Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli 2011 hingga bulan Maret 2012 bertempat di Laboratorium Helmintologi Bagian Parasitologi dan Entomologi Kesehatan dan Laboratorium Bateriologi Bagian Mikrobiologi Medis Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel ikan patin, NaCl fisiologis, etanol bertingkat, etanol absolut, ethanol 70%, minyak cengkeh, pewarna Semichon’s Acetocarmine, entelan, xylol, aquades, Blood Agar, Mac Conkey Agar, Nutrient Agar, pewarna Gram, glukosa, sukrosa, maltosa, laktosa, manitol, indol, TSIA, sitrat, KOH 10% dan KOH 4%.
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah seperangkat alat bedah, timbangan, cawan petri, pinset, kait, pipet tetes,gunting, botol kaca, spidol, label nama, gelas objek dan kaca penutup, mikroskop cahaya, mikroskop stereo, video mikroskop, bunsen, ose, needle, tabung reaksi dan rak tabung reaksi.
Metode Penelitian
1. Teknik Pengambilan Sampel
Sampel ikan diambil dari kolam petani ikan patin di daerah Parung Kabupaten Bogor sebanyak 10 ekor dengan berat rata–rata 500 g.
2. Teknik Parasitologi
Ikan patin yang masih hidup dimatikan dengan cara menusuk bagian medial kepala tepat di otak. Insang ikan dikeluarkan kemudian diletakkan ke dalam cawan petri yang telah diisi dengan NaCl fisiologis. Rongga perut ikan dibuka kemudian saluran pencernaan (usus dan lambung) dikeluarkan diletakkan ke dalam cawan petri yang telah diisi NaCl fisiologis. Kemudian sampel dimasukkan ke dalam refrigerator selama kurang lebih 10 jam untuk merelaksasikan cacing. Setelah itu insang disisir di bawah mikroskop stereo untuk mengoleksi cacing. Saluran pencernaan dibuka lumennya kemudian disisir di
bawah mikroskop stereo untuk mengoleksi cacingnya. Cacing yang ditemukan direlaksasikan di dalam NaCl fisiologis kemudian difiksasi di dalam etanol 70% sebelum diwarnai.
3. Pewarnaan
Pada penelitian ini digunakan dua jenis teknik pewarnaan, yaitu pewarnaan permanen untuk trematoda dan pewarnaan semi permanen untuk Nematoda.
a. Pewarnaan Permanen
Pewarnaan permanen atau dikenal juga dengan pewarnaan Semichon’s
Acetocarmine biasa digunakan untuk mengindentifikasi cacing pipih (golongan trematoda). Tahap pertama dalam pewarnaan ini adalah dengan merendam spesimen dalam larutan Semichon’s Acetocarmine selama 15-20 menit (sampai warna terserap dan spesimen berubah warna menjadi merah cerah). Setelah itu spesimen dibilas dengan menggunakan etanol 70% dan kemudian direndam di dalam larutan asam alkohol (99 bagian etanol 70% dicampur dengan 1 bagian HCl). Kemudian dilakukan dehidrasi pada spesimen dengan menggunakan etanol bertingkat (70%, 85%, 95%, 100%) dengan cara merendamnya selama 5 menit pada setiap konsentrasi etanol. Setelah itu spesimen direndam di dalam xylol sampai spesimen terlihat tembus pandang. Langkah terakhir adalah spesimen di-
mounting dengan entelan sebagai media fiksasi (Soulbsy 1982). b. Pewarnaan Semi Permanen
Teknik pewarnaan ini menggunakan KOH dan minyak cengkeh yang diaplikasikan untuk pewarnaan Nematoda. Tahapan pewarnaannya ialah penipisan dan penghilangan lapisan kutikula cacing yang dilakukan dengan cara merendam spesimen dalam KOH 10% selama 1-3 menit sampai lapisan kutikula terlihat tembus pandang. Setelah itu spesimen dipindahkan ke dalam minyak cengkeh selama kurang lebih 30 detik sampai 1 menit sampai organ–organ tubuh terlihat jelas. Kemudian cacing didehidrasi dengan dimasukkan ke dalam etanol bertingkat (70%, 85%, 95%) masing–masing selama 15 sampai 30 detik. Spesimen yang telah didehidrasi di-mounting dengan entelan sebagai media fiksasi (Khairunnisa 2007).
4. Pemeriksaan Bakteri
Ikan ditimbang Sampel digerus
Pewarnaan Gram
Agar darah Agar Mac Conkey
Koloni terpisah Isolat Murni pada agar nutrien Pewarnaan Gram
Positif (+) Negatif (-)
Coccus Batang Batang Coccus
Uji Oksidase Neisseria
(+) (-) Batang berspora Batang tidak berspora
(+) (-)
Katalase Bacillus sp. Enterobactericeae Non Enterobactericeae
TSIA
(+) (-) Indol
Sitrat Urea
Microcaccaceae Streptococcoceae Fermentasi karbohidrat
Uji Glukosa Mikroaerofilik Mycobacterium Corynebacterium (-) (+) Propionobacterium Lactobacillus Micrococcus Staphylococcus MSA (+) (-) S. aureus S. epidermidis
Persiapan Bahan
Contoh berupa insang dan saluran pencernaa ikan. Insang dipotong ±1x1 cm ditambah ±10 tetes aquades digerus dan hasil gerusan ditanam pada media MCA dan agar darah. Sisa organ insang diletakkan didalam cawan petri yang berisi NaCl fidiologis. Satu tetes isi saluran pencernan ditambah ±10 tetes aquades digerus dan hasil gerusan ditanam pada media MCA dan agar darah. Sisa saluran pencernaan diletakkan didalam cawan petri yang berisi NaCl fidiologis, kemudian digunting sampai. Pengerjaannya dilakukan secara aseptis.
Isolasi Bakteri
Suspensi hasil gerusan ditanam di atas media agar darah dan agar Mac- conkey untuk menumbuhkan koloni dengan teknik goresan T. Media yang telah digores kemudian diinkubasi selama kurang lebih 24 jam. Koloni terpisah yang tumbuh pada agar darah dan agar Mac-conkey dikarakterisasi berdasarkan persamaan morfologis, yaitu ukuran, warna, bentuk, tepi permukaan, dan transparansi. Koloni bakteri yang berbeda diambil dan dibiakkan pada agar nutrien sebagai isolat murni pada suhu 37 °C selama 24 jam dan dilakukan pewarnaan Gram untuk mengetahui sifat Gram dan morfologi bakteri. Menurut Lay (1994), teknik pewarnaan Gram yaitu spesimen ditetesi kristal violet selama 1 menit kemudian dibilas dengan aquades. Setelah itu, spesimen ditetesi dengan larutan pemucat (alkohol) selama 10-20 detik. Tahap terakhir ialah spesimen ditetesi safranin selama 1 menit kemudian dibilas dengan aquades serta dikeringkan dengan kertas pengering.
Identifikasi Bakteri
Pengamatan mikroskopik dengan pewarnaan Gram dilakukan kembali untuk memperjelas morfologi dan sifat Gram dari suatu bakteri. Bakteri yang bersifat Gram positif dengan bentuk batang terbagi menjadi dua, yaitu batang besar memiliki spora dan tidak berspora. Batang berspora secara umum terdiri dari genus Bacillus sp. (aerob) dan Clostridium (anaerob). Bakteri yang berbentuk batang yang tidak memiliki spora secara umum dibedakan dengan bakteri yang
tahan asam yaitu Mycobacterium dan tidak tahan asam (Corynebacterium dan
Listeria).
Isolat dengan hasil Gram positif yang berbentuk coccus, selanjutnya diuji dengan uji katalase. Katalase adalah enzim yang mengkatalisiskan (H2O2) menjadi air dan oksigen. Penentuan adanya katalase diuji dengan penambahan 3% H2O2 pada koloni terpisah. Uji ini dilakukan untuk membedakan antara bakteri kelompok Microcaccaceae dan Streptococcoceae (Lay 1994). Kelompok
Streptococcoceae bersifat katalase negatif, sedangkan kelompok Microcaccaceae
bersifat katalase positif. Bakteri yang bersifat katalase positif akan terlihat pembentukan gelembung udara di sekitar koloni. Reaksi kimiawi yang dikatalisasikan oleh enzim katalase terlihat berikut:
Bakteri dengan sifat katalase positif selanjutnya dilakukan uji. Hasil negatif uji glukosa menunjukkan bakteri Micrococcus, sedangkan hasil positif menunjukan bakteri Staphylococcus. Bakteri dengan hasil positif kemudian dilakukan uji pada agar Manitol Salt Agar (MSA) yang mengandung kadar NaCl tinggi, sehingga akan menghambat pertumbuhan bakteri selain Staphylococcus. Media ini terutama digunakan untuk membedakan kelompok Staphylococcus yang bersifat patogen dan non-patogen. S. aureus pada umumnya bersifat patogen dan menghasilkan warna kuning pada agar. S. epidermidis bersifat tidak patogen dan membentuk zona merah pada agar. Warna kuning disebabkan oleh fermentasi manitol disertai pembentukan asam, sedangkan warna merah disebabkan manitol yang tidak difermentasikan.
Uji oksidase berfungsi untuk menentukan adanya oksidase sitokrom pada mikroorganisme. Uji ini berguna dalam identifikasi mikroorganisme patogen seperti Neisseria gonorhoea dan Pseudomonas aeruginosa yang menunjukkan hasil positif terhadap uji oksidase. Reagen uji oksidase terdiri dari 1:1 (vol/vol) laruran 1% alpha-naphtol dan 1% dimetil-p-fenillendiamin oksalat. Tahapan dalam uji oksidase ialah dengan pencampuran koloni terpisah dengan reagen. Hasil oksidase positif ditunjukkan dengan warna koloni yang berubah menjadi berwarna hitam setelah 30 menit. Hal ini disebabkan oksidase sitokrom mengoksidasikan larutan reagen (Lay 1994). Hasil uji oksidasi positif dapat
dilanjutkan dengan proses identifikasi menggunakan media Triple Sugar Iron Agar (TSIA), indol, MRVP (Methyl Red–Voges Proskauer), sitrat, urea, uji fermentasi karbohidrat. Hasil uji oksidase yang menunjukkan hasil negatif mengindikasikan jenis bakteri Pseudomonas dan Bordetella.
Uji TSIA dilakukan dengan menggunakan Triple Sugar Iron Agar. Media mengandung tiga macam gula yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa, selain itu media juga mengandung indikator merah fenol dan FeSO4 untuk memperlihatkan pembentukan H2S yang ditunjukkan dengan adanya endapan hitam. Konsentrasi glukosa adalah 1/10 dari konsentrasi laktosa atau sukrosa agar fermentasi glukosa dapat terlihat. Media TSIA terdiri dari dua bagian yaitu butt (bawah) dan slant
(atas). Tahapan uji TSIA yaitu koloni bakteri diambil dengan menggunakan
needle, kemudian ditusukkan pada bagian tengah butt dan langsung dilanjutkan dengan penggoresan di bagian slant. Setelah itu media diinkubasi pada suhu 37°C selama 24-48 jam (Lay 1994).
Reaksi yang dapat terlihat pada media TSIA adalah bagian butt bersifat asam dan berwarna kuning sedangkan bagian slant bersifat basa dan berwarna merah akibat dari fermentasi glukosa. Keseluruhan media terjadi pembentukan asam sehingga seluruh media berwarna kuning akibat fermentasi laktosa atau sukrosa atau keduanya. Adanya pembentukan gas pada bagian butt, sehingga media terpecah akibat pembentukan gas seperti H2 dan CO2. Seluruh media berwarna merah karena ketiga jenis glukosa tidak difermentasi. Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya dapat terbentuk endapan hitam pada bagian butt karena pembentukan H2S (Lay 1994).
Uji indol dilakukan dengan menggunakan media indol yang kaya akan triptofan. Koloni bakteri yang telah diambil dengan menggunakan needle
ditusukkan ke bagian tengah media kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24-48 jam. Uji indol dilakukan dengan penambahan reagen Erlich-Bohme
sebanyak 2-3 tetes dan ditunggu selama 2-3 menit. Hasil uji positif terlihat dengan terbentuknya warna merah pada permukaan media. Media indol berbentuk semi padat sehingga dapat digunakan untuk mengetahui pergerakan bakteri. Bakteri yang bersifat motil terlihat pertumbuhan koloni di sekitar tusukan dan di permukaan media (Lay 1994).
Uji Methyl Red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam campuran. Fermentasi asam campuran ditentukan dengan cara menumbuhkan mikroorganisme dalam kaldu yang mengandung glukosa dan menambahkan reagens methyl red ke dalam kaldu setelah masa inkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam. Kaldu biakan akan berubah menjadi kuning atau jingga jika tidak terjadi fermentasi asam campuran. Uji ini sangat berguna dalam mengidentifikasi kelompok bakteri yang menempati saluran pencernaan.
Uji Voges Proskauer digunakan untuk mengidentifikasi mikroorgnisme yang memfermentasi 2,3-butanadiol yang mengakibatkan penumpukan bahan dalam pertumbuhan. Penambahan 10 tetes 40% KOH dan 15 tetes 5% larutan
alphanapthol dalam etanol dapat menentukan adanya asetoin
(asetilmetilkarbinol), yaitu suatu senyawa pemuka dalam sintesis 2,3-butanadiol. Keberadaan asetoin ditunjukkan oleh perubahan warna kaldu menjadi merah muda. Hasil reaksi dapat terlihat paling lambat setelah 30 menit. Perubahan warna kaldu biakan akan lebih jelas pada bagian yang berhubungan dengan udara karena sebagian 2,3-butanadiol dioksidasikan kembali menjadi asetoin sehingga memperjelas hasil reaksi.
Uji sitrat dilakukan dengan menggunakan media Simmon’s citrate yang berbentuk padat dan berwarna hijau. Media sitrat merupakan medium sintetik dengan Na sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon, NH4+ sebagai sumber N dan
brom thymol blue sebagai indikator pH. Koloni bakteri yang telah diambil dengan menggunakan ose kemudian digoreskan pada permukaan media dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24-48 jam. Hasil uji positif diperlihatkan dengan perubahan warna media dari warna hijau menjadi biru. Hal ini menunjukan kemampuan dari bakteri yang diuji dalam menggunakan sitrat dari media sebagai satu-satunya sumber karbon (Lay 1994).
Uji urea dilakukan dengan menggunakan media urea yang berbentuk padat dan berwarna merah-jingga. Koloni bakteri digoreskan pada permukaan media dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24-48 jam. Hasil uji positif terlihat dengan perubahan warna media dari merah-jingga menjadi merah-ungu karena terjadinya proses hidrolisis urea (Lay 1994).
Uji fermentasi karbohidrat dilakukan dengan menggunakan media kaldu karbohidrat yaitu glukosa, sukrosa, laktosa, maltosa, dan manitol yang mengandung indikator brom cresol purple (BCP) dan di dalam tabung terdapat tabung Durham sebagai indikator pembentukan gas. Koloni bakteri yang telah diambil dengan menggunakan ose diinokulasi ke dalam media kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24-48 jam. Hasil positif uji fermentasi karbohidrat diperlihatkan dengan perubahan warna media dari merah menjadi kuning. Pembentukan gas dapat terlihat dengan adanya gelembung gas pada tabung durham.