Waktu dan Tempat
Penelitian dilakukan pada Oktober 2006 sampai dengan Maret 2007. Penelitian dilaksanakan di Kebun Percobaan Ilmu dan Teknologi Benih Institut Pertanian Bogor, Leuwikopo Kecamatan Dramaga, Kabupaten Bogor, Jawa Barat. Analisis bahan bioaktif dilaksanakan di Laboratorium BALITRO dan BB- BIOGEN.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah tanaman jambu biji asal Sukabumi berumur sembilan bulan yang berasal dari biji (Gambar 2). Daun jambu biji dan bahan- bahan penunjang laboratorium untuk analisis kandungan bahan bioaktif secara kualitatif dan kuantitatif. Alat yang digunakan adalah polybag ukuran 60 cm x 60 cm, timbangan, gunting pangkas, oven, sprayer alat-alat penunjang laboratorium untuk analisis kandungan bahan bioaktif secara kualitatif dan kuantitatif.
(a) (b)
Metode
Penelitian menggunakan rancangan petak terpisah (split plot design) dengan perlakuan tinggi pangkasan (T) yang ditempatkan dalam petak utama dan dosis pupuk nitrogen (N) dalam anak petak.
Petak utama terdiri atas tiga taraf tinggi pangkasan: T1 = Tinggi pangkas 50 cm
T2 = Tinggi pangkas 75 cm T3 = Tinggi pangkas 100 cm
Anak petak terdiri atas empat taraf dosis pupuk nitrogen: N0 = 0 g urea/tanaman
N1 = 90 g urea/tanaman N2 = 180 g urea/tanaman N3 = 270 g urea/tanaman
Dengan demikian terdapat 12 kombinasi perlakuan. Setiap perlakuan diulang sebanyak 3 kali sehingga diperoleh 36 unit percobaan (Lampiran 1). Setiap unit percobaan terdiri dari 4 tanaman.
Model matematika untuk rancangan yang digunakan adalah : Yijk= μ + Ti + βj + δ ij + Nk + (TN)ik + εijk, dimana
Yijk : nilai pengamatan pada perlakuan petak utama ke-i, anak petak ke-j, ulangan ke-k
μ : rata-rata hasil pengamatan untuk setiap satuan percobaan Ti : nilai tambah karena pengaruh tinggi pangkasan pada taraf ke-i
βj : nilai tambah karena pengaruh ulangan ke-j
δ ij : pengaruh galat petak utama (tinggi pangkasan)
Nk : nilai tambah karena pengaruh pemupukan N pada taraf ke-k
(TN)ik : nilai tambah karena pengaruh interaksi petak utama ke-i dengan anak petak ke-k
εijk : pengaruh galat anak petak (dosis pupuk N) i : 1, 2, 3 untuk tinggi pangkasan
j : 1, 2, 3 untuk ulangan
12
untuk perlakuan yang berpengaruh nyata dilakukan uji Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) pada taraf kesalahan 5 %.
Pelaksanaan Penelitian
Pelaksanaan penelitian terdiri dari pelaksanaan di lapang dan di laboratorium. Bagan alir pelaksanaan penelitian dapat dilihat pada Gambar 3. Pembibitan
Pembibitan dilakukan pada bulan Desember 2005, media yang digunakan saat pembibitan adalah tanah dan pupuk kandang dengan perbandingan 1 : 1. Periode pembibitan ini dilakukan dengan dua tahap. Pada tahap satu pembibitan dilakukan pada polybag ukuran 15 cm x 15 cm yang berisi 1 benih/polybag. Bibit tanaman jambu biji ditumbuhkan sampai umur 3 bulan. Pada tahap berikutnya tanaman dipindah pada polybag dengan ukuran 30 cm x 30 cm dan dibiarkan tumbuh sampai umur 3 bulan. Pemindahan ini dilakukan dengan tujuan agar perkembangan akar optimal yang akan mendukung pertumbuhan tanaman.
Penanaman
Penanaman dilakukan setelah tanaman berumur sembilan bulan setelah semai. Bibit tanaman ditanam pada polybag ukuran 60 cm x 60 cm. Media tanam yang digunakan adalah tanah dan pupuk kandang dengan perbandingan 1 : 1. Peletakan polybag perlakuan berjarak 2 m x 2 m satu dengan lainnya.
Pemeliharaan
Pemeliharaan tanaman yang dilakukan meliputi penyiraman, penyiangan gulma, pemberantasan hama dan penyakit. Selama masa pemeliharaan ini perlakuan diterapkan yaitu berupa pemangkasan dan pemupukan nitrogen. Perlakuan pemangkasan dilakukan pada saat tanaman berumur 1 bulan setelah tanam (1 BST), sedangkan pemupukan nitrogen dilakukan setelah pemangkasan sesuai dengan dosis perlakuan untuk merangsang pertumbuhan tanaman.
Panen dan Pasca Panen
Pemanenan dilakukan pada saat tanaman telah berumur lima bulan setelah pemangkasan dilakukan. Pemanenan meliputi pemanenan bioamassa batang dan daun dengan menyisakan batang sesuai dengan perlakuan tinggi pangkas. Batang dan daun-daun yang dipanen kemudian dipisahkan menjadi kelompok-kelompok
menurut perlakuan untuk analisis kandungan bahan bioaktif daun jambu biji. Analisis kandungan bahan bioaktif daun jambu biji dilakukan menggunakan tahapan-tahapan pelaksanaan di laboratorium.
Pengamatan
Pengamatan meliputi variabel pertumbuhan dan produksi tanaman. Peubah pertumbuhan
1. Pertambahan tinggi tanaman (cm), diukur dari batas ajir yang telah ditentukan (5 cm dari permukaan tanah) sampai dengan titik tumbuh tertinggi daun yang diluruskan ke atas. Diamati setiap dua minggu.
2. Pertambahan diameter batang (mm), diukur dengan menggunakan jangka sorong pada tiga titik yaitu batang utama bawah, batang tengah dan batang atas. Diamati setiap dua minggu.
3. Jumlah cabang, merupakan jumlah cabang yang tumbuh pada batang utama. Diamati setiap dua minggu.
4. Laju Tumbuh Relatif (LTR) dan Laju Asimilasi Bersih (LAB)
Pengukuran Laju Tumbuh Relatif dan Laju Asimilasi Bersih sebagai berikut:
1 2 1 2 T - T W ln W ln ) g/hari ( = − LTR 1 2 1 2 1 2 1 2 2 T - T A ln A ln A A W W ) /har g/cm ( − − − = x i LAB
dimana LTR = Laju Tumbuh Relatif (g/hari) LAB = Laju Asimilasi Bersih (g/cm2/hari)
T1 = Waktu pengamatan awal T2 = Waktu pengamatan akhir
W1 = Bobot kering total pada waktu T1 W2 = Bobot kering total pada waktu T2
A1 = Masing-masing luas daun total pada waktu T1 A2 = Masing-masing luas daun total pada waktu T2
14
Peubah produksi
1. Bobot basah daun, merupakan hasil pengukuran bobot daun yang belum dikeringkan setelah dipanen. Diukur dalam satuan g.
2. Bobot basah batang, merupakan bobot basah cabang yang dipanen daunnya yang belum dikeringkan setelah dipanen. Diukur dengan satuan g.
3. Bobot kering daun, merupakan hasil pengukuran bobot daun yang telah dikeringkan pada suhu 1050 C selama 24 jam setelah dipanen. Diukur dalam satuan g.
4. Kandungan N daun, dilakukan melalui analisis daun di laboratorium dengan metode Kjedhal. Diamati setelah panen.
5. Analisis kandungan bioaktif secara kualitatif dan kuantitatif dilakukan setelah pemanenan total dan setelah mengalami proses pengeringan.
Analisis kualitatif
Uji kualitatif digunakan untuk mengetahui apakah daun jambu biji mengandung senyawa bioaktif tanpa mengetahui jumlahnya secara kuantitatif. Prosedur analisis pengujian pada senyawa bioaktif secara kualitatif yang dilaksanakan pada laboratorium analitik sebagai berikut (Harborn , 2000):
1. Pembuatan ekstrak : 10 g sampel kering yang sudah dihaluskan lalu direndam dalam 100 ml metanol selama 24 jam. Kemudian ekstrak disaring dan diuapkan dengan alat rotavapor (30o – 40oC) hingga didapatkan residunya. 2. Pengujian alkaloid : 2 mg residu yang telah diekstrak lalu ditambahkan 10 ml
kloroform-amoniak dan disaring. Larutan hasil dari saringan (filtrat) ditambah beberapa tetes H2SO4 2 M kemudian dikocok sampai terbentuk 2 lapisan yaitu lapisan keruh dan lapisan tidak berwarna. Lapisan tidak berwarna diambil dengan pipet menjadi 2 bagian. Pada masing-masing tabung ditambahkan beberapa tetas reagen Dragendorf dan Mayer. Uji positif alkaloid bila menghasilkan endapan berwarna jingga setelah ditambahkan reagen Dragendorf dengan dan putih kekuningan untuk Mayer.
3. Pengujian triterpenoid : 2 mg residu yang telah diekstrak lalu dilarutkan ke dalam dietil eter sampai larut. Setelah larut ditambahkan pelarut Liebermann- Buhard (3 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes H2SO4 pekat). Bila dihasilkan
warna hijau menandakan positif adanya steroid, sedangkan warna merah atau ungu, positif adanya triterpenoid.
4. Pengujian flavonoid, saponin dan tanin : 2 mg residu yang telah diekstrak lalu ditambahkan aquades secukupnya, kemudian pisahkan 3 ml filtrat ke dalam 3 tabung reaksi. Tabung pertama ditambahkan logam Mg, beberapa tetes HCl pekat dan larutan amil alkohol, kemudian kocok apabila timbul warna kuning kemerahan pada fraksi amil alkohol menandakan uji positif flavonoid. Pada tabung kedua dilakukan uji saponin dengan dilakukan pengocokan secara vertikal, bila timbul busa yang stabil setinggi + 1 cm selama 10 menit menandakan adanya positif saponin. Sisa campuran tadi lalu saring. Filtrat ditambahkan beberapa ml larutan FeCl3 1 %. Timbulnya warna biru tua atau kehitaman menunjukkan positif tanin.
Kriteria penilaian bahan bioaktif secara kualitatif dengan uji fitokimia ditunjukkan pada Tabel 1.
Tabel 1. Kriteria penilaian kandungan bioaktif dengan uji fitokimia
Senyawa Dasar penilaian Penilaian
Alkaloid Jumlah pereaksi 1 tetes :4+ 2 tetes : 3+ 3 tetes :2+ 4 tetes :1+ Steroid Perubahan warna
biru/hijau
Tua : 3 + Sedang : 2+ Muda : 1+ Triterpenoid Perubahan warna
merah/ungu
Tua : 3 + Sedang : 2+ Muda : 1+ Saponin Pembentukan
lapisan busa
3 cm : 3+ 2 cm : 2+ 1 cm : 1+
Flavonoid Jumlah pereaksi 1 tetes :4+ 2 tetes :3+ 3 tetes: 2+ 4 tetes :1+ Tanin Jumlah pereaksi 1 tetes :4+ 2 tetes :3+ 3 tetes: 2+ 4 tetes :1+ Keterangan : 4+ = sangat tinggi, 3+/ 3cm = tinggi , 2+/ 2 cm = sedang, 1+/ 1 cm = rendah
Analisis kuantitatif
Prosedur pelaksanaan di laboratorium melalui proses ekstraksi dengan menggunakan metode maserasi, pemisahan fraksi senyawa menggunakan kromatografi lapis tipis dan spektrofotometer UV.
1. Ekstraksi Maserasi
Daun jambu biji sebanyak 1 000 g dikeringkan pada suhu 1050 C selama 24 jam kemudian dimaserasi dengan metanol (15 l) selama satu malam dalam erlenmeyer menggunakan bantuan shaker. Ekstrak kemudian disaring dan
16
dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 400 C untuk menghilangkan pelarut sampai volumenya + 1/10 volume semula. Proses maserasi, penyaringan, dan pemekatan dilakukan berulang-ulang sampai ekstrak yang dihasilkan tidak berwarna. Ekstrak yang diperoleh digabung dan dinamakan ekstrak kasar metanol.
2. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Analisis dengan KLT bertujuan mencari eluen yang cocok untuk pemisahan komponen aktif dalam daun jambu biji. Fase diam pada analisis ini digunakan lempeng silika gel. Jenis eluen, yang merupakan fase gerak, digunakan berdasarkan hasil analisis kualitatif. Elusi dilakukan menggunakan pelarut polar hingga non polar. Pelarut-pelarut yang memiliki pola pemisahan yang baik dikombinasikan dengan satu dengan yang lain dengan perbandingan tertentu. Hasil analisis diperiksa menggunakan lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Hasil eluen terbaik kemudian digunakan pada kromatografi kolom. Hasil yang diperoleh dari kromatografi kolom kemudian diuji menggunakan spektrofotometer UV
Gambar 3. Bagan Alir Pelaksanaan Penelitian Penanaman
Bibit jambu biji yang telah berumur 9 bulan ditanam pada polybag ukuran 60 cm x 60 cm dengan media tanah : pupuk kandang 1 : 1
dengan jarak tanam 2 m x 2 m
Pengamatan
Dilakukan pengamatan pertumbuhan dan pengamatan setelah panen
Pengamatan pertumbuhan meliputi pengukuran tinggi tanaman, diameter batang, jumlah cabang dilakukan setiap 2 minggu sekali dan LTR, LAB dilakukan
di akhir panen
Pengamatan setelah panen meliputi pengukuran bobot basah daun dan batang, bobot
kering batang dan daun, analisis N, analisis bioaktif
Analisis data menggunakan rancangan petak terpisah (split plot design) dan DMRT
Pemeliharaan
Meliputi kegiatan penyiraman, penyiangan gulma, pemberantasan HPT. Perlakuan pemangkasan saat tanaman telah berumur 1 bulan setelah
pindah tanam dilanjutkan dengan pemupukan N Pembibitan
Dilakukan pada polybag ukuran 15 cmx 15 cm dengan media tanah : pupuk kandang 1 : 1, setelah berumur 6 bulan bibit dipindah pada