3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi, Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi dan Kandang Unit Hewan Laboratorium, Fakultas Kedokteran Hewan IPB, pada bulan Oktober 2009 sampai dengan Juni 2010. 3.2 Hewan Coba dan Pemeliharaannya
Hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih (Rattus norvegicus) betina bunting 1 hari, galur Sprague Dawley. Tikus dikandangkan secara individu dalam bak plastik yang berukuran (40x30x15) cm3 dengan penutup kawat di atas kandang. Kandang dialasi dengan sekam yang diganti 3 hari sekali untuk menjaga kebersihan dan kesehatan. Pemberian minum pada tikus dilakukan ad libitum dan pemberian pakan sesuai perlakuan.
3.3 Metode Penelitian
3.3.1 Pembuatan Ekstrak dan Fraksi Daun Katuk
Pembuatan simplisia, ekstraksi, dan fraksinasi daun katuk dilakukan seperti cara yang dilakukan oleh Suprayogi et al. (2009) yang dapat dilihat pada Gambar 3.
3.3.1.1 Pembuatan Simplisia
Daun katuk segar yang digunakan diperoleh di daerah sekitar Cinangneng, Ciampea Kabupaten Bogor. Daun tersebut dicuci dengan air bersih, kemudian dijemur di bawah sinar matahari sampai layu. Pengeringan dilanjutkan dengan menggunakan oven pada suhu 60ºC selama 12 jam, sehingga dari pengeringan ini diperoleh daun katuk kering.
3.3.1.2 Pembuatan Ekstrak Etanol
Ekstraksi daun katuk dilakukan dengan metode maserasi. Sebanyak 2 kg simplisia dilarutkan dengan 13 L pelarut etanol (EtOH) di dalam panci stenliss. Campuran tersebut diaduk secara manual dengan pengaduk selama 30 menit dan kemudian didiamkan selama 24 jam. Setelah itu dilakukan penyaringan dengan menggunakan kain flanel dan kertas saring. Filtrat hasil penyaringan ini
merupakan ekstrak etanol daun katuk. Kemudian metode yang sama diulang sampai diperoleh larutan ekstrak etanol yang relatif jernih. Ekstrak etanol yang diperoleh dievaporasi menggunakan rotary-evaporator dengan pengaturan temperatur 40ºC. Hasil dari evaporasi ini berupa ekstrak etanol yang kental. 3.3.1.3 Pembuatan Fraksi Heksan
Ekstraksi dilanjutkan untuk memisahkan senyawa nonpolar menggunakan pelarut heksan. Sebanyak 20 g ekstrak etanol dilarutkan dalam 500 mL pelarut etanol, lalu dimasukkan ke dalam gelas separasi. Ke dalam larutan tersebut ditambahkan pelarut heksan sebanyak 500 mL. Setelah itu, campuran larutan tersebut dikocok hingga tercampur sempurna, lalu didiamkan beberapa menit sampai terjadi pemisahan antara kedua larutan yaitu larutan heksan pada bagian atas dan larutan etanol pada bagian bawah. Kedua larutan tersebut dikeluarkan dan ditempatkan pada gelas erlenmeyer yang berbeda. Pencampuran dan pengocokan dilakukan berulang hingga larutan yang menggunakan pelarut heksan tampak jernih. Filtrat yang didapat merupakan larutan ekstrak etanol yang telah bebas senyawa nonpolarnya dan larutan fraksi heksan. Kedua larutan yang diperoleh kemudian dievaporasi sehingga diperoleh fraksi etanol yang telah bebas dari senyawa nonpolarnya dan fraksi heksan dalam bentuk kental.
3.3.1.4 Pembuatan Fraksi Air dan Fraksi Etil asetat
Sebanyak 20 g fraksi etanol yang diperoleh dari fraksinasi sebelumnya dilarutkan dengan air sedikit demi sedikit hingga membentuk larutan fraksi etanol sebanyak 500 mL. Larutan ini dimasukkan ke dalam gelas separasi dan kemudian dicampurkan dengan 500 mL pelarut etil asetat. Larutan tersebut kemudian dikocok hingga tercampur sempurna, kemudian didiamkan selama beberapa menit sampai terjadi pemisahan antara kedua larutan yaitu larutan etil asetat pada bagian atas dan larutan air pada bagian bawah. Kedua larutan tersebut dimasukkan ke dalam gelas erlenmeyer yang berbeda. Pencampuran dan pengocokan dilakukan berulang hingga didapat larutan dengan pelarut etil asetat yang jernih. Filtrat yang didapat kemudian dievaporasikan sehingga didapat fraksi etil asetat dan fraksi air yang kental.
EtOH 13 L Evaporasi
Heksan 500 ml EtOH 500 ml
Evaporasi Evaporasi
Aquades 500 ml Etil asetat 500 ml Evaporasi Evaporasi
Gambar 3 Prosedur fraksinasi ekstrak daun katuk (Suprayogi et al. 2009). 3.3.2 Pembuatan Bubuk Ekstrak dan Fraksi Daun Katuk
Ekstrak kental yang diperoleh dari ekstraksi dan fraksinasi dibuat menjadi bentuk bubuk menurut prosedur Suprayogi et al. (2009). Pembuatan bubuk ekstrak dan fraksi dilakukan dengan menambahkan tepung pada masing-masing ekstrak dan fraksi daun katuk. Pencampuran dilakukan secara merata, sehingga diperoleh konsistensi bubuk ekstrak dan fraksi yang sama. Pencampuran ini menghasilkan persentase ekstrak dan fraksi daun katuk sebagai berikut E-EtOH 25%, F-H 13%, F-H2O 25%, dan F-EtAc 25%. Bubuk ini penting sebagai persiapan pembuatan pakan.
3.3.3 Pembuatan dan Pemberian Pakan
Pembuatan pakan perlakuan dilakukan menurut prosedur Suprayogi et al. (2009). Pakan yang diberikan berbentuk pelet yang dibuat secara manual dengan bahan utama terdiri atas tepung jagung, tepung ikan, bungkil kedelai, premiks, garam, CaCO3, minyak kelapa dan terigu. Hasil pencampuran bahan-bahan utama ini merupakan pakan kontrol. Untuk pakan perlakuan, bahan utama ini ditambahkan dengan bubuk ekstrak dan fraksi daun katuk yang telah disiapkan sebelumnya. Komposisi nutrisi pakan terdiri dari protein kasar, lemak kasar, dan
Daun Katuk Kering Giling
Ekstrak Etanol (E-EtOH)
Fraksi Hexan (F-H) Fraksi Etanol
Fraksi Etil Asetat (F-EtAc) Fraksi Air
energi. Persentase ekstrak dan fraksi yang ada di dalam pakan, hasil analisis proksimat pakan serta dosis ekstrak dan fraksi daun katuk yang dikonsumsi tikus disajikan pada Tabel 5.
Tabel 5 Konsentrasi ekstrak daun katuk dalam pakan, dosis yang dikonsumsi, dan komposisi nutrisi dalam pakan
Kelompok Konsentrasi Ekstrak dan Fraksi Daun Katuk dalam Pakan (%)
Analisa Proksimat Dosis Ekstrak
dan Fraksi Daun Katuk (mg/hari/ekor) Protein Kasar (%) Lemak Kasar (%) Energi (Kal/100 g) Kontrol 0 20,01 6,55 3499 0 E-EtOH 4,53 20,06 6,54 3497 297,5 F-H 0,87 20,03 6,55 3498 57,5 F-H2O 3,22 20,04 6,54 3498 209 F-EtAc 0,45 20,02 6,55 3499 40 Suprayogi et al. 2009 3.3.4 Pelaksanaan Penelitian
3.3.4.1 Pengelompokan Hewan Coba
Hewan coba yang digunakan adalah 33 ekor tikus betina yang terdiri dari 30 ekor betina bunting umur 1 hari kebuntingan (H1) dan 3 ekor betina normal yang pernah bunting dan sudah lepas sapih untuk kelompok normal (N). Sebanyak 30 ekor tikus betina bunting dibagi ke dalam 5 kelompok perlakuan yaitu kelompok kontrol (K), kelompok ekstrak etanol (E-EtOH), kelompok fraksi heksan (F-H), kelompok fraksi air (F-H2O), dan kelompok fraksi etil asetat (F-EtAc) dengan masing-masing kelompok terdiri dari 6 ekor tikus betina bunting. Tiap kelompok perlakuan dibagi lagi menjadi 2 waktu pengambilan sampel yaitu pada 5 hari postpartus dan 10 hari postpartus.
3.3.4.2 Pemberian Pakan Perlakuan dan Pengambilan Sampel
Perlakuan diberikan sejak kebuntingan hari pertama sampai hari ke-10 postpartus. Agar jumlah ekstrak dan fraksi daun katuk yang masuk ke dalam tubuh hewan sesuai dengan yang diinginkan maka tikus diberi makan 2 kali sehari (pagi dan sore). Pada pagi hari, tikus diberi pakan kontrol ad libitum, sedangkan sore hari diberi pakan perlakuan sebanyak 5% dari bobot badan.
Selama kebuntingan hewan coba dibiarkan tidak terusik hingga hari kelahiran. Bila pada kandang ditemukan anak, maka dilakukan perhitungan jumlah anak yang lahir dan hari tersebut dinyatakan sebagai hari 1 postpartus.
Pengambilan sampel uterus dilakukan pada hari ke-5 dan ke-10 postpartus (Gambar 4). Pengambilan sampel uterus dilakukan dengan pembedahan. Sebelum dibedah, tikus dianestesi dengan menggunakan eter. Setelah tikus tersebut mati, bagian abdomen tikus dibuka sampai uterusnya ditemukan. Kemudian uterus tikus diambil dan dibersihkan dari lemak-lemak yang menempel. Setelah itu uterus ditimbang menggunakan timbangan digital.
Keterangan : BU= bobot uterus BI =bobot induk
Gambar 4 Diagram pengambilan data.
3.4 Parameter yang Diukur
Parameter yang diukur meliputi bobot induk yang diukur pada hari pertama kebuntingan (H1), jumlah anak yang dilahirkan, bobot induk setelah melahirkan, bobot induk sebelum dibedah pada hari ke-5 dan ke-10 postpartus, serta bobot uterus pada hari ke-5 dan ke-10 postpartus.
3.5 Pengolahan Data
Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan Uji Sidik Ragam (ANOVA) dengan Rancangan Acak Lengkap, dan jika terdapat perbedaan yang nyata dilanjutkan dengan uji lanjut (Duncan Test).