Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan antara lain biakan berupa Enterobacter cloacae yang merupakan koleksi Bidang Mikrobiologi LIPI Cibinong. Media kultur dan media produksi terdiri atas 10 g laktosa, 5 g pepton, 10 g ekstrak khamir, dan 5 g NaCl yang dilarutkan dalam 1000 mL akuades (pH 7). Bufer yang digunakan adalah bufer fosfat 0.1 M, 0.05 M, dan 0.01 M, bufer asetat 0.1 M, bufer Tris-HCl 0.1 M. Bahan untuk penentuan aktivitas enzim β- galaktosidase, pembuatan kurva standar dan kadar protein adalah enzim β-galaktosidase,
commasie briliant blue 0.1%, o-nitrofenil-β-D- galaktopiranosida (oNPGal), Na2CO3 1 M, dan o-nitrofenol (oNP), bovine serum albumin
(BSA). Bahan untuk pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim digunakan berbagai ion logam (Hg+, Cu2+, Ca2+, Co2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+). Bahan untuk pemurnian enzim digunakan garam amonium sulfat dan membran selofan.
Alat-alat yang digunakan untuk penentuan waktu produksi optimum, uji aktivitas enzim β- galaktosidase dan karakterisasinya serta produksi β-galaktosidase adalah mikropipet, jarum ose, tip, laminar air flow cabinet, tabung reaksi, tabung Eppendorf, labu Erlenmeyer, labu ukur, termometer, neraca analitik, vorteks, penangas air Memmert, penangas bergoyang,
stopwatch, pH meter HM-25G TOADKK, kuvet, spektrofotometer UV-Vis 1700 Shimadzu, inkubator Isuzu, botol sentrifus, sonikator Eyela. Alat-alat yang digunakan untuk dialisis adalah gelas piala 1 liter, membran selofan, kantung dialisis, dan
magnetic stirrer.
Metode Penelitian
Penentuan Waktu Produksi Optimum (Liu
et.al 2009)
Sebanyak 2% inokulum bakteri
0.7 setara dengan 1010 jumlah koloni/sel, diinokulasi ke dalam 300 mL media kultur, lalu diinkubasi dan diagitasi pada suhu 37ºC. Sel dipanen dua kali dalam sehari (setiap 6 jam) pada hari ke-0 hingga hari ke-2 sebanyak 15 mL. Setelah itu, jumlah bakteri diukur pada OD600, dan sampel disentrifugasi dengan
kecepatan 10000 rpm selama 15 menit pada suhu 4ºC. Kemudian, pelet dilarutkan dalam 1 mL bufer fosfat 0.05 M pH 6.5. Pemecahan sel dilakukan dengan menggunakan glass bead dan divorteks selama 5 menit. Selanjutnya, suspensi sel disentrifus dengan kecepatan 10000 rpm selama 15 menit pada suhu 4ºC. Supernatannya kemudian digunakan untuk uji aktivitas β- galaktosidase.
Uji Aktivitas Enzim β-Galaktosidase (Liu et
al. 2009)
Sebanyak 1000 µl buffer fosfat 0.1 M pH 7 dan 100 µl enzim dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 5 menit. Larutan ditambahkan 200 µl
o-nitrofenil-β-D-galaktopiranosida (oNPGal) 4 mg/ml dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 15 menit. Menit ke-15 larutan ditambahkan 1000 µl Na2CO3 1 M. Setelah itu, larutan
dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 420 nm. Aktivitas enzim (U/ml) didefinisikan sebagai jumlah µ mol o- nitrofenol (oNP) yang dibentuk per menit per mililiter enzim pada kondisi percobaan. Pembuatan kurva standar dilakukan dengan cara membuat stok oNP berbagai konsentrasi dari 0.05-3 mg/ml (0.25-15 µ mol) yang dilarutkan dalam 20 mL bufer fosfat 0.01 M pH 7, kemudian larutan diaduk rata. Sebanyak 1000 µl buffer fosfat 0.1 M pH 7 dan 100 µl aquades dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Larutan tersebut ditambahkan 200 µl oNP, dan 1000 µl Na2CO3 1 M. Setelah itu, larutan
dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 420 nm. Rumus perhitungannya sebagai berikut: Aktivitas (U/ml) =
t
V
NP
mikromol
×
o
Keterangan:V = Volume enzim yang diuji (0.1 ml) t = Waktu inkubasi ( 15 menit)
Karakterisasi β-Galaktosidase (Liu et al. 2009)
Karakterisasi enzim meliputi suhu optimum, pH optimum, efek ion logam, pengaruh pemanasan dan parameter kinetik. Enzim diujikan pada suhu inkubasi (25-45°C) dengan
selang 5ºC, dan bufer pada kisaran pH 5.5-8.5 selang 0.5 diinkubasi selama 5 menit sebelum ditambahkan oNPGal 4 mg/ml. Pada pengaruh pemanasan selama 1 jam, enzim diujikan pada berbagai suhu dan pH, diinkubasi selama 1 jam, kemudian ditambahkan oNPGal 4 mg/ml dan diinkubasi selama 15 pada suhu 37 ºC . Ion-ion logam yang digunakan (Hg+, Cu2+, Ca2+, Co2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+) pada konsentrasi 0.01 M. Penentuan parameter kinetiknya dilakukan pada enzim kasar dan enzim hasil pemurnian (dialisis) yang diujikan pada konsentrasi 0.1, 1, 2, 4, 5 mg/ml dan waktu inkubasi 5-20 menit selang 5.
Produksi β-Galaktosidase (Wang &
Sakakibara 1997)
Sebanyak 2% inokulum E. cloacae
diinokulasikan ke dalam 900 ml media produksi yang telah steril, diinkubasi pada suhu 37 °C. Kemudian, sel dipanen setelah inkubasi selama 18 jam (waktu produksi β-galaktosidase optimum). Setelah itu, cairan disentrifus dengan kecepatan 10000 rpm (15.880 g) selama 15 menit pada suhu 4°C. Peletnya dilakukan pencucian sebanyak dua kali dengan buffer fosfat 0.05 M pH 6.5. Setelah itu, sebanyak pelet yang diperoleh dilarutkan dalam 30 ml buffer fosfat 0.05 M pH 6.5, dan dilakukan pemecahan sel dengan sonikator 50 kHz selama 5 menit pada suhu 4°C. Suspensi sel disentrifus dengan kecepatan 10000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C. Supernatan yang diperoleh merupakan cairan enzim β- galaktosidase.
Penentuan Kadar Protein (Bradford 1976)
Enzim β-galaktosidase sebanyak 100 l ditambahkan 5 ml larutan coomassie briliant blue 0.1%. Larutan divorteks dan didiamkan selama 5 menit lalu diukur absorbansinya pada panjang gelombang 595 nm. Pembuatan kurva standar protein yang digunakan adalah bovine serum albumin (BSA) dengan berbagai konsentrasi dari 0.005-1.25 mg/ml serta perlakuan yang sama dengan penentuan kadar protein.
Pengendapaan dengan Amonium Sulfat (Scopes 1987)
Sebanyak 20 mL ekstrak kasar β- galaktosidase diendapkan dengan amonium sulfat. Amonium sulfat yang ditambahkan secara bertahap dengan konsentrasi yaitu 10, 20, 30, 40, 50, 60, dan 70%, lalu diaduk dengan
magnetic stirer secara perlahan selama 1 jam. Setelah itu, campuran disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 15 menit dengan suhu 4ºC. Endapan enzim dipisahkan dan
dilarutkan dalam 1 mL bufer fosfat 0.05 M pH 6.5. Aktivitas yang tinggi menunjukan persentase kejenuhan amonium sulfat yang optimum. Jumlah amonium sulfat (gram) yang digunakan untuk melarutkan 1 liter larutan enzim menggunakan rumus dibawah ini dengan S1 merupakan konsentrasi awal amonium sulfat sedangkan S2 merupakan konsentrasi akhir amonium sulfat. Angka 533 menunjukan bahwa untuk membuat larutan jenuh 100% dibutuhkan 533 gram amonium sulfat per liter.
Jumlah amonium sulfat (gram/liter) =
0.3S2
-
100
S1)
-
(S2
533
Aktivitas spesifik yang tinggi menunjukan persentase kejenuhan amonium sulfat yang optimum dan selanjutnya digunakan dalam tahap pemurnian. Sebelum tahap pemurnian selanjutnya dilakukan dialisis dengan membran selofan. Enzim dimasukkan ke dalam membran selofan dan didialisis menggunakan bufer fosfat 0.01 pH 7 selama 24 jam.