Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dan analisis dilakukan mulai bulan Januari 2010 – Juni 2011 di Laboratorium Mikrobiologi Laut Puslit Oseanografi LIPI dan P.T. Charoon Phokpand.
Materi Penelitian
Substrat yang digunakan adalah sampel air laut dan sedimen dari perairan Pulau Pari Teluk Jakarta yang dicampur untuk menggambarkan kondisi alam yang mendekati sebenarnya (untuk tujuan aplikasi). Sebelum dicampur dengan air laut, sampel sedimen yang diambil dari beberapa titik di perairan Pulau Pari Teluk Jakarta dikomposit terlebih dahulu, kemudian didistribusikan ke dalam tabung-tabung dan ditambah dengan air laut dengan perbandingan 1:1. Sampel- sampel tersebut terdiri atas 264 tabung, yaitu 88 x 3 ulangan tabung (Kusuma 2009; Arifah 2010). Pada penelitian ini digunakan 84 tabung (28 x 3 ulangan) yang terdiri atas: 4x3 tabung disterilisasi dan ditambah bakteri RCO/B/08_008, 4x3 tabung disterilisasi dan ditambah konsorsium A (Strain RCO/B/08_006, RCO/B/08_008, dan RCO/B/08_013), 4x3 tabung tidak disterilisasi dan ditambah bakteri RCO/B/08_008, 4 tabung tidak disterilisasi dan ditambah konsorsium A, 8x3 tabung tidak disterilisasi dan tidak ditambah bakteri, serta 4x3 tabung disterilisasi tanpa ditambah bakteri. Substrat dalam tabung-tabung tersebut diinkubasikan selama 0, 7, 14 dan 28 hari. Setelah masa inkubasi masing- masing, substrat dalam tabung disimpan pada suhu -80oC. Matrik perlakuan sampel yang dianalisis dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2 Matrik sampel yang dianalisis komunitas bakterinya
Substrat RCO/B/08_ 008 Konsorsium A Tanpa inokulum-1 Tanpa inokulum-2 Tidak disterilisasi 0 7 14 28 0 7 14 28 0 7 14 28 0 7 14 28 Disterilisasi 0 7 14 28 0 7 14 28 0 7 14 28
Keterangan: Penambahan konsorsium A terdiri atas strain RCO/B/08_006, RCO/B/08_008, dan RCO/B/08_013; Perlakuan tanpa penambahan bakteri dilakukan dua ulangan; Pengambilan sampel dilakukan pada hari ke-0, 7, 14 dan 28; masing-masing tabung dilakukan 3 kali ulangan
Strain bakteri yang digunakan di dalam penelitian ini yaitu RCO/B/08_006, RCO/B/08_008, RCO/B/08_009, RCO/B/08_013 adalah koleksi Laboratorium Mikrobiologi Laut Puslit Oseanografi LIPI. Masing-masing strain memiliki tingkat kesejajaran 99% atau lebih dengan Pseudomonas balearica, Alcanivorax sp. TE9, Bacillus sp. L41 dan Bordetella sp F2 (Tabel 3). Bahan yang digunakan untuk isolasi DNA adalah ISOIL Bead-beating DNA Extraction Kit dan Applied Biosystems Prepman Ultra Sample Preparation Reagent. Bahan yang digunakan untuk PCR dan elektroforesis meliputi HotstarTag PCR Mix (QIAGEN), Primer 341F (5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’), Primer 907R (5’- CCGTCAATTCMTTTGAGTT T-3’), Primer 341F-GC (40pb GC clamp 5’- CCTACGGGAGGCAGCAG-3’), MilliQ PCR grade, Etanol 70%, QIAquick PCR purification kit (QIAGEN), Urea, Formamida, Akrilamida/bis-akrilamida, Ammonium Persulphate (APS), TEMED, Agarosa, Akuades, TAE Buffer 1x, Dye- solution, Gel-loading solution, Etidium Bromida, Etanol 90%, air murni.
Tabel 3 Strain bakteri koleksi Laboratorium Mikrobiologi Laut Puslit Oseanografi LIPI yang digunakan dalam penelitian
No. Kode Isolat Kesejajaran dengan Gen Bank NCBI 1. RCO/B/08_006* AM905859.1 Pseudomonas balearica st101 (99%) 2. RCO/B/08_008* AB055207.1 Alcanivorax sp. TE-9 (100%)
3. RCO/B/08_009* DQ249996.1 Bacillus sp. L41 (99%) 4. RCO/B/08_013* DQ453689.1 Bordetella sp. F2 (99%)
Keterangan : * adalah isolat koleksi Laboratorium Mikrobiologi Laut Puslit Oseanografi LIPI (Hatmanti dan Darmayati 2009) yang digunakan sebagai perlakuan dalam penelitian Kusuma (2009) dan Arifah (2010)
Metode Penelitian
Sampel
Ekstraksi DNA (ISOIL beads beating)
PCR dengan primer GC clamp
DGGE
Isolasi DNA dari poliakrilamid gel
Sekuensing
Analisis Sekuensing
Analisis Sampel
Komunitas mikroba dilihat secara kualitatif dengan menggunakan metode Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE). Metode ini diawali dengan isolasi asam nukleat sampel (Rosello-Mora et al. 1999), yang kemudian digunakan sebagai sampel untuk analisis DGGE (Muyzer et al. 1993, 1996). Urutan kerja analisis sampel adalah sebagai berikut :
Isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan metode bead beating, yaitu penggunaan beads (manik-manik) untuk melisiskan sel bakteri yang menempel pada permukaan minyak. Sebanyak 1 ml sampel disentrifuse pada kecepatan lambat dan suhu dingin untuk mengumpulkan biomassa selnya. Supernatan dibuang dan pada pellet ditambahkan campuran 50 mg Skim Milk, 10 μl Triton X dan 950 μl Lysis Solution BB dan dicampur pelan dengan menggunakan vortex. Campuran diinkubasi pada suhu 65 oC selama 5 menit, kemudian dikocok pada kecepatan 3.000 rpm selama 5 menit (300 detik) dengan Beads Cells Disrupter. Campuran kemudian diinkubasi kembali pada suhu 65 oC selama 30 menit, dan dibolak-balik 10 kali setiap 10 menit. Tahap ini dilakukan sebanyak dua kali. Tabung disentrifuse pada 12.000 x g selama 1 menit pada suhu ruangan. Sebanyak 600 μl supernatan ditransfer ke tabung baru, kemudian ditambahkan 400 μl “Purification Solution” dan dihomogenkan dengan pengocokan. Pada campuran ditambahkan 600 μl “Chloroform”, dan divortex selama 15 detik, kemudian disentrifuse pada 12.000 x g selama 15 menit pada suhu kamar. Sebanyak 800 μl supernatant bagian atas (tidak di bagian tengah) diambil dan dipindahkan ke tabung baru serta ditambahkan 800 μl “Precipitation Solution”. Larutan disentrifuse pada 20.000 x g selama 20 menit pada 4 oC, supernatan dibuang, dan pada pelet ditambahkan 1 ml “Wash Solution”. Larutan disentrifuse lagi pada 20.000 x g selama 10 menit pada 4o C, supernatan dibuang pelan- pelan. Sebanyak 1 ml 70% etanol dan 2 μl Ethacinmate ditambahkan pada pelet dan disentrifuse 20.000 x g selama 5 menit pada suhu 4 oC kemudian supernatan dibuang dan pelet dikeringkan dengan meletakkannya terbalik pada tissue di dalam laminair airflow. Pelet dilarutkan dalam 30 μl TE, kemudian disimpan pada suhu -20 oC atau segera dianalisis lebih lanjut.
PCR untuk DGGE
PCR untuk DGGE dilakukan menggunakan primer dengan GC clamp (341F-GC) dan 907R. Kondisi PCR yang dilakukan sebagai berikut aktivasi dilakukan selama 5 menit pada 95oC, diikuti dengan 30 siklus yang terdiri dari : melting selama 30 detik pada 94oC, annealing selama 1 menit pada 55oC dan ekstensi selama 1 menit pada 72 oC, diikuti dengan 10 menit final ekstensi pada 72 oC, dan pendinginan selama 5 menit pada suhu 4oC (modifikasi dari Muyzer et al. 1993, 1996). Produk PCR kemudian dicek dalam 1,5% gel agarose.
DGGE
DGGE dilakukan dengan menggunakan alat Dcode™ Universal Mutation Detection System BioRad dengan gel berukuran 16 x 16 cm dan ketebalan 1,0 mm. DGGE dilakukan dalam 7 liter 1 x larutan TAE buffer (20 mM Tris acetat, 0,5 mM EDTA, pH 8,0) pada suhu 60 oC selama 210 menit pada voltase 200 Volt. Gradien yang digunakan berkisar antara 35% - 65% denaturant (100% denaturant yang terdiri dari 7 M urea ditambah 40 % vol/vol formamide). Gel diwarnai menggunakan Etidium Bromida (0,5 mg/L) selama 30-45 menit dan dibilas dalam 1 x TAE buffer selama 15 menit pada suhu kamar. Gel kemudian difoto menggunakan Gel-Doc UV Transluminator.
Ekstraksi DNA dari Gel Polyacrilamide dan Analisis Sekuen
Pada pita yang ditargetkan, pemotongan dilakukan menggunakan pisau/cutter yang telah disterilisasi menggunakan alkohol 70%. Pita yang telah dipotong direndam dalam 30 μl akuades untuk PCR selama semalam pada suhu 4 oC. Sebanyak 2 μl cairan elusi DNA diambil dan digunakan sebagai cetakan dalam PCR untuk sekuensing. Produk PCR kemudian dielektroforesis pada 1,5% gel agarose dan dipurifikasi lebih lanjut menggunakan Gene-Clean Kit (Bio 101). DNA kemudian disekuensing menggunakan Sekuenser ABI Prisma 373. Sekuen yang diperoleh kemudian dianalisis lebih lanjut menggunakan fasilitas BLAST dari NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
Analisis Sekuen Nukleotida
Database 16S rDNA yang diperoleh dari penelitian ini dideterminasi menggunakan BLAST program dan database GenBank. Teknik profil alignment (penyejajaran) ClustalX versi 1.7 digunakan untuk mensejajarkan sekuen.