bacillus sp. AF-777 Length=1522 455/471 (99%) NTT3e Bacillus sp. NIOT-3 Length=1445 807/814 (97%) NTT6B6 Bacillussubtilis strain HU48 Length=1427 1147/1149 (99%) NTT6B7 Bacillussubtilis strain GD1 Length=1452 1025/1028 (99%)
Identifikasi Isolat Pendegradasi AHL Berdasarkan hasil bioesai dan deteksi gen aiiA dilakukan identifikasi gen 16S rRNA terhadap enam isolat yang memiliki aktivitas degradasi AHL. Amplikon berukuran 1300 bp (Gambar 3). Analisis gen 16S rRNA menunjukkan isolat NTT3a, NTT3e, NTT6B6, dan NTT6B7 termasuk kedalam genus Bacillus, isolat PAD1a mirip dengan Microbacterium sp. Bg-7, dan isolat BAL2a mirip dengan Uncultured bacterium clone ncd1261e03c1 (Lampiran 5) (Tabel 5).
Gambar 3 Visualisasi pita DNA hasil amplifikasi gen 16S rRNA pada isolat pendegradasi AHL (kiri-kanan; PAD1a, BAL2a, NTT6B6, NTT6B7, NTT3a, NTT3e, dan ladder 1 kb).
Analisis Filogenetik Gen Pendegradasi AHL
Analisis filogenetik gen pendegradasi AHL menggunakan metode Neighbor Joining (NJ) (Tamura et al. 2007) dengan boostrap 1000x menunjukkan bahwa isolat NTT3e dan isolat NTT3a terletak dalam satu klaster dengan bakteri penghasil AHL-laktonase Bacillus Sp. 91 dengan nilai konsistensi boostrap hanya 47%. Pohon filogenetik tersebut membentuk dua klaster besar yang terpisah yaitu klaster bakteri yang menghasilkan AHL-laktonase dan AHL-acylase (Gambar 4). 1500 1000 750 500 250
Gambar 2 Visualisasi pita DNA hasil amplifikasi gen aiiA pada isolat NTT3a dan NTT3e (kiri-kanan;
ladder 1 kb, NTT3e, dan NTT3a).
250 500 750 1000
Gambar 4 Pohon filogenetik gen aiiA NTT3e dan NTT3a dibandingkan dengan beberapa spesies penghasil AHL-laktonase dan AHL-acylase menggunakan metode Neighbor Joining (NJ) dengan boostrap 1000x.
PEMBAHASAN
Hasil bioesai menunjukkan dari 58 isolat yang diperoleh, enam isolat di antaranya memiliki aktivitas degradasi AHL. Hal ini ditunjukkan dengan hilangnya pigmen ungu pada kultur Chromobacterium violaceum
setelah diinkubasi selama 24 jam (Gambar 1). Isolat PAD1a menunjukkan aktivitas degradasi terbaik dengan diameter zona degradasi 0.9 cm. Dibandingkan dengan diameter zona degradasi AHL empat isolat lainnya, diameter zona degradasi AHL isolat NTT3a dan NTT3e relatif lebih kecil. Walaupun demikian, dari enam isolat yang menunjukkan hasil positif pada bioesai degradasi AHL hanya isolat NTT3a dan NTT3e yang berhasil diamplifikasi gen
aiiAnya. Isolat BAL2a, NTT6B6, PAD1a, dan NTT6B7 merupakan isolat-isolat yang memiliki aktivitas degradasi AHL namun tidak menunjukkan produk amplifikasi gen
aiiA. Hal ini dapat disebabkan oleh perbedaan gen penyandi AHL-laktonase yang dimiliki oleh isolat-isolat tersebut. Selain AHL-laktonase degradasi AHL juga dapat disebabkan oleh aktivitas AHL-acylase.
Amplifikasi gen aiiA pada isolat NTT3a dan NTT3e menunjukkan amplikon yang berukuran 800 bp (Gambar 2), hal ini sesuai dengan penelitian Chan et al. (2007) yang membuktikan bahwa amplikon hasil PCR gen
aiiA pada bakteri tanah sebesar 800 bp. Analisis sekuen gen aiiA isolat NTT3e dan
NTT3a berdasarkan BLAST-N dan BLAST-X masing-masing menunjukkan tingkat homologi 99% dengan AHL-laktonase pada
Bacillus sp. 91. AHL-laktonase spesifik mendegradasi molekul AHL karena hanya menunjukkan aktivitas degradasi terhadap L-homoserine lacton dan tidak menunjukkan aktivitas degradasi pada non-cyclic ester. Enzim ini aktivitasnya stabil pada suhu di bawah 37ºC tetapi tidak stabil pada suhu yang tinggi (Wang et al. 2004).
Amplifikasi gen 16S rRNA isolat PAD1a, BAL2a, NTT3e, NTT3a, NTT6B6, dan NTT6B7 menghasilkan amplikon berukuran 1300 bp (Gambar 2). Analisis gen 16S rRNA isolat PAD1a menunjukkan kemiripan dengan
Microbacterium sp. Bg-7 (nilai identitas 99%). Wang et al. (2010) juga melaporkan adanya aktivitas degradasi AHL pada
Microbacterium testaceum StLB037 yang diisolasi dari daun kentang. Aktivitas degradasi AHL pada bakteri ini mirip dengan aktivitas degradasi AHL pada beberapa bakteri yang memiliki AHL-laktonase seperti
Bacillus sp., Arthrobacter sp., Agrobacterium tumefaciens, dan Rhodococcus erythropolis. AHL-laktonase pada Microbacterium testaceum StLB037 disandikan oleh gen aiiM. Hasil analisis 16S rRNA menunjukkan isolat BAL2a mirip dengan Uncultured bacterium clone ncd1261e03c1 (nilai identitas 89%), isolat NTT6B6 mirip dengan Bacillus subtilis
strain HU48 (nilai identitas 99%). Hasil analisis 16S rRNA isolat NTT6B7 mirip dengan Bacillus subtilis strain GD1 (nilai NTT3e
NTT3a
Bacillus sp. 91 (ABQ42910.1)
Bacillus thuringiensis (ABN11118.1)
Bacillus sp. EGU18 (AEB20400.1)
Bacillus cereus (AEA48310.1)
Agrobacterium tumefaciens (AAL13075.1)
Pseudomonas sp. THA3 (AAP68798.1)
Pseudomonas sp. 130 (AAC34685.2)
Streptomyces sp. M664 (AAT68473.1)
Ralstonia sp. XJ12B (AAO41113.1)
Ralstonia solanacearum GMI1000 (NP 52066)
100 100 100 100 100 47 44 42 0.1 90 AHL-laktonase AHL-acylase
6
identitas 99%), isolat NTT3e mirip dengan
Bacillus sp. NIOT-3 (nilai identitas 99%), dan isolat NTT3a mirip dengan Bacillus sp. AF-777 (nilai identitas 97%). Menurut Dong et al.
(2002), genus Bacillus sebagian besar memiliki gen aiiA yang menyandikan AHL-laktonase. Chan et al. (2007) juga melaporkan bahwa sebanyak 12 isolat dari 50 isolat
Bacillus yang diisolasi dari tanah tropis memiliki gen yang homolog dengan gen aiiA. Analisis filogenetik gen pendegradasi AHL menggunakan metode Neighbor Joining (NJ) dengan boostrap 1000x menunjukkan bahwa isolat NTT3a dan isolat NTT3e terletak dalam satu klaster dengan bakteri penghasil AHL-laktonase Bacillus Sp. 91 (Gambar 4). Nilai konsistensi boostrap antara NTT3a dan NTT3e mencapai 90% yang menunjukkan bahwa gen aiiA pada kedua isolat ini sangat mirip. Pohon filogenetik tersebut membentuk dua klaster besar yang terpisah yaitu klaster bakteri yang menghasilkan AHL-laktonase dan acylase. Sekuen enzim AHL-laktonase terdistribusi luas pada beberapa organisme meliputi Actinobacteria, Acido-bacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Deino-coccus-Thermus, Firmicutes, α -Proteobac-teria, β-Proteobacteria, γ-Proteobacteria, δ -Proteobacteria, Euryarchaeota, Crenarchaeota, Sphingobacteria, Spirochaetales, Nitrospira-les, and Planctomycetes. Namun hanya dua kelompok yaitu Firmicutes (12 genus dan 22
spp.) dan α-Proteobacteria (18 genus dan 22 spp.) yang memiliki aktivitas AHL-laktonase. Distribusi sekuen AHL-acylase lebih sempit dibandingkan sekuen AHL-laktonase. Distribusi sekuen enzim AHL-acylase meliputi Actinobacteria, Cyanobacteria, Bac-teroidetes, Deinococcus-Thermus, Firmicutes,
α-Proteobacteria, β-Proteobacteria, γ -Proteo-bacteria, δ-Proteobacteria, Euryarchaeota dan Crenarchaeota. Distribusi sekuen acylase sangat berbeda dengan sekuen AHL-laktonase. γ-Proteobacteria merupakan kelompok terbesar yang mengandung aktivitas AHL-acylase (20 genus dan 31 spp.) (Kalia et al. 2011).
SIMPULAN
Isolat NTT3e dan NTT3a memiliki gen
aiiA yang homolog dengan AHL-laktonase pada Bacillus sp. 91. Gen 16S rRNA isolat NTT3e mirip dengan Bacillus sp. NIOT-3 (nilai identitas: 99%). Sedangkan isolat NTT3a mirip dengan Bacillus sp. AF-777 (nilai identitas: 97%). Isolat PAD1a, BAL2a, NTT6B6, dan NTT6B7 memiliki aktivitas
degradasi AHL namun tidak berhasil diamplifikasi gen aiiAnya. Berdasarkan analisis gen 16S rRNA, isolat PAD1a mirip dengan Microbacterium sp. Bg-7, BAL2a mirip dengan Uncultured bacterium clone
ncd1261e03c1, NTT6B6 mirip dengan
Bacillus subtilis strain HU48, dan NTT6B7 mirip dengan Bacillussubtilis strain GD1.
SARAN
Perlu dilakukan karakterisasi molekuler gen pendegradasi AHL pada isolat yang memiliki aktivitas degaradasi AHL namun tidak berhasil diamplifikasi gen aiiAnya menggunakan primer aiiAF dan aiiAR.