Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Penelitian Bioteknologi dan Ilmu Hayat, IPB dari bulan Desember sampai Agustus 2006.
Bahan dan Alat
Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah sponge N6, N20 yang berasal dari perairan Nias dan sponge MT5, MT36 dan MT37 yang berasal dari perairan Lombok. Sampel diperoleh dari koleksi Balai Riset Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan, Departemen Kelautan dan Perikanan RI. Ba han kimia penting yang digunakan adalah NaOCl teknis, HNO3 (Sigma), H2SO4 (Sigma), Aseton (Sigma),
TEOS (Sigma), HF (Sigma), NH4F (Merck), Bovin Serum Albumin/BSA fraction V
(Merck), pereaksi Bradford, pereaksi untuk SDS/PAGE dan pereaksi untuk colorimetric molibdate assay.
Alat utama yang digunakan adalah spektrofotometer UV/Vis double beam
(Hitachi), High Speed Centrifuge CR21G (Hitachi), shaker, tabung dialysis cut-off
10kD (Sigma), mikroskop polarisasi, kamera digital, dan perangkat ektroforesis Mini- Protean III (Bio-Rad), Scannning Electron Microscopy (SEM) JEOL JSM-5310 LV.
Metode Penelitian
Pengumpulan Sampel Sponge (Modifikasi Nurjanah 2006)
Pengumpulan sampel dilakukan oleh tim penyelam dari Departemen Kelautan dan Perikanan. Sponge diambil dari perairan Pulau Nias dan Lombok pada kedalaman 10 m. Selama distribusi ke laboratorium, sponge dibawa dalam keadaan beku.
Isolasi Spikula Silika Sponge (Modifikasi Nurjanah 2006)
Sponge sebanyak 100g dicuci dengan air laut dan dipotong dengan ukuran 1 cm3. Selanjutnya direndam dan digoyang selama 2 jam dalam 200 ml larutan NaOCl
(10%) teknis sampai tidak berwarna. Spikula yang mengendap dicuci dengan aquades 5 kali dan direndam dalam 200 ml 3N HNO3: 3N H2SO4 (1:4) 24 jam. Bagian yang tidak
larut asam (yang mengendap) dibilas dengan aquades sampai pH 6, kemudian dicuci dengan aseton sebanyak dua kali. Pengeringan dilakukan dengan menyimpan spikula silika di dalam refrigerator. Spikula silika yang diperoleh dihitung rendemennya dan diamati dengan mikroskop.
Isolasi Crude Protein Serupa Silicatein (Modifikasi Nurjanah 2006)
Spikula silika sebanyak 2 g dilarutkan dengan 100 ml buffer 2M HF /8M NH4F
(pH 5,0) selama 2 jam pada suhu 4OC. Larutan buffer dihilangkan dengan dialisis menggunakan 4L aquades pada suhu 4oC yang diganti tiap 4 jam sebanyak 9 kali. Dialisat disentrifugasi pada 12000 rpm selama 30 menit pada suhu 4oC. Protein yang mengendap disuspensikan dalam aquades dan disimpan pada suhu 4oC. Protein yang berhasil diisolasi diamati dibawah mikroskop.
Penghitungan Jumlah Agregat Protein Serupa Silicatein dengan Haemocytometer
(Fardiaz 1989).
Penentuan jumlah agregat protein dihitung menggunakan haemocytometer. Metode ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah sel bakteri atau spora kapang dengan pengamatan dibawah mikroskop. Gelas obyek haemocytometer mempunyai garis-garis yang membentuk kotak-kotak. Kotak terbesar mmepunyai ukuran 1 mm2. Kotak 1 mm2 yang terdapat di bagian tengah terbagi menjadi 25 kotak (0.2mm x 0.2mm) yang masing- masing berisi 16 kotak kecil. Jika gelas obyek ini ditutup dengan gelas penutup, kedalaman dibawah gelas penutup adalah 0.1 mm sehingga tinggi sampel menjadi 0.1 mm.
Sampel diteteskan pada sumur haemocytometer hingga penuh, kemudian ditutup dengan gelas penutup. Dilakukan lima kali penghitungan pada tempat yang berbeda, kemudian dibuat rata-rata. Jumlah agregat protein dalam 1 ml dihitung sebagai berikut : Jumlah agregat protein/mm2 = rata-rata jumlah agregat protein/0.04 mm2 x 25
Jumlah agregat protein/mm3 = rata-rata jumlah agregat protein/mm2 x 1/0.1 mm Jumlah agregat protein/ml = rata-rata jumlah agregat protein/mm3 x 1000
Analisa Kadar Protein
Penentuan kadar protein dilakukan dengan menggunakan Metode Bradford (dye- binding method) (Dunn 1989). Protein sebanyak 100 µl yang direaksikan dengan 2 ml Bradford (1:19). Perlakuan pada blanko, larutan enzim diganti dengan aquades. Setelah larutan divorteks, absorbansi diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 565 nm.
Standar protein yang digunakan adalah BSA fraction V. Kurva standar protein BSA dibuat dengan mereaksikan BSA berbagai konsentrasi BSA 20, 40, 60, 80,100.120, 140, 160,180 dan 200 µg/ml dengan pereaksi Bradford, kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 565 nm. Konsentrasi protein larutan protein serupa silicatein ditentukan berdasarkan persamaan garis linier hubungan antara konsentrasi standar protein dengan absorbansi.
Analisa SDS-PAGE (Modifikasi Laemmli 1970)
Analisa SDS-PAGE dilakukan untuk menentukan berat molekul protein. Tahapan kerja dilakukan adalah preparasi gel pemisah dan penahan, preparasi sampel dan loading, running, pewarnaan gel dan pelunturan warna.
Gel pemisah dibuat dari akrilamida 10% dan gel penahan 4%. Preparasi sampel dilakukan dengan mensuspensikan 30µl sampel ke dalam 10 µl larutan buffer sampel. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 95oC selama 3 menit. Tiap sampel diloading ke dalam sumur gel sebanyak 10-15 µl. Sebagai standar digunakan marker Low Moleculer Weight/LMW (Pharmacia) sekitar 5 µl.
Running dilakukan pada tegangan 125 V selama 2 jam dalam buffer
elektroforesis. Pewarnaan gel dilakukan dengan metode Silver Staining untuk melihat protein yang terpisah (Nollan 1996). Setelah elektroforesis gel digoyang dalam la rutan fiksasi selama 1 jam, dilanjutkan dalam larutan ethanol 50% (v/v) selama 20 menit. Kemudian dilanjutkan dalam ethanol 35% (v/v) selama 20 menit (dua kali). Setelah itu digoyang dalam larutan enhancer selama satu menit lalu dicuci dengan akuabidestilata selama 20 detik (tiga kali). Gel lalu digoyang dalam larutan perak nitrat selama 30 menit dan dibilas dengan akuabidestilata selama 20 detik (dua kali). Gel lalu direndam
dalam larutan Na2CO3-formaldehide sehingga pita protein terlihat dan reaksi segera
dihentikan dengan penambahan larutan fiksasi.
Uji Aktivitas Protein Serupa Silicatein (Modifikasi Nurjanah 2006).
Suspensi protein dalam buffer Tris-HCl pH 6,8, sebanyak 250 µl direaksikan dengan 1ml TEOS 13.5 µmol. Selanjutnya digoyang pada suhu 26 oC selama 12 jam. Hasil reaksi disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 25 menit untuk memisahkan produk silika (sebagai endapan). Pelet yang dihasilkan dicuci minimal 3 kali dengan etanol 50% untuk menghilangkan TEOS yang tidak bereaksi. Lalu disentrifugasi kembali dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit. Pelet dilarutkan dalam 1 ml NaOH 1M pada 85-95oC selama 30 menit untuk menghitung jumlah residu TEOS yang terpolimerisasi. Pelarutan dilanjutkan dengan menginkubasi pada suhu kamar selama 48 jam. Penghitungan asam silikat yang dilepaskan dilakukan dengan modifikasi dari colorimetric molibdate assay dengan pelarut Brzezinski dan Nelson yang dapat mendeteksi sampai 50 mM Si(OH)4.
Colorimetric molibdate assay dilakukan dengan cara mereaksikan 1 ml sampel dengan 0,4 ml larutan ammonium molibdat dicampurkan selama 36 jam. Setelah itu ditambahkan 0,6 ml reduction reagent (campuran metol sulfit, H2SO4 50%, asam
oksalat jenuh dan aquades), lalu divorteks. Setelah 3 jam, dilakukan pengukuran dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 810 nm. Sebagai kurva standar digunakan berbagai konsentrasi Si (larutan TEOS dalam DMSO) antara 20-240 µmol/ml.
Studi Kinetika Reaksi Protein Serupa Silicatein Terhadap Substrat TEOS
Karakter kinetika protein silicatein ditentukan berdasarkan aktivitas protein terhadap TEOS pada konsentrasi 6.75, 13.5, 27, 40.5 dan 54 µmol/ml dengan lama reaksi 12 jam. Preparasi substrat dilakukan dengan melakukan pengenceran TEOS menggunakan aquades. Aktivitas diuji dengan colorymetric molybdate assay.
Parameter kinetika yaitu nilai Konstanta Michaelis-Menten (Km), laju
maksimum (Vmax) dan bilangan balik (Kcat) ditentukan dengan membuat transformasi linier dari persamaan Michaelis-Mentenke dalam persamaan Lineweaver-Burk.
Uji inhibitor spesifik serine
Suspensi protein dalam buffer Tris-HCl pH 6.8 sebanyak 250 µl direaksikan dengan 1ml TEOS 13.5 µmol dan larutan 50 µl larutan PMSF 1mM dalam DMSO. Kemudian dishaker pada suhu 26 oC selama 12 jam. Aktivitas diuji dengan colorymetric molybdate assay.
Analisa SEM
Pengamatan menggunakan SEM dilakukan untuk melihat struktur polimer silika yang terbentuk. Sebelum dilakukan pengamatan, sampel dicoating dengan JEOL JFC- 1200 Fine coater. Proses ini dilakukan di laboratorium Material Science, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan, Universitas Indonesia.
reaksi kimia dengan ammonium persulfat sebagai inisiator dan N,N,N’,N’- tetrametilendiamin (TEMED) sebagai katalis. Cross-linking agent yang digunakan adalah N,N’-metilen-bis- akrilamida (bis) (Perbal 1988). Variasi besar pori-pori dapat dilakukan dengan mengubah persentase akrilamida. Konsentrasi akrilamida yang dibutuhkan untuk mencapai kisaran pemisahan tertentu dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Konsentrasi akrilamida yang dibutuhkan untuk mencapai kisaran pemisahan tertentu
% poliakrilamida Kisaran berat molekul
3-5 >100.000
5-12 20.000-150.000
15 10.000-80.000
>15 <150.000 Sumber : Dunn (1989)
SDS (Sodium Dedosil Sulfat) merupakan detergen anionik bahan pendenaturasi protein bila campuran dipanaskan 100oC selama 3 menit. Penggunaan SDS bertujuan untuk memberikan muatan negatif pada protein yang akan dianalisa. Protein yang terdenaturasi sempurna akan mengikat SDS dalam jumlah yang setara dengan berat molekul protein tersebut (Dunn 1989).
Denaturasi protein dilakukan dengan merebus sampel dalam buffer yang mengandung β-merkaptoetanol (berfungsi untuk nereduksi ikatan disulfida), gliserol dan SDS. Muatan asli protein akan digantikan oleh muatan negatif dari anion yang terikat sehingga kompleks protein-SDS memiliki rasio muatan per berat molekul yang konstan. Kerapatan muatan listrik keseluruhan setelah terbentuk kompleks SDS-polipeptida menjadi sama sehingga bisa bergerak dalam gel (dengan porositas yang benar) menurut ukuran molekul (Hames 1987). Gel poliakrilamida akan memberi efek pemisahan berdasarkan perbedaan viskositas kompleks protein-SDS, yang juga meningkat secara eksponensial terhadap panjang rantai atau berat molekul protein (Mihalyi 1992).