Lingkungan, baik air, tanah maupun udara diyakini mengandung mikroorganisme yang beragam. Menurut Nakatsu (2007), keragaman mikrobiologi yang tertinggi di planet bumi terdapat pada tanah. Pemahaman mengenai keragaman mikrobiologi mencakup pengetahuan tentang ekologi mikroba dan struktur komunitasnya. Jumlah spesies di dalam sesuatu komunitas (spesies richness) dan ukuran populasi spesies di dalam suatu komunitas (spesies evenness) merupakan parameter penting dalam menentukan struktur dan keanekaragaman dalam suatu komunitas (Liu et al. 1997).
Studi mengenai keragaman bakteri dan dinamika komunitas bakteri berkembang pesat dalam ekologi mikroba, dipercepat dengan kemajuan dalam teknik-teknik molekuler. Analisis komunitas bakteri yang berperan dalam aktivitas biodegradasi hidrokarbon in situ menggunakan pendekatan molekuler merupakan suatu tantangan, karena hampir sebagian besar (>90 – 99%) spesies bakteri yang berkompeten dalam komunitas pendegradasi hidrokarbon tidak dapat ditumbuhkan dalam substrat artifisial (Wilkinson 1988). Metode molekuler yang dapat digunakan dalam analisis komunitas bakteri diantaranya adalah DGGE. Metode ini menggunakan molekul 16S rDNA yang dibawa oleh semua bakteri, dengan sekuen yang merupakan marker molekuler untuk identifikasi spesies (Macnaughton et al. 1999). Metode ini pada awalnya digunakan untuk menampilkan profil populasi mikroba dari sampel alam oleh Muyzer et al. (1993).
Struktur komunitas bakteri indigenous pada lingkungan tercemar minyak di perairan Pulau Pari Teluk Jakarta
Berdasarkan pita-pita pada profil DGGE (Gambar 2), diketahui bahwa bakteri indigenous secara alami telah terdapat pada substrat tercemar minyak dari Pulau Pari Teluk Jakarta. Hal ini dapat dilihat pada substrat yang tidak steril- 1 dan 2. Pada substrat tidak steril-1 pada hari ke-0 terdapat uncultured bacterium clone VH-FL6-50 (100%) dan uncultured bacterium clone W1-16 (92%), dan kedua bakteri ini bertahan dalam substrat sampai hari ke-28. Uncultured bacterium clone VH-FL6-50 adalah bakteri laut yang ditemukan menempel pada partikel dan dapat hidup bebas pada perairan di pelabuhan Victoria Hongkong China (Zhang et al. 2007). Bakteri ini ditemukan pula di lingkungan perairan Pulau Pari, dalam kondisi yang sama yaitu perairan tercemar
minyak. Uncultured bacterium clone W1-16 ditemukan di sedimen dan air perairan Northern Yellow Sea, Korea (Zhao 2008), namun karena yang ditemukan di perairan Pulau Pari hanya mempunyai keidentikan 92% maka diduga merupakan spesies yang berbeda. Hagstrom et al. (2002) mengusulkan untuk mengelompokkan bakteri yang mempunyai keidentikan sekuen 16S rDNA minimal 97% ke dalam spesies yang sama, sehingga bila nilai keidentikannya di bawah 97% dapat diduga merupakan spesies yang baru. Namun dugaan ini harus diuji kebenarannya menggunakan metode identifikasi morfologi dan biokimia. Dalam penelitian ini tidak dilakukan identifikasi berdasarkan uji-uji tersebut.
Gambar 2 Profil DGGE pada proses bioremediasi secara alamiah dalam substrat tidak steril dan substrat steril tanpa penambahan bakteri (tunggal atau konsorsium), bakteri kontrol: Pb: RCO/B/08_006 (Pseudomonas balearica st101 99%)), Br: RCO/B/08_013 (Bordetella sp. F2 99%), Al: RCO/B/08_008 (Alcanivorax sp. TE-9 100%) Bc: RCO/B/08_009 (Bacillus sp. L41 99%); Pita yang terdeteksi: a: Marine bacterium SCRIPP 413 (98%), b: Uncultured bacterium clone VH-FL6-50 (100%), c: Pseudomonas sp. clone HY2 (98%), d: Uncultured bacterium clone W1-16 (92%), e: Uncultured bacterium Uday 0-58 (100%), f: Iron-reducing bacterium clone HN17 (98%), g: Uncultured bacteria clone N704B_48 (99%) dan h: Alteromonas sp. MOLA 3 (98%)
Pada substrat tidak steril-1 hari ketujuh diperoleh pita dari marine bacterium SCRIPP 413 (98%). Marine bacterium SCRIPP 413 merupakan bakteri yang ditemukan oleh Hold et al. (2001) menempel pada dinoflagelata toksin dan nontoksin. Beberapa spesies marine bacterium dilaporkan dapat menghasilkan
Bakteri Kontrol Substrat tidak steril-2 tanpa inokulum Substrat tidak steril-1
tanpa inokulum Substrat steril tanpa inokulum Pb Br Al Bc 0 7 14 28 0 7 14 28 0 7 14 28 hari
a
b
c
d
e
f
g
f
g
h
hydroxy-acid siderophore yang dapat mereduksi besi dalam degradasi minyak (Barbaeu et al. 2002). Diduga marine bacterium SCRIPP 413 (98%), uncultured bacterium clone VH-FL6-50 (100%) dan uncultured bacterium clone W1-16 (92%) merupakan bakteri indigenous yang dominan pada lingkungan perairan Pulau Pari yang tercemar minyak. Dominansi ini tidak dapat dihubungkan dengan peranan bakteri dalam degradasi minyak pada substrat yang tercemar minyak. Hal ini karena primer yang digunakan adalah sekuen fragmen 16S rDNA yang merupakan primer universal untuk kelompok bakteri. Bakteri-bakteri tersebut terdapat melimpah di dalam substrat mungkin juga karena kehadiran sumber karbon atau pencemar lain untuk metabolisme selnya. Untuk mengetahui kemampuannya dalam mendegradasi minyak perlu dilakukan analisis lanjutan DGGE, misalnya dengan melakukan hibridisasi gel DGGE menggunakan probe spesifik gen fungsional seperti gen alkB, yaitu gen penyandi enzim alkana monooksigenase. Alkana monooksigenase merupakan enzim yang berperan dalam jalur degradasi senyawa alkana (Whyte et al. 2002). Penggunaan probe tersebut dapat mengkonfirmasi keberadaan bakteri pendegradasi alkana di dalam substrat.
Meskipun kehadiran bakteri indigenous pendegradasi hidrokarbon tidak dapat dipastikan di dalam substrat tidak steril-1, namun menurut Kusuma (2009) terjadi penurunan konsentrasi cemaran minyak dari 9,5 mg/20 ml menjadi 5,3 mg/20 ml atau sebesar 4,2 mg/20 ml (44% b/b) selama 28 hari. Penurunan ini menurut Nugroho (2006) terjadi karena di dalam substrat tercemar minyak mentah telah terdapat bakteri tertentu. Penurunan konsentrasi minyak ini berlangsung cepat sampai hari ke-14 di mana terdapat pertambahan jumlah total biomassa sel bakteri. Peningkatan jumlah bakteri ini dimungkinkan karena bertambahnya jumlah sel bakteri yang dapat memetabolisme komponen- komponen minyak, sehingga menyebabkan peningkatan jumlah sel. Peningkatan jumlah sel ini menyebabkan pita bakteri yang awalnya tidak terlihat menjadi terdeteksi di dalam gel poliakrilamida. Hal ini dibuktikan dengan diperolehnya empat pita yang berbeda pada profil DGGE pada substrat tidak steril-1 (Gambar 2). Gambar 3 menunjukkan bahwa proses penurunan konsentrasi minyak melambat mulai hari ke-14 sampai ke-28, seiring dengan menurunnya jumlah total biomassa bakteri. Hal ini terjadi karena ketersediaan sumber karbon yang dapat digunakan oleh bakteri semakin rendah. Kondisi ini menunjukkan bahwa konsentrasi cemaran minyak pada substrat yang tercemar minyak dapat
menurun secara alami tanpa perlakuan apapun. Penguraian minyak secara alami dilakukan oleh bakteri indigenous yang terdapat di dalam substrat.
Gambar 3 Hubungan antara total biomassa sel dengan penurunan konsentrasi minyak dalam substrat tidak steril tanpa penambahan strain RCO/B/08_008 (Kusuma 2009). : total sel; : berat minyak Penurunan konsentrasi cemaran minyak pada substrat tidak steril-2 yaitu sebesar 56% (berat/berat) selama 28 hari. Menurut Arifah (2010) hal ini menunjukkan bahwa secara alami bakteri pendegradasi hidrokarbon sudah ada di alam dan memiliki kemampuan yang cukup besar untuk menurunkan konsentrasi minyak mentah dari konsentrasi minyak awalnya. Bakteri hidrokarbonoklastik yang terdapat pada substrat tidak steril muncul ketika ada cemaran minyak yang terpenetrasi dalam sedimen dan air laut, sehingga walaupun tanpa dilakukan penambahan bakteri hidrokarbonoklastik eksogenous pun dalam substrat tetap terjadi aktivitas degradasi hidrokarbon. Hal ini dapat dilihat pada profil DGGE lajur substrat tidak steril-2 tanpa penambahan inokulum (Gambar 2). Perbedaan profil DGGE maupun persentase penurunan konsentrasi minyak pada substrat tidak steril-1 dan 2 terjadi karena kedua substrat tersebut disiapkan dalam waktu yang berbeda, walaupun menggunakan teknik pencampuran yang sama dan konsisten. Muyzer dan Smalla (1998) menyatakan bahwa DGGE dapat digunakan untuk memonitor perbedaan teknik penyimpanan dan penyiapan materi yang dilakukan.
Seperti halnya pada substrat tidak steril-1, bakteri indigenous yang terdeteksi pada profil DGGE pada substrat tidak steril-2 pun tidak semuanya dapat diasumsikan sebagai bakteri yang ikut serta dalam proses degradasi minyak. Untuk mengetahui peranan bakteri-bakteri tersebut, maka perlu dilakukan analisis DGGE lebih lanjut dengan menggunakan probe-probe spesifik gen penyandi enzim pada bakteri pendegradasi hidrokarbon, misalnya monooksigenase dan dioksigenase (Luz et al. 2004).
Pada profil DGGE substrat tidak steril-2 hari ke-0 diperoleh pita marine bacterium SCRIPP 413 (98%), uncultured bacterium clone VH-FL6-50 (100%) dan Pseudomonas sp. clone HY2 (100%). Marine bacterium SCRIPP 413 (98%) dan uncultured bacterium clone VH-FL6-50 (100%) merupakan bakteri indigenous yang sama seperti terdeteksi pada medium tidak steril-1. Pseudomonas sp. clone HY2 (100%) diperkirakan juga merupakan bakteri indigenous di perairan Pulau Pari Teluk Jakarta. Pseudomonas sp. clone HY2 merupakan bakteri yang mampu mengoksidasi hidrokarbon di Victoria Land coast Antartika (Lo dan Michaud 2010). Pseudomonas sp. banyak dilaporkan merupakan bakteri yang mampu memetabolisme berbagai jenis hidrokarbon, yaitu alifatik dan aromatik (Whyte et al. 1997; Darmayati 2009; Hatmanti dan Darmayati 2009). Struktur komunitas bakteri pada hari ketujuh dalam substrat tidak steril-2 berubah, marine bacterium SCRIPP 413 (98%) dan uncultured bacterium clone VH-FL6-50 (100%) masih tetap bertahan, namun Pseudomonas sp. clone HY2 (100%) tidak ditemukan, digantikan oleh keberadaan iron-reducing bacterium clone HN17 (98%) dan uncultured bacteria clone N704B_48 (99%). Iron-reducing bacterium clone HN17 merupakan bakteri pereduksi Fe3+ di ladang padi terkontaminasi arsen di daerah Hunan, Cina. Keberadaan bakteri ini pada lingkungan tercemar minyak dimungkinkan karena bakteri pereduksi besi berperan dalam biodegradasi hidrokarbon (Holba et al. 2004). Uncultured bacteria clone N704B_48 ditemukan di Laut Cina Selatan. Keberadaan bakteri ini dalam hubungannya dengan degradasi minyak belum banyak dilaporkan. Pada substrat tidak steril-2 hari ke-14 sampai hari ke- 28 hanya ditemukan uncultured bacterium clone VH-FL6-50 (100%). Menurut Muyzer et al. (1993) dan Stephen et al. (1999), aplikasi PCR-DGGE hanya dapat mendeteksi 1 - 2 % dari mikroorganisme yang mewakili grup target, sedangkan Macnaughton et al. (1999) menyatakan bahwa metode DGGE tidak dapat digunakan untuk
mendeteksi komponen komunitas minor yang mungkin penting dalam degradasi kelas hidrokarbon spesifik.
Komunitas bakteri pada substrat steril tanpa penambahan bakteri tunggal maupun konsorsium A, menunjukkan terdapatnya pita iron-reducing bacterium clone HN17 (98%) dan uncultured bacteria clone N704B_48 (99%) yang konsisten sejak hari ke-0 sampai hari ke-28. Alteromonas sp. MOLA 3 (98%) ditemukan pada hari ke-14 sampai ke-28. Alteromonas sp. MOLA 3 merupakan bakteri yang ditemukan dalam penelitian mengenai komunitas bakteri di ekosistem pantai Mediterranian. Keberadaan bakteri ini dalam substrat steril diperkirakan berhubungan dengan kemampuannya mendegradasi senyawa phenanthrene (Zaidi dan Imam 1999). Pita-pita DNA yang terdapat pada profil DGGE (Gambar 2) merupakan bakteri indigenous yang terdapat pada substrat dari perairan Pulau Pari Teluk Jakarta yang tercemar minyak. Komunitas bakteri indigenous di perairan Pulau Pari Teluk Jakarta yang terdeteksi sampai dengan hari ke-28 dirangkum di dalam Tabel 4.
Perubahan struktur komunitas bakteri pada substrat dengan penambahan bakteri eksogenous (tunggal dan konsorsium)
Gambar 4 menunjukkan suksesi struktur komunitas bakteri selama proses bioaugmentasi. Bioaugmentasi adalah penambahan bakteri baik secara tunggal maupun konsorsium pada suatu substrat yang tercemar. Bakteri yang diintroduksikan biasanya bakteri yang telah diuji kemampuannya dalam mendegradasi bahan pencemar. Penambahan bakteri eksogenous pada substrat yang mengandung bakteri indigenous (substrat tidak steril) dapat dilihat pada lajur 5 - 12, sedangkan penambahan bakteri eksogenous pada substrat yang tidak mengandung bakteri indigenous (substrat steril) terdapat pada lajur 13 – 20 (Gambar 4).