Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari hingga Juli 2012. Perbanyakan bakteri dilakukan di Laboratorium Bakteriologi, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Darmaga Bogor.
Coating dikerjakan di PT. East West Seed Indonesia, Purwakarta. Penyimpanan
dan pengujian benih dilaksanakan di Laboratorium Ilmu dan Teknologi Benih, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Dramaga Bogor.
Bahan dan Alat
Benih padi hibrida yang digunakan dalam penelitian ini adalah varietas DG-1 (tanggal panen 16 September 2011), SL-8 (tanggal panen 26-27 September 2011), dan Intani-2 (tanggal panen 02 November 2011). Biakan murni bakteri
P. fluorescens (RH-4003) diperoleh dari rhizosfer perakaran tanaman tomat yang
dilakukan oleh Tjahjono et al. (2003). Media King’s B untuk peremajaan bakteri dan polimer sintetik sebagai perekat, asam askorbat 350 ppm, aquades, alkohol 70%, kertas label, plastik bening dan kertas merang untuk media perkecambahan. Alat yang digunakan yaitu cawan petri, cawan porselen, pinset, bunsen,
hand sprayer, tabung erlenmeyer, tabung reaksi, rak tabung, autoklaf, mikropipet,
laminar air flow, rotary coater, timbangan analitik, oven, desikator, alat pengepres
kertas, alat pengecambah benih (APB) IPB 73-2 A/B, gelas ukur, spatula, blender dan alat tulis.
Metode
Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini ialah Rancangan Petak Tersarang. Petak utama adalah periode simpan yang terdiri dari enam taraf yaitu:
P0 = 0 minggu P3 = 9 minggu P1 = 3 minggu P4 = 12 minggu P2 = 6 minggu P5 = 15 minggu
Faktor kedua, formula coating sebagai anak petak terdiri dari tiga taraf, yaitu :
C0 = kontrol (tanpa coating)
C1 = Polimer + isolat P. fluorescens RH-4003 C2 = Polimer + asam askorbat 350 ppm
Penelitian ini menggunakan 3 ulangan, sehingga didapatkan kombinasi 54 satuan percobaan. Penelitian menggunakan rancangan percobaan yang sama dilakukan secara terpisah pada 3 varietas padi hibrida sehingga secara keseluruhan terdapat 162 unit satuan percobaan.
Berikut merupakan model rancangan dalam penelitian ini : Yijk = μ + τi + (ατ)ij + βk + (τβ)ik + εijk Dimana:
Yijk = respon pengamatan faktor 1 perlakuan ke-i, faktor 2 perlakuan ke- j, ulangan ke-k
μ = nilai rataan umum
τi = petak utama perlakuan ke-i
(ατ)ij = ulangan tersarang dalam penyimpanan
Βk = komposisi coating isolat P. fluorescens perlakuan ke-j
(τβ)ik = interaksi penyimpanan dengan komposisi coating isolat P. fluorescens
εijk = pengaruh galat penelitian (experimental error)
Data hasil penelitian dianalisis menggunakan analisis ragam (uji F) dan uji lanjut Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada taraf nyata 5 %.
Pelaksanaan
Persiapan formula coating bakteri P. fluorescens dan asam askorbat
Peremajaan isolat bakteri P. fluorescens RH-4003 dilakukan pada media padat King’s B secara aseptik, kemudian diinkubasi pada suhu ruang (270C - 280C) selama 48 jam untuk mendapatkan koloni tunggal. Koloni tunggal hasil peremajaan kemudian digores penuh pada cawan petri steril baru yang telah berisi media padat King’s B, kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu ruang.
Setelah 48 jam bakteri siap dipindahkan ke media cair (NB) dengan cara: memasukkan 5 ml air steril ke dalam cawan petri yang telah digores penuh dengan bakteri P. fluorescens dan bebas dari kotaminan, bakteri yang terbentuk kemudian dilepaskan dari media padat menggunakan jarum ose agar bakteri tercampur dalam air. Suspensi bakteri tersebut diambil sebanyak 400 μ (0.4 ml) dan dimasukkan ke dalam media cair Nutrienth Broth (NB) 250 ml dalam erlenmeyer. Erlenmeyer kemudian ditutup menggunakan aluminium foil dan direkatkan menggunakan seal-tape lalu diinkubasikan sambil dikocok menggunakan shaker dengan kecepatan 100 rpm selama 48 jam. Formula siap digunakan (Gambar 4). Formula coating asam askorbat 350 ppm dibuat dengan cara melarutkan 389 mg asam askorbat 90% dalam 1 liter aquades.
(a) Koloni Tunggal Bakteri (b) Koloni Bakteri di Media Padat (c) Suspensi Bakteri
Gambar 4. Persiapan Formula Bakteri dalam Kondisi Aseptik Kerapatan Bakteri
Kerapatan awal bakteri dihitung secara aseptik dengan metode pencawanan berseri yaitu
1. Pengenceran: suspensi bakteri pada media cair NB (telah dishaker selama 48 jam) diambil sebanyak 100μ (0.1 ml), kemudian dimasukkan ke tabung berisi 9 ml air steril dan dihomogenkan menggunakan vortex (tabung 1 pengenceran 101). Suspensi bakteri yang sudah homogen (tabung 1) kemudian diambil kembali sebnyak 1 ml untuk kemudian dimasukkan ke tabung 2 yang berisi 9 ml air steril, setelah dihomogenkan diperoleh tabung 2 dengan pengenceran 102 begitu seterusnya hingga diperoleh pengenceran 108.
2. Platting dilakukan menggunakan dua ulangan untuk setiap pengenceran 101,
103, 105 , 106, 107, 108, dengan cara mengambil 0.1 ml suspensi bakteri dari masing-masing tingkat pengenceran, kemudian disebar menggunakan gelas
penyebar pada petri yang berisi media padat King’s B. Cawan petri kemudian direkatkan menggunakan seal dan diletakkan dalam posisi terbalik untuk mencegah uap air yang dapat menimbulkan kontaminan. Pengamatan terhadap koloni yang tumbuh dilakukan setelah inkubasi selama 24 jam dan 48 jam pada suhu kamar.
Coating
Pelapisan benih padi hibrida dilakukan sesuai dengan taraf perlakuan. Suspensi bakteri yang digunakan memiliki kerapatan berkisar antara 109-1010 cfu/ml. Perbandingan antara suspensi bakteri atau larutan asam askorbat dengan polimer yaitu 10:19. Coating dilakukan menggunakan alat Rotary Coater. Benih yang telah dilapisi kemudian dikeringkan kembali sampai kadar air aman untuk disimpan yaitu <11%. Benih selanjutnya dikemas ke dalam kemasan plastik
poliethylen dan direkatkan (seal) untuk kemudian disimpan di Laboratorium Ilmu
dan Teknologi Benih selama 0, 3, 6, 9, 12 dan 15 minggu (Gambar 5).
(a) Benih dalam Kemasan (b) Benih di Penyimpanan
Gambar 5. Penyimpanan Benih Padi Hibrida PengujianViabilitas Benih
Viabilitas potensial diuji menggunakan tolok ukur daya berkecambah dan bobot kering kecambah normal. Viabilitas total diukur dengan melihat potensi tumbuh maksimum. Vigor kekuatan tumbuh benih diuji menggunakan tolok ukur indeks vigor dan kecepatan tumbuh. Pengujian dilakukan dengan cara mengecambahkan benih pada media kertas merang menggunakan metode Uji Kertas Digulung didirikan dalam plastik (UKDdp). Benih kemudian
dikecambahkan menggunakan alat pengecambah benih IPB 73 2A/B (Gambar 6). Setiap perlakuan terdiri atas tiga ulangan dan setiap ulangan terdiri dari 50 butir benih.
Gambar 6. Pengecambahan Benih Padi pada APB IPB 73 2A/B
Pengamatan
Tolok ukur yang diamati untuk mengukur daya simpan benih padi hibrida meliputi: kadar air benih (KA), daya berkecambah (DB), berat kering kecambah normal (BKKN), potensi tumbuh maksimum (PTM), kecepatan tumbuh (KCT) dan indeks vigor (IV).
1. Kadar Air (KA)
Kadar air benih diukur setiap periode simpan. Pengukuran dilakukan dengan menghaluskan benih padi dari masing-masing kantong penyimpanan menggunakan blender kemudian diayak dan ditimbang (berat bersih sekitar 1 gram) lalu dioven pada suhu 1050C selama ±17 jam. Kadar air dihitung dengan menggunakan rumus: KA = (M2-M1) - (M3-M1) X 100% (M2-M1) Dimana:
M1 : berat cawan (gram)
M2 : berat cawan dan benih (gram) M3 : berat benih setelah dioven (gram) 2. Daya Berkecambah (DB)
Daya Berkecambah merupakan tolok ukur yang mengindikasikan viabilitas potensial (Vp). Penghitungan DB diperoleh dari persentase kecambah normal (KN) pada pengamatan 1 (hari ke-5) dan pengamatan 2 (hari ke-7). Rumus yang digunakan:
DB =
Σ KN hitungan I + Σ KN hitungan II
X 100% Σ benih yang dikecambahkan
Dimana:
ΣKN = jumlah kecambah normal
3. Berat Kering Kecambah Normal (BKKN)
Berat kering kecambah (BKKN) adalah salah satu tolok ukur yang mengindikasikan viabilitas potensial (Vp) dengan menggambarkan laju pertumbuhan kecambah. Produksi berat kering dari pertumbuhan kecambah merefleksikan kondisi fisiologis benih.
Bagian biji yang masih menempel pada kecambah dihilangkan, kemudian kecambah normal berumur 7 HST dimasukkan dalam amplop dan dioven pada suhu 600C selama 72 jam. Selanjutnya, amplop+kecambah dimasukkan dalam desikator ± 30 menit, kecambah kering kemudian ditimbang dengan timbangan dua digit.
4. Potensi Tumbuh Maksimum (PTM)
Potensi tumbuh maksimum (PTM) mengindikasikan viabilitas total. Penghitungan PTM didasarkan pada benih yang tumbuh (berkecambah) sampai hari ke-7 setelah tanam. Rumus untuk menghitung PTM adalah:
PTM = Σ KN + Σ KAb
X 100% Σ benih yang ditanam
Dimana : ΣKN = jumlah kecambah normal sampai akhir pengamatan ΣKAb = jumlah kecambah abnormal sampai akhir pengamatan 5. Kecepatan Tumbuh (KCT)
Kecepatan tumbuh (KCT) merupakan tolok ukur yang mengindikasikan vigor kekuatan tumbuh. Perhitungan kecepatan tumbuh didasarkan pada akumulasi kecepatan tumbuh harian dalam unit tolok ukur persentase per hari dengan rumus: KCT = % KN ke-2 +…..+ % KN ke-n etmal etmal Dimana: 1 et mal = 24 jam
% KN = persentase kecambah normal
Gambar 7 menunjukkan proses perkecambahan benih padi pada 1 HST, 2 HST, 3 HST hingga menjadi kecambah normal pada 4 HST.
(a) Hari ke-1 (b) Hari ke-2 (c) Hari ke-3 (d) Hari ke-4 Gambar 7. Fase-fase Perkecambahan Benih Padi
6. Indeks Vigor (IV)
Perhitungan didasari pada persentase kecambah normal (KN) di hitungan pertama pada uji daya berkecambah yaitu 5 HST untuk benih padi, dengan rumus:
IV =
Σ KN hitungan I
X 100% Σ benih yang ditanam
Dimana: Σ KN = persentase kecambah normal
Benih yang dikecambahkan dibedakan menjadi tiga kategori yaitu kecambah normal, kecambah abnormal dan benih mati (Gambar 8).
(a) kecambah normal (b) Benih mati (c) kecambah abnormal Gambar 8. Kriteria Penilaian Kecambah Normal Benih Padi