Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan pada bulan Januari – Maret 2009.
Hewan Uji
Hewan uji adalah juvenil udang vaname yang diperoleh dari fasilitas pembesaran udang vaname di areal pertambakan Bakauheni, Lampung Selatan.Udang yang dikumpulkan dimasukkan dalam kotak styrofoam yang dilengkapi aerator baterei kemudian diangkut ke Laboratorium Kesehatan Ikan Institut Pertanian Bogor menggunakan mobil.
Nukleotida
Nukleotida yang digunakan adalah nukleotida murni (Sigma-Aldrich) yang terdiri atas adenosine monophosphate (AMP), guanosine monophosphate (GMP), cytidine monophosphate (CMP), uridinemonophosphate (UMP), dan inosinemonophosphate (IMP).
Persiapan Pakan Uji
Sebelum dicampurkan ke dalam pakan, kelima jenis nukleotida dalam jumlah yang sama (1:1:1:1:1) dicampur terlebih dahulu secara merata. Selanjutnya campuran nukleotida ditimbang sesuai dosis yang dibutuhkan (perlakuan), dilarutkan dalam sedikit air, dan dicampurkan ke dalam pakan komersilsecara merata. Pakan kemudian dikering-anginkan dalam temperatur ruang. Setelah kering, putih telur (sebagai coater) dicampurkan secara merata ke dalam campuran pakan-nukleotida, dan dikering-anginkan kembali. Pelet selanjutnya dimasukkan dalam kantong plastik kemudian disimpan dalam lemari pendingin sampai saat akan digunakan. Pakan pelet komersil yang digunakan
memiliki komposisi: protein 38%, lemak 6%, serat kasar 3%, abu 13% dan kadar air 11%.
Sebelum pakan yang telah ditambahkan nukleotida ini digunakan dalam percobaan maka dilakukan uji ketahanan dalam air (water stability). Uji ini dilakukan dengan cara memasukkan 5 g pakan ke dalam sebuah kotak berukuran 10x10x10 cm. Rangka kotak terbuat dari kawat sedangkan dindingnya berupa kain saring berdiameter 0.5 mm. Pakan yang telah ditambahkan nukleotida dimasukkan ke dalam kotak, kemudian kotak dimasukkan dalam akuarium dalam posisi menggantung dekat dasar. Akuarium berisi 50 l air, diberi aerasi dan menggunakan resirkulasi air sehingga kotak akan bergerak-gerak mengikuti gerakan air. Kondisi ini dibuat sama seperti pada akuarium percobaan. Setelah 3 jam, kotak dikeluarkan, pakan sisa dikeringkan pada 60o
Rancangan Percobaan
C selama 4 jam, kemudian ditimbang. Water stability(Ketahanan dalam air) merupakan ratio antara berat kering pakan sisa setelah direndam dalam air dalam waktu tertentu dan berat kering pakan sebelum direndam di kali 100%. Water stability yang diperoleh adalah 77.4% (3096 g/4 g x 100).
Penelitian dikerjakan dengan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan enam perlakuan dimana masing-masing perlakuan memiliki 3 ulangan. Penempatan perlakuan ke dalam unit-unit percobaan dilakukan secara acak. Perlakuan yang digunakan adalah sebagai berikut:
A: Nukleotida 0 mg.kg-1 B:
pakan (pakan standar) Nukleotida 100 mg.kg-1 C: pakan Nukleotida 200 mg.kg-1 D: pakan Nukleotida 300 mg.kg-1 E: pakan Nukleotida 400 mg.kg-1 F: pakan Nukleotida 500 mg.kg-1 pakan
Prosedur Penelitian dan Pengambilan Data
Juvenil udang vaname sebanyak 270 ekor dipelihara selama dua minggu dalam bak fiberglas berkapasitas 1000 l yang dilengkapi dengan aerator untuk proses aklimatisasi. Selama periode aklimatisasi, udang diberi pakan standar sebanyak 3%/bb/hari dan diberikan tiga kali sehari yakni pada pukul 09.00, 13.00, dan 17.00. Kualitas air dipertahankan stabil dan penggantian air dilakukan setiap 3-4 hari sekali.
Selanjutnya udang (berat rata-rata 6.0±0.5 g) didistribusikan ke dalam 18 unit akuarium percobaan masing-masing berukuran 60x30x30 cm. Setiap akuarium berisi 50 l air dengan 15 ekor udang, dilengkapi dengan aerasi dengan
airlift system serta menggunakan sistem resirkulasi air. Kualitas air media
pemeliharaan adalah temperatur air 28-29o
Pakan perlakuan diberikan selama 4 minggu berturut-turut dengan tingkat pemberian 3%/bb/hari dan frekuensi pemberian 3 kali sehari yakni pukul 09.00, 13.00, dan 17.00. Selama masa percobaan, kualitas air dimonitor setiap hari untuk menjamin agar kondisi lingkungan tetap stabil. Kotoran dan sisa pakan yang terakumulasi dalam akuarium dikeluarkan melalui penyiponan.
C, Salinitas 24-26 ppt, Oksigen 4.5– 4.7 mg/L, pH 7.4-7.5.
Pengambilan sampel hemolim untuk pengukuran parameter imunitas udang dilakukan seminggu sekali sampai akhir periode pemberian nukleotida. Pengambilan hemolim dikerjakan berdasarkan prosedur Liu & Chen(2004). Secara singkat, sekitar 0.1 mlhemolim diambil dari ventral sinus pada pangkal ruas tubuh pertama dengan menggunakan alat suntik 1-ml setelah sebelumnya dimasukkan 0.1 ml antikoagulan(30 mM trisodium citrate, 0.34 M sodium chloride, 10 mM EDTA, pH 7.5). Selanjutnya tambahkan antikoagulan sehingga perbandingan hemolim : antikoagulan menjadi 1 : 9.
Parameter Imun
Parameter imun udang yang diukur terdiri atas total hemocyte count (THC, sel.mL-1), dan aktivitas phenoloxidase (PO). Prosedur pengukuran parameter imun sebagai berikut:
Penghitungan THC
Sebanyak 50 µlcampuran hemolim-antikoagulan dimasukkan dalam neutral buffered formalin (10%) selama 30 menit. Selanjutnya, THC dihitung dengan menggunakan hemasitometer di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 40x.
AktivitasPhenoloxidase (PO)
Aktivitas PO hemosit diukur berdasarkan formasi dopachrome yang dihasilkan oleh L-DOPA. Pengukuran aktivitas PO dikerjakan berdasarkan prosedur yang dikemukakan oleh Liu & Chen (2004). Pertama-tama, 1 ml campuran hemolim-antikoagulan disentrifuse pada 700 g selama 20 menit pada temperatur 4o
Aliquot sebanyak 100 µl diinkubasi dengan 50 µl tripsin (1 mg.ml C. Supernatan dikeluarkan dan pelet disuspensikan kembali secara perlahan-lahan ke dalam larutan cacodylate-citrate buffer (0.01 M sodium cacodylate, 0.45 M sodium chloride, 0.10 M trisodium citrate, pH 7) dan disentrifuse kembali. Pelet kemudian diambil dan disuspensikan dalam 200 µl cacodylate buffer (0.01 M sodium cacodylate, 0.45 M sodium chloride, 0.01 M calsium chloride, 0.26 M magnesium chloride, pH 7).
-1 cacodylate buffer) sebagai aktivator selama 10 menit pada temperatur 25-26oC. Selanjutnya tambahkan 50 µl L-DOPA (3 mg.ml-1
Larutan standar mengandung 100 µl suspensi hemosit, 50 µl cacodylate buffer (pengganti tripsin), dan 50 µl L-DOPA digunakan untuk mengukur background aktivitas PO pada semua larutan uji. Densitas optikal (OD) dari aktivitas PO
cacodylate buffer), setelah 5 menit, tambahkan 800 µl cacodylate buffer.Densitas optikal (OD) 490 nm diukur dengan menggunakan Spectrophotometer.
pada
Resistensi
semua kondisi uji dinyatakan sebagai formasi dopachrome dalam 50 µl hemolim.
Uji-tantang dilakukan pada akhir periode pemberian pakan perlakuan. Sebelum dilakukan uji-tantang, aerator dan resirkulasi air dimatikan terlebih
dahulu selama kurang lebih 30 menit, kemudian semua udang (8 ekor/akuarium) diuji tantang melalui injeksi intramuskular 0.1 ml larutan bakteri Vibrio harveyi 1x106cfu.udang-1
SR (%) = Nt/No x 100
pada bagian punggung ruas badan ke 3. Setelah disuntik, udang dimasukkan kembali ke dalam akuarium. Selama periode uji-tantang, resirkulasi air dimatikan. Udang diberi pakan standar 3%/bb/hari dan diberikan tiga kali sehari yakni pukul 09.00, 13.00, dan 17.00. Kualitas air dimonitor agar berada dalam kondisi stabil, kotoran dan sisa pakan dikeluarkan melalui penyiponan, dan air yang terbuang diganti dengan air yang baru. Udang mati dikeluarkan setiap hari dan jaringan udang diambil untuk isolasi bakteri guna mengkonfirmasi bahwa penyebab kematian adalah V. harveyi. Pengamatan mortalitas dilakukan setiap hari selama 14 hari setelah uji tantang. Parameter yang diukur untuk penentuan resistensi udang adalah tingkat sintasan (SR) yang dicapai sampai pada akhir periode pengamatan. Tingkat sintasan dihitung dengan formula berikut:
Dimana: SR = Sintasan
Nt = jumlah udang hidup pada waktu t No = jumlah udang hidup waktu tebar
Pertumbuhan
Pertumbuhan udang diukur setiap dua minggu sekali yakni pada hari ke 14 dan 28.Pertumbuhan udang dinyatakan sebagai selisih antara berat udang yang diukur pada akhir percobaan dengan berat udang pada awal percobaan:
G = Wt – Wo dimana: G= pertumbuhan (g)
Wt = berat udang pada waktu t (g);
Wo = berat udang pada awal percobaan (g)
Analisis Data
Data hasil pengukuran dinyatakan dalam nilai rata-rata±Sdv. Evaluasi perbedaan respon imun udang (THC,aktivitasPO), resistensi dan pertumbuhan akibat pemberian perlakuan nukleotida dilakukan melalui analisis ragam. Apabila
terdapat perbedaan antar nilai-rata-rata perlakuan maka analisis data dilanjutkan dengan Uji Wilayah Berganda Duncan dengan menggunakan program SPSS 17 untuk windows. Namun apabila tidak terdapat perbedaan pengaruh antar perlakuan maka analisis hanya dilakukan secara deskriptif dengan menggunakan angka mutlak.