Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler, Pusat Penelitian Bioteknologi-Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Cibinong, Puslitbang Peternakan dan Balitvet, Bogor, Indonesia dan di Laboratory of Animal Genetics, the Centre for Advanced Technologies in Animal Reproduction and Genetics (REPROGEN) of the University of Sydney, Australia. Pengadaan populasi anak domba (flock establishment) dilakukan di Puslitbang Peternakan dan Balitvet, Bogor. Pemeliharaan anak domba, pengukuran data kuantitatif, koleksi darah dan koleksi DNA serta analisis QTL dilakukan di Puslit Bioteknologi – LIPI, Cibinong. Semua analisis molekuler (genotyping) dan evaluasi alel dilakukan di Laboratorium REPROGEN, Sydney. Penelitian berlangsung dari tahun 1999 sampai 2004 untuk pengukuran data fenotipe, koleksi DNA dan analisis molekuler, sementara analisis data dilakukan pada tahun 2005.
Bahan DNA genom
Setiap individu domba dikoleksi darahnya dari vena jugularis untuk dikoleksi sel darah putihnya kemudian diekstraksi DNA nya dengan metode Montgomery & Sise (1990) yang telah dimodifikasi. DNA genom dikoleksi dari semua individu progeny domba silang balik dan tetua dari masing-masing keluarga acuan (reference families), yaitu terdiri dari kakek (GrandSire), nenek (GrandDam) dan anak jantan (F1 Sire = Pejantan). Jumlah total sample DNA adalah 393 yang terdiri dari jumlah populasi domba progeny sebanyak 381 dan 12 sampel yang terdiri dari pejantan F1= 4, tetua dari ke empat pejantan F1= 8).
Keluarga Acuan dan Pembentukan Populasi Progeny
Persyaratan dalam pembentukan keluarga acuan untuk pemetaan QTL adalah persilangan dua karakter yang berbeda besar (Lynch & Walsh 1998; Raadsma et al.
2002a; Seaton et al. 2002 dan Evans et al. 2003), untuk pembentukan pejantan atau sire F1. Dua karakter berbeda yaitu berasal dari domba ekor tipis Indonesia sebagai tipe domba kecil yang diasumsikan sebagai genotipe homosigot resesif, sedangkan domba Merino sebagai tipe domba besar sehingga diasumsikan sebagai genotipe homosigot dominan.
Studi analisis QTL ini melibatkan 4 keluarga acuan sebagai sumber penurunan populasi domba half-sib silang balik (backcross) dan sebagian kecil populasi full-sib
F2. Ke empat keluarga acuan yang dirancang yaitu berasal dari 4 pejantan F1 (sires) dengan nomor identitas (ID) 1261, 1262, 1263 dan 1273. Selanjutnya pejantan tersebut disilangkan balik dengan tetua Merino untuk pembentukan populasi progeny silang balik (BX), dan sebagian disilangkan dengan betina F1 untuk pembentukan populasi F2. Total populasi progeny yang digunakan dalam studi ini yaitu 381 ekor, yang terdiri dari 294 ekor domba silang balik dan sebanyak 87 ekor domba F2. Pembentukan populasi progeny yang dipergunakan dalam penelitian ini digambarkan pada Tabel 5. Daftar progeny domba yang digunakan dapat dilihat pada Lampiran 2.
Tabel 5. Rancangan hewan percobaan Keluarga Acuan Progeny GS 3050/GG GD 6/MM GS 25/SS GD 1/MM GS 2153/GG GD 13/MM GS 102/SS GD 12/MM F1 1261 (GM) x Sejumlah Betina Merino* (MM) F1 1262 (SM) x Sejumlah Betina Merino* (MM) F1 1263 (GM) x Sejumlah Betina Merino* (MM) F1 1273(SM) x Sejumlah Betina Merino* (MM) Jml BX 52 96 60 86 F1 1261 (GM) x Sejumlah Betina F1** - F1 1263 (GM) x Sejumlah Betina F1** - Jml F2 57 - 30 - Total 109 96 90 86
GS= GrandSire (Kakek) GM= Garut Merino GD= GrandDam (Nenek) SM= Sumatera Merino
Termasuk dalam kelompok DET atau domba ekor tipis Indonesia (ITT) yaitu domba ekor tipis yang tersebar di daerah Jawa Barat dan Sumatera (Subandriyo 2003). Domba ekor tipis yang digunakan dalam penelitian ini yaitu domba Garut atau Priangan yang berasal dari Jawa Barat dan domba ekor tipis Sumatera atau Medan yang berasal dari Sumatera.
Notasi genotipe domba ekor tipis atau ITT dengan demikian ada dua, yaitu GG untuk domba Garut dan SS untuk domba Sumatera. Sementara domba Merino dalam studi ini dinotasikan dengan MM. Sire F1 dengan demikian mempunyai notasi genotipe GM atau SM dan back cross progeny mempunyai notasi GMM atau SMM. Sementara kemungkinan notasi genotipe F2 dalam studi ini GMGM atau GMSM. Penciri Mikrosatelit
Penciri Mikrosatelit diperoleh secara komersial dengan acuan penciri genetik dari Peta Genom Domba de Gortari et al (1998) dan Maddox et al. (2001, 2002). Sebanyak 250 panel pre-screening penciri mikrosatelit dan setelah melalui penapisan (screening) diperoleh 136 penciri mikrosatelit informative yang selanjutnya digunakan untuk perunutan seluruh genom (a genome-wide scan) atau genotyping.
Tabel 6. Penciri mikrosatelit per kromosom
No Kromosom Jumlah Penciri No Kromosom Jumlah Penciri
1 1 15 14 14 3 2 2 12 15 15 3 3 3 12 16 16 3 4 4 7 17 17 5 5 5 7 18 18 5 6 6 6 19 19 2 7 7 5 20 20 3 8 8 4 21 21 2 9 9 5 22 22 4 10 10 6 23 23 4 11 11 5 24 24 3 12 12 5 25 25 3 13 13 4 26 26 3
Jumlah penciri mikrosatelit per kromosom yang digunakan untuk genotyping
sangat bervariasi, paling banyak terdapat pada kromosom 1 sebanyak 15 dan hanya 2 penciri mikrosatelit pada kromosom 19 dan 21 (Tabel 6). Daftar nama penciri mikrosatelit per kromosom, ukuran fragment, sekuen marker dan suhu annealing per marker, ditampilkan pada Lampiran 1.
Penciri mikrosatelit yang digunakan disusun secara berurut sesuai dengan jumlah penciri per kromosom beserta jarak antara 2 penciri mikrosatelit dalam ukuran cM untuk kemudian digunakan sebagai Map file dalam Input data untuk keperluan analisis QTL. Contoh penyusunan Map file dapat dilihat pada Lampiran 3.
Metode
Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR digunakan untuk memperbanyak jutaan cetakan (copy) potongan (fragment) DNA genom dari sejumlah kecil cetakan (template) DNA. Guna keperluan tersebut diperlukan beberapa reagen, sebagai berikut:
1. Thermostable DNA polymerase. Ensim yang paling umum digunakan yaitu Taq polymerase turunan dari Thermus aquaticus yaitu suatu jenis bakteri hidup di sumber air panas (hot spring). Ensim ini sangat toleransi dengan suhu sangat tinggi.
2. Cetakan DNA (DNA template)
3. Sepasang penciri (primer) adalah sepasang komplemen untuk menetapkan daerah untuk diamplifikasi pada cetakan (template)
4. Deoxynucleotide triphosphate, yaitu dATP, dCTP, dGTP, dTTP 5. Ion Magnesium (Mg++) dan reagen buffer yang sesuai
6. MilliQ H2O atau aqubidest
Dalam penelitian ini disiapkan reaksi PCR dengan volume 10µl untuk setiap 1µl cetakan atau sample DNA dengan campuran reagen PCR sebagai berikut:
- 10x NZ buffer 1µl - MgCl2 (25mM – 2.5M) 1µl - dNTP 200 µm 0,4µl - IR 700 (dye) 1pm/µl 0,2µl - Forward primer 0,8pm/reaction 0,04µl - Reverse primer 0,8pm/reaction 0,04µl
- ddH2O 7,28µl
- Taq zung16 0,08µl
Mesin PCR yang digunakan yaitu manual PCR (50-Licor atau MJ) dan Robotic PCR Beckman 2000 untuk mempercepat perolehan produk PCR. PCR dilakukan dengan pengulangan 35 (35 cycles), setiap siklus terdiri dari tahapan seri sebagai berikut: 5 siklus pertama:
Pemanasan mesin 95oC selama 5 menit Denaturasi 95oC, selama 45 detik Annealing 68oC, selama 90 detik Extension 72oC, selama 60 detik 4 siklus kedua:
Denaturasi 95oC, selama 45 detik Annealing 58oC, selama 60 detik Extension 72oC, selama 60 detik 25 siklus terakhir:
Denaturasi 95oC, selama 45 detik Annealing 50oC, selama 90 detik Extension 72oC, selama 60 detik
Pendinginan dimulai dari 72oC selama 5 menit, kemudian diturunkan sampai 20oC selama 5 menit dan dipertahankan pada suhu 4oC atau disimpan dalam lemari es sampai saat dipergunakan. Total kegiatan PCR (35 siklus) memerlukan waktu ± 2,5 jam.
Beberapa penciri miksosatelit memerlukan QIAGEN PCR Kit, hal ini dikarenakan dengan reagen PCR yang diracik sendiri di dalam laboratorium tidak terjadi amplifikasi. Terdapat tiga kondisi PCR dengan menggunakan Qiagen kit, yaitu:
PCR 1. Manual* + Tween20 (1%) PCR 2. Qiagen Kit + Tween20 (1%)
PCR 3. Qiagen Kit (tanpa Q-solution) + Tween20 (1%)
*Manual yang dimaksud yaitu menggunakan racikan reagen PCR yang dilakukan di laboratorium seperti pada racikan PCR sebelumnya. Pengerjaan PCR dengan Qiagen kit ini menggunakan plate dengan 384 sumur (wells) yang disesuaikan dengan mesin PCR yang digunakan untuk racikan sendiri, namun tanpa mineral oil. Sementara PCR dengan racikan sendiri menggunakan plate dengan 96 sumur. Ada dua program PCR yang digunakan pada sampel yang menggunakan reagen Qiagen kit, yaitu:
1. Program 384-Li50: seperti pada pengerjaan untuk PCR dengan peracikkan sendiri (lihat halaman sebelumnya)
2. Program K384-68 Genotyping
Genotyping dilakukan dengan menganalisis DNA dari produk Polymerase Chain Reaction (PCR) dari setiap individu domba termasuk tetuanya (Kakek, Nenek, Pejantan F1). Pada pengerjaan genotyping progeny dimaksudkan untuk melihat konsistensi penyebaran alel dari tetua (Kakek, Nenek dan Bapak) kepada keturunannya (progeny). Oleh karena itu penyusunan sample (PCR products individu domba) pada sumur (well) acrylamide gel juga disesuaikan dengan susunan tersebut. Pengerjaan genotyping progeny pada intinya sama seperti pada screening markers, hanya pada genotyping progeny juga menyertakan sejumlah progeny sesuai dengan keluarganya. Volume produk PCR yang digunakan untuk loading dalam genotyping
yaitu 1 µl. Mesin DNA Analyzer yang digunakan untuk genotyping yaitu mesin sequencer a semi-automatic Li-COR DNA Analyzer Gene ReadIR 4200. Analisis DNA ini dimaksudkan untuk melihat penyebaran alel dan untuk melihat apakah ada konsistensi kemunculan alel dari tetuanya (GrandSire, GrandDam dan Sire) pada kelompok turunannya (progeny).
Pembacaan alel (scoring alleles) dilakukan oleh minimal dua peneliti (Crawford
et al. 1995) atau menggunakan software khusus seperti Gene ImagIR untuk Li-COR sequencer machine. Dalam pembacaan alel berlaku ketentuan sebagai berikut: pemberian angka 1 yaitu untuk alel yang berasal dari pejantan (Sire) dan angka 2 untuk alel yang berasal dari Ibu (Dam) sementara bila tidak salah satu diantaranya (1 atau 2) diberi angka 6. Notasi 0, bila tidak terdapat pewarisan alel dari tetuanya. Pemberian angka tersebut diperlukan untuk penyusunan genotype file dalam Input data yang diperlukan dalam analisis QTL. Contoh penyusunan genotype file
dipaparkan dalam excel file seperti pada Lampiran 4.
Koleksi Data Fenotipe
Sesuai dengan tujuan dalam penelitian ini yaitu anaisis QTL sifat produksi, maka beberapa karakteristik berat badan disepakati untuk ditimbang. Karakteristik berat badan tersebut yaitu berat lahir (BL), berat badan umur 90 hari (BB90), umur
180 (BB180), umur 270 (BB270) dan umur 360 (BB360). Data kuantitatif berat badan
tersebut ditimbang (dengan timbangan gantung) sesuai dengan umur yang disepakati tersebut, data berat badan dikoleksi dari tahun 1999 sampai dengan tahun 2003. Selama pemeliharaan semua domba diberikan pakan yang sama terdiri dari rumput gajah (±10% dari berat badan) dan konsentrat (±2,5% dari berat hidup, Indofeed) serta air minum diberikan ad libitum. Data berat badan setiap individu beserta genotipe, jenis kelamin dan waktu pengadaan pengadaannya disusun dalam excel file
sebagai phenotype file dalam Input data guna keperluan Analisis QTL. Contoh susunan phenotype file dipaparkan pada Lampiran 5.
Analisis Genetik dan Statistik
Analisis segregasi. Analisis segregasi dilakukan dengan metode mixture-models
(Lynch & Walsh 1998). Metode ini menggunakan pendekatan goodness of fit dari data fenotipe terhadap distribusi bi-modal (ditandai 2 kurva) sebagai komposisi campuran dari dua kelompok distribusi atau sub-distributions. Distribusi campuran dua kelompok tersebut mempunyai proporsi keragaman yang sama (indikasi adanya
segregasi gen mayor) terhadap kecocokan data. Apabila data fenotipe yang digunakan menunjukkan distribusi normal atau tidak bercampur (non-mixture), ini mengindikasikan tidak terdapat gen mayor. Uji keberadaan segregasi gen mayor dilakukan dengan uji Likelihood Ratio Test (LRT).
Pada studi ini analisis segregasi dilakukan terhadap populasi progeny half-sib backcross yang terdiri dari empat keluarga acuan. Ke empat keluarga acuan tersebut diberi nomor identitas (ID): 1261, 1262, 1263 dan 1273.
Analisis QTL. Model analisis yang digunakan yaitu regresi interval linear dengan tiga input data (BBSRC 2005) Ke tiga input data terdiri dari Map file (berisi jumlah penciri per kromosom dengan ukuran (cM) jarak antara 2 penciri, Lampiran 3), Genotype file (berisi ID progeny, ID Pejantan F1 dan semua genotipe individu atau hasil pembacaan alel dari genotyping, Lampiran 4), dan Phenotype file (berisi semua ID progeny, ID Pejantan F1, ke empat fixed effects: waktu pengadaan atau drop, genotype setiap individu, jenis kelamin, tipe kelahiran dan data kuantitatif tiap karakter berat badan, Lampiran 5). Pada analisis penelitian ini tidak menggunakan prosedur a robust two-step untuk menentukan IBD (Identity By Descent) seperti yang diterangkan oleh Seaton et al. (2002). Namun semua analisis pengujian yang diguanakan seperti permutate-experiment wide, –chromosome wide dan resampling bootstrap adalah sama seperti yang diterangkan Seaton et al. (2002).
Sebelum tersedianya perangkat lunak (software) secara online, deteksi keberadaan QTL untuk sifat tertentu perlu dilakukan pencarian jarak penciri genetik lebih dulu. Pencarian jarak antar penciri genetik pada kromosom tertentu dikalkulasi dengan menggunakan analisis CRI-MAP menurut Green et al. (1990). Jarak penciri genetik tersebut digunakan dalam penyusunan peta keterpautan yang mana selanjutnya digunakan dalam analisis QTL. Namun saat ini, analisis QTL dapat dilakukan secara online dengan perangkat lunak QTL Express melalui situs: http://qtl.cap.ed.ac.uk.
QTL Express adalah salah satu program untuk analisis data quantitative trait loci dari populasi persilangan luar (outbred population), namun sekarang telah berkembang untuk struktur populasi komplek lainnya. Program sederhana ini menyediakan perangkat analitik yang kuat. Metode analisis yang digunakan yaitu regresi interval linier dengan pilihan populasi adalah half-sib, walaupun sebagian populasi yang digunakan adalah F2.
Dijelaskan pada QTL Express (2001) bahwa analisis dengan QTL Express ini mengharuskan melewati dua tahap. Pertama, data pada posisi penciri genetik bersama dengan genotipe penciri aktual, digunakan untuk menghitung probabilitas individu mewarisi alel 0, 1 atau 2 dari setiap garis kedua tetuanya pada posisi sepanjang genom. Probabilitas tersebut dikombinasikan ke dalam ‘koefisien’ yang dapat digunakan untuk melihat isi informasi penciri atau penyimpangan segregasi penciri. Kedua, analisis data fenotipe di regresikan pada ‘koefisien’ tersebut. Umumnya, cara pendekatan regresi adalah mencocokkan ragam genetik dan model lingkungan, seperti satu atau dua linked QTL, aditif, dominan dan pengaruh cetak (imprinting) QTL, pengaruh faktor lingkungan (fixed effects) atau ko-variat, interaksi QTL dengan fixed effects.
Oleh karena itu, diperlukan mutlak penyediaan tiga input data untuk analisis QTL dengan program QTL Express. Ke tiga input data yang harus disediakan, diistilahkan dengan Map file, genotype file dan phenotype file. Map file, berisi semua penciri mikrosatelit (136) yang digunakan dan menutup seluruh 26 kromosom autosom domba beserta jarak penciri. Contoh penyusunan Map file dapat dilihat pada Lampiran 3. Genotype file, berisi genotipe alel hasil evaluasi alel dari analisis penciri atau hasil genotyping pada semua individu populasi progeny yang digunakan, contoh penyusunan lihat Lampiran 4. Phenotype file, berisi data fenotipe (berat badan) atau data kuantitatif seperti parameter yang digunakan, yaitu BL, BB90, BB180, BB270 dan
BB360. File fenotipe ini, dipersiapkan untuk setiap parameter, masing - masing
parameter disusun untuk semua populasi progeny, contoh penyusunan lihat Lampiran 5. Empat fixed factors yang dianggap berpengaruh terhadap pertumbuhan yaitu waktu
pengadaan ternak (drop), genotipe individu, tipe kelahiran dan jenis kelamin domba. Ke-empat fixed factors tersebut dimasukkan atau disusun pada genotype file.
Beberapa luaran dari analisis QTL Express, yaitu File warnings, significance threshold, dan confidence intervals, masing - masing hasil dari basic analysis, analisis atau uji permutasi (chromosome wide dan experiment wide) dan bootstrap resampling. Hasil pada file warnings, ditampilkan lokasi QTL (cM), jarak QTL (cM) dan penciri apit (flanking markers) pada setiap kromosom untuk setiap sifat yang diamati. Pengaruh QTL atau kekuatan QTL dapat dilihat dari nilai ambang nyata (significance threshold) pada taraf 5% (p<0.05) dan 1% (p<0.01) menurut Seaton et al. (2002). Uji permutasi yaitu untuk menetapkan genome-wide significance threshold (Churchill & Doerge 1994). Confidence interval, dimaksudkan untuk melihat prediksi lokasi gen terletak pada jarak 95% dari setiap kromosom.
Identifikasi Gen. Identifikasi gen kandidat untuk sifat tertentu pada hewan domestik, yaitu mengacu pada genom kromosom manusia. Hal ini dikarenakan genom manusia telah dipetakan lebih sempurna dari ternak domestik. Oleh karenya, lokasi gen yang ditemukan pada kromosom domba perlu dihomologkan dengan kromosom manusia. Lokasi gen terletak diantara penciri apit pada segmen kromosom manusia dengan satuan ukuran Mega base (Mb). Oleh karena itu lokasi gen diantara penciri apit dari centi Morgan (cM) perlu diprediksi lebih dulu ke dalam satuan Mb pada segmen kromosom manusia. Homologi dengan kromosom manusia dan lokasi gen kandidat pada segmen kromosom manusia dengan satuan Mb dapat dilihat dengan akses ke Australian Sheep Gene Mapping Website (ASGMWS 2004) dengan situs http://rubens.its.unimelb.edu.au/~jillm/jill.htm.
Gen kandidat diidentifikasi dengan menganalisis segmen pada kromosom manusia (Mb) melalui situs ncbi: (http://www.ncbi.nih.gov) akan terlihat sederetan daftar gen. Daftar gen kandidat ini perlu dianalisis untuk melihat fungsinya dengan melihat deskripsi pada Online Mendelian Inheritance of Man (OMIM) dari daftar gen tersebut. Hanya gen dengan deskripsi yang berasosiasi dengan pertumbuhan dan
perkembangan yang diindikasikan sebagai gen kandidat pertumbuhan yang dicari pada studi ini.
Parameter yang diamati. Sifat fenotipik untuk analisis segregasi, yaitu karakter pertumbuhan seperti berat lahir (BL), berat umur 90 hari (BB90) dan pertambahan
bobot badan 1-90 hari (pbb1-90). Semua data sebelum dilakukan analisis segregasi,
telah dikoreksi sesuai dengan bobot badan yang diamati. Sementara sifat fenotipik pertumbuhan untuk analisis QTL yaitu berat lahir (BL), berat badan umur 90, 180, 270 dan 360 hari (BB90, BB180, BB270, BB360).