Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di dua lokasi. Lokasi pertama di penangkaran rusa Universitas Sumatera Utara (USU), Padang Bulan, Medan untuk koleksi feses selama masa kebuntingan rusa. Lokasi kedua Laboratorium Endokrinologi Unit Rehabilitasi Reproduksi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor untuk analisis hormon. Penelitian dilakukan selama satu tahun, dimulai dari bulan Desember 2010 sampai dengan Desember 2011.
Bahan dan Alat Penelitian Bahan
Penelitian ini menggunakan 3 ekor rusa sambar betina bunting dan kisaran umur 2 – 4 tahun (syarat lain: pernah beranak satu kali, sehat). Untuk kandang digunakan sebuah bangunan dengan ukuran 22.5 x 7 m. Rusa ditempatkan pada kandang individual yang berukuran 2.5 x 7 m. Kandang ini dilengkapi dengan tempat air minum dari plastik, dan tempat pakan. Kandang diupayakan untuk dapat memberikan kenyamanan fisik dan kesehatan sesuai dengan syarat penelitian dan etika pemeliharaan Pakan yang diberikan berupa hijauan (campuran rumput dan legume) dan konsentrat, serta pemberian air minum ad-libitum. Obat- obatan yang disediakan: obat cacing, obat kutu, cipper killer, hematophan, biosalamin dan pennicilin.
Komponen KIT hormon yang digunakan dalam pengukuran hormon estrogen dengan teknik ELISA antara lain :
1. Microtitter Wells (sumuran) 12 x 8 (96 sumur) yang telah dilapisi dengan antibodi anti estradiol (polyclonal).
2. Standart (0 – 6) 7 vial (1 mL).
Konsentrasi (0, 25, 100, 250, 500, 1000, 2000) pg/mL. 3. Conjugate enzyme (1 vial), 25 mL
Estradiol berkonjugasi dengan horseradish peroxidase mengandung: 0.03% proclin 300
0.010% MIT (2-methyl-2H-isothiazol-3one).
4. Larutan substrat 1 vial, 14 mL Tetramethylbenzidine (TMB) 5. Stop solution 1 vial 14 mL (0.5 M H2SO4).
6. Wash solution 1 vial, 30 mL (concentrated 40 x).
Adapun komponen KIT hormon yang digunakan dalam pengukuran hormon progesteron dengan teknik ELISA antara lain :
1. Microtitter Wells (sumuran) 12 x 8 (96 sumur) yang telah dilapisi dengan antibodi anti P4 (polyclonal).
2. Standart (0 – 6) 7 vial (1 mL).
Konsentrasi (0; 0,3; 1,25; 2,5; 5; 15;40 ng/mL). 3. Conjugate enzyme (1 vial), 25 mL
P4 berkonjugasi dengan horseradish peroxidase mengandung: 0.03% proclin 300
0.015% BND (5-bromo 5-nitro-1,3-dioxane) 0.010% MIT (2-methyl-2H-isothiazol-3one).
4. Larutan substrat 1 vial, 14 mL Tetramethylbenzidine (TMB) 5. Stop solution 1 vial 14 mL (0.5 M H2SO4).
6. Wash solution 1 vial, 30 mL (concentrated 40 x).
Alat
Alat yang digunakan dalam pengadaan feses adalah: tiga unit kandang individu masing-masing dengan ukuran 2.5 x 7 m, Setiap unit kandang dilengkapi dengan tempat pakan dan minum, pinset digunakan untuk koleksi feses, plastic sealing untuk tempat feses, label untuk menandai setiap sampel, freezer untuk tempat menyimpan sampel sampai waktu analisis hormon dan ice box untuk membawa sampel feses ke lokasi analisis hormon.
Pada proses ekstraksi digunakan beberapa alat seperti cup film untuk tempat feses yang akan dikeringkan, freeze dryer untuk lyofilisasi, cawan dan penumbuk untuk melakukan pulpurasi, timbangan digital untuk menimbang bubuk feses, tabung sentrifius untuk tempat sampel dan supernatant, mesin vorteks dan sentrifugasi.
Untuk analisis data digunakan alat alat antara lain :
1. Microtiter plate calibrated reader (450 ±10 nm), DRG Instruments Microtiter Plate Reader.
2. Micropipet yang telah dikalibrasi. 3. Kertas absorbent.
4. Timer.
5. Komputer dan Software untuk menghitung data (semi logarithmic graph).
Pelaksanaan Penelitian
1. Persiapan Kandang
Kandang individu terdiri atas tiga unit masing-masing dengan ukuran 2.5 x 7 m. Kontruksi kandang terbuat dari kawat dengan kerangka kayu, lantai kandang tanah. Masing-masing kandang dilengkapi tempat pakan dari kayu menempel pada dinding kandang, tempat minum (denah pada Gambar 3).
Gambar 4: Denah kandang penelitian
Keterangan : = Pintu kandang
= Ember tempat minum
= Anjang-anjang tempat pakan = Tempat sarang melahirkan
2. Seleksi Rusa Betina Bunting
Rusa yang digunakan dalam penelitian ini sebanyak 3 ekor rusa betina bunting. Kebuntingan rusa diperoleh dari perkawinan rusa betina dengan rusa jantan tahap ranggah keras. Rusa dinyatakan bunting apabila tidak menunjukkan estrus kembali (Non Return Rate) setelah dikawinkan selama dua
bulan (tiga kali siklus estrus). Rusa betina yang telah bunting dan memenuhi syarat sebagai hewan percobaan dimasukkan dalam kandang individu.
Cara memasukkan rusa bunting ke dalam kandang diupayakan dengan cara yang tidak menimbulkan stres yaitu memancing rusa menggunakan hijauan di dalam kandang dan dibiarkan masuk satu per satu ke dalam kandang individu. Setelah rusa bunting masuk ke dalam kandang dilakukan labelling pada setiap kandang individu.
3. Pemberian Pakan dan Minum.
Rusa diberi pakan hijauan berupa campuran rumput lapangan dan legume sebanyak 10% (hitungan dalam bahan kering) dari bobot badan rusa. Frekuensi pemberian 2 kali sehari pada pagi dan sore hari. Pemberian konsentrat 2 kali sehari sebanyak 1% dari bobot badan (jumlah konsentrat yang diberikan dihitung berdasarkan bobot badan terakhir penimbangan setiap periodenya). Pemberian air minum dilakukan secara ad libitum. Air minum diganti setiap hari dan tempatnya dicuci dengan bersih.
4.Koleksi Sampel Feses
Sampel feses diambil sekali setiap dua minggu dari masing-masing individu. Sampel diambil dengan pinset panjang dan dimasukkan kedalam plastik kecil dan diberi label. Sampel yang telah diambil kemudian dimasukkan dan disimpan ke dalam freezer dengan suhu kurang lebih - 20OC sampai dilakukannya proses analisis hormon.
5.Ekstraksi Feses
Feses yang telah disimpan di dalam freezer diambil kemudian masing masing dipindahkan ke dalam cup film sebanyak 3 gr untuk selanjutnya dilakukan lyofilisasi selama 72 jam. Setelah sampel kering dilakukan pulpurasi dengan menumbuk sampel sampai halus. Bubuk feses ditimbang dan diambil sebanyak 0,05 gr (berat kering) kemudian dimasukkan ke tabung sentrifius untuk kemudian diekstraksi dengan menggunakan pelarut methanol 80% sebanyak 3 ml. Selanjutnya larutan divorteks selama 15 menit dengan
kecepatan 1.600 rpm kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3.500 rpm selama 10 menit yang dilakukan segera setelah larutan divorteks. Supernatant dituangkan kedalam tabung mikro 1,5 ml, disimpan di dalam freezer dengan suhu -20oC (Monfort et al. 1998) sampai dilakukan analisis dengan menggunakan ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay).
6. Analisis Hormon
Analisis hormon estrogen dan progesteron dengan teknik competitive indirect double antibody dilakukan di Laboratorium Endokrinologi, Unit Rehabilitasi Reproduksi (URR), Institut Pertanian Bogor. Prosedur pengujian hormon estrogen adalah :
a. Dimasukkan plate ke holder frame.
b. Dimasukkan 25 µL standart, control dan sampel dengan disposable tip ke dalam sumuran.
c. Ditambahkan 200 µL estradiol terkonjugasi kedalam setiap sumuran, di campur selama 10 menit.
d. Diinkubasi selama 120 menit pada suhu kamar.
e. Cairan dalam sumur dibuang, dibilas 3 kali dengan menggunakan wash solution (400 µL/sumur), dikeringkan dengan menggunakan kertas adsorbent sampai benar benar sumur bebas dari sisa air.
f. Ditambahkan 100 µL substrat solution pada setiap sumur. g. Diinkubasi selama 15 menit pada suhu kamar.
h. Reaksi dihentikan dengan menggunakan 50 µL stop solution, dibiarkan selama 10 menit.
i. Penyerapan pada dinding sumur dibaca dengan dengan menggunakan microtiter plate reader (450 ± 10 nm).
Analisis hormon progesteron dilakukan pengujian dengan prosedur : a. Dimasukkan plate ke holder frame.
b. Dimasukkan 25 µL standart, control dan sampel dengan disposable tip ke dalam sumuran.
c. Diinkubasi selama 5 menit pada suhu kamar.
d. Ditambahkan 200 µL progesterone terkonjugasi kedalam setiap sumuran, di campur selama 10 menit.
e. Diinkubasi selama 60 menit pada suhu kamar.
f. Cairan dalam sumur dibuang, dibilas 3 kali dengan menggunakan wash solution (400 µL/sumur), keringkan dengan menggunakan kertas adsorbent sampai benar- benar sumur bebas dari sisa air.
g. Ditambahkan 200 µL substrat solution pada setiap sumur. h. Diinkubasi selama 15 menit pada suhu kamar.
i. Reaksi dihentikan dengan menggunakan 100 µL stop solution, dibiarkan selama 10 menit.
j. Penyerapan pada dinding sumur dibaca dengan dengan menggunakan microtiter plate reader (450 ± 10 nm).
Parameter Penelitian 1. Konsentrasi hormon Estrogen (pg/g)
2. Konsentrasi hormon Progesteron (ng/g) 3. Pola kelahiran anak rusa sambar.
Pengambilan data meliputi: 1. Lama proses kelahiran
a. Pengeluaran air ketuban b. Kontraksi pengeluaran fetus c. Pengeluaran plasenta
d. Jarak antara keluarnya anak dengan keluarnya plasenta 2. Perlakuan induk terhadap plasenta
a. Mencium dan menjilat plasenta b. Memakan plasenta
3. Perlakuan induk terhadap anak a. Menjilati tubuh anak b. Membantu anak berdiri
c. Jarak antara keluarnya anak hingga mampu berdiri sendiri 4. Menyusui pertama
a. Jarak waktu antara kelahiran sampai menyusui b. Lama waktu menyusui pertama