BAHAN DAN METODE

Sampel Udang Windu Penaeus monodon

Udang windu P. monodon berukuran 10,1-74,4 g dikoleksi dari beberapa tambak udang di Sulawesi Selatan, termasuk dari tambak yang telah terserang penyakit virus bintik putih (white spot syndrome virus, WSSV). Sampel udang dikoleksi secara hidup dan selanjutnya dibawa ke Laboratorium Bioteknologi, Balai Riset Perikanan Budidaya Air Payau (BRPBAP) Maros untuk pengambilan otot (daging) udang secara aseptik sebagai bahan untuk ekstraksi DNA genom.

Ekstraksi DNA Genom

DNA genom udang windu diekstraksi dengan menggunakan metode fenol-kloroform yang telah dikembangkan pada ikan kerapu (Parenrengi et al. 2000) dengan sedikit modifikasi. Sebanyak 20-25 mg daging udang diambil secara aseptik dan dimasukkan ke dalam tabung steril 1,5 mL. Sampel ditambahkan dengan 250 µL buffer lisis (0,5 M NaCl; 0,001 M EDTA; 1% SDS; 0,8% Triton-X; dan 0,1 Tris-HCl pada pH 9,0) kemudian 40 µL 10% SDS dan 40 µL Proteinase K (larutan 20 mg/mL). Sampel diinkubasi pada suhu 55^oC selama 1-3 jam sampai lisis sempurna. Kemudian sampel ditambahkan 25 µL RNase (larutan 20 mg/mL) dan dibiarkan pada suhu ruangan selama 15-30 menit. Sampel ditambahkan 500 µL fenol:kloroform:isoamil-alkohol (25:24:1) dan selanjutnya dihomogenkan dengan vorteks. Sampel dibiarkan pada suhu ruangan selama 10 menit sebelum disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 4 menit. Supernatan yang terbentuk dipindahkan ke tabung mikro baru, kemudian ditambahkan lagi 500 µL fenol:kloroform:isoamil-alkohol (25:24:1) dan disentrifugasi kembali pada kecepatan 13.000 rpm selama 4 menit. Supernatan ditambahkan dengan satu kali volume kloroform:isoamil-alkohol (24:1) dan selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit. Supernatan dipresipitasi dengan etanol absolut dingin dengan membolak-balikkan tabung mikro kemudian disentrifugasi pada kecepatan 6.000 rpm selama 30 menit. Pelet yang terbetuk dicuci dengan 1 mL etanol 70% dan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 6.000 rpm selama 15 menit. Pelet DNA dikering-udarakan sekitar 20 menit, kemudian ditambahkan dengan 50 µL sterile distilled water (SDW) agar pelet DNA dapat larut sempurna dan selanjutnya disimpan dalam freezer (suhu -20oC) sampai digunakan untuk peroses selanjutnya.

Kualitas dan kuantitas DNA genom hasil isolasi dapat diketahui melalui analisis kemurnian dan kandungan DNA dengan menggunakan UV-spektrofotometer. Kemurnian genom hasil ekstraksi selain dianalisis secara kualitatif dengan metode elektroforesis juga diukur secara kuantitatif melalui metode UV-spektrofotometer pada rasio absorpsi 260 nm dan 280 nm (OD260/OD280). Sedangkan konsentrasi genom DNA dihitung berdasarkan rumus Linacero et al. (1998). Kualitas DNA genom hasil ekstraksi dilihat melalui

analisis eletroforesis pada gel agarosa 0.7%. Skema ekstrkasi DNA genom udang windu menggunakan metode fenol-kloroform disajikan pada Lampiran 1.

Isolasi Promoter

Isolasi promoter antivirus ProAV dilakukan dengan menggunakan teknik PCR. DNA genom yang telah diisolasi dari udang windu digunakan sebagai cetakan DNA (templat) pada proses PCR. Metode isolasi promotor mengacu pada metode yang telah dikembangkan oleh Luo et al. (2007), dengan menggunakan primer forward ProAV-F: 5’- gtc gga tcc agt ccc aca ctc cat caa -3’ dan primer reverse ProAV-R: 5’- ctg gga tcc ctg aaa gga ata tta ata tct tg -3’. Kedua primer tersebut dilengkapi dengan situs restriksi BamHI (nukleotida yang digarisbawahi) untuk membantu proses kloning ke dalam vektor ekspresi. Amplifikasi fragmen promoter dilakukan pada mesin PCR GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystem). Reaksi PCR yang digunakan adalah kit PureTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healtcare) dan primer masing-masing 1 uL (50 ρmol/µL) serta SDW untuk mencapai volume akhir 25 µL. Kit tersebut mengandung 2,5 unit Taq Polimerase; 10 mM Tris-HCl pH 9; 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl2; dan 200 μM setiap dNTP-mix.

Proses PCR dijalankan pada suhu pre-denaturasi 94^oC selama 3 menit; 35 siklus untuk (denaturasi 94^oC selama 1 menit, annealing 56^oC selama 45 detik, ekstensi 72oC selama 1 menit); dan final ekstensi 72oC selama 5 menit. Untuk mengetahui keberhasilan isolasi promoter, hasil PCR dielektroforesis pada gel agarose 1,0% untuk melihat pita tunggal yang terbentuk pada gel. Fragmen DNA pada gel agarosa didokumentasi dengan Gel Documentation System (Biometra). Untuk menentukan berat molekul fragmen DNA digunakan marker VC 100bp Plus DNA Ladder (Vivantis).

Kloning Promoter

Purifikasi Promoter. Purifikasi fragmen DNA promoter dilakukan dengan menggunakan kit GF-1 Gel DNA Recovery (Vivantis) sesuai dengan manual kit yang digunakan. Fragmen DNA yang telah dipotong dari gel dicampur

dengan buffer GB dengan rasio 1:1, kemudian diinkubasi pada suhu 50^oC sampai gel larut sempurna. Larutan ditransfer ke kolom spin dalam tabung mikro, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit. Kolom selanjutnya dicuci dengan 750 µL wash buffer, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit atau sampai kering. Kolom dipindahkan ke tabung mikro baru, kemudian ditambahkan 30-50 µL elution buffer dan diinkubasi selama 2 menit di suhu ruang, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit. Skema purifikasi fragmen DNA dari gel agarosa menggunakan kit GF-1 Gel DNA Recovery dapat dilihat pada Lampiran 2.

Ligasi Promoter ke Vektor pGEM-T Easy. Fragmen DNA hasil purifikasi dari promoter yang telah berhasil diisolasi, disisipkan ke dalam vektor kloning T Easy (Promega) mengikuti prosedur manufaktur. Vektor pGEM-T Easy dan control insert DNA disentrifugasi agar kandungannya terkumpul pada dasar tabung, selanjutnya reaksi ligasi dicampur pada tabung mikro dengan komposisi: 1,3 µL 2 x rapid ligase buffer; 0,5 µL vektor pGEM-T Easy (50 ng); 1 µL T4 DNA ligase (3 unit/µL); produk PCR sebanyak 5 µL; dan SDW 5,2 µL. Inkubasi dilakukan selama dua jam pada suhu ruang dan dilanjutkan dengan diinkubasi semalam di dalam refrigerator (suhu berkisar 4 ^oC).

Pembuatan Bakteri Kompeten Escherichia coli DH5α. Sebuah koloni bakteri E.coli DH5α diambil dari biakan murni dan dikultur dalam 25 mL media cair Luria Bertani (LB) (1% tripton; 0,5% ekstrak khamir; dan 1% NaCl) dalam tabung 50 mL sebagai sub kultur dan selanjutnya diinkubasi pada inkubator bergoyang pada suhu 37oC selama 16-18 jam dengan kecepatan 250 rpm. Hasil sub kultur sebanyak 2,5 mL (1%) dimasukkan ke dalam erlenmeyer 25 mL yang mengandung media cair LB dan selanjutnya diinkubasi pada inkubator bergoyang pada suhu 37^oC selama 3 jam. Kultur bakteri langsung diletakkan di atas es selama 30 menit. Sebanyak 1,5 mL dimasukkan ke dalam tabung mikro 1,5 mL kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5.000 rpm selama 2 menit pada suhu 4^oC. Setelah supernatan dibuang, pelet ditambahkan lagi 1,5 mL cairan kultur bakteri dan selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 5.000 rpm selama 2 menit. Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan buffer NaCl2 dingin. Larutan disentrifugasi dengan kecepatan 5.000 rpm selama 2 menit pada suhu 4^oC.

Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan 1 mL CaCL2 dingin, selanjutnya diinkubasi pada suhu ruangan selama 20 menit. Larutan disentrifugasi dengan kecepatan 5.000 rpm selama 2 menit pada suhu 4^oC dan supernatan yang terbentuk dibuang, dan pelet disuspensi dengan 200 µL CaCl2 dingin yang kemudian diinkubasi di es selama 20 menit sampai 1 jam. Bakteri yang tersuspensi siap untuk digunakan untuk transformasi.

Transformasi. Transformasi vektor kloning ke bakteri dilakukan dengan menggunakan bakteri kompeten E. coli DH5α yang telah dibuat sebelumnya. Sebanyak 4-5 µL hasil reaksi ligasi dicampur ke dalam tabung mikro yang telah berisi 200 µL bakteri kompeten dan selanjutnya diinkubasi dalam es selama 20-30 menit. Campuran tersebut diberi kejutan panas pada suhu 42^oC selama 45 detik, kemudian diletakkan dalam es selama 2 menit. Hasil kejutan panas ditambahkan 800 uL larutan SOC yang mengandung 970 µL buffer SOB (2 g tripton; 0,5 g ekstrak kamir; 1 mL NaCL 1 M; 0,25 mL KCl 1 M; dalam 97 mL SDW); 10 µL MgSO4.7H2O; 10 µL MgCl2.6H2O; dan 10 µL glukosa 1M, yang selanjutnya diinkubasi pada suhu 37^oC pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 200 rpm selama 1,5 jam. Sekitar 100-150 µL bakteri tersebut disebar pada media selektif 2xYT (1,6% tripton; 1% ekstrak khamir; 0,5% NaCl; dan 1,8% bakto agar dalam SDW) yang mengandung ampisilin 1 µL/1 mL agar (100 mg/mL); IPTG (isopropanoltio-β-D-galaktopiranosida) 0,1M (10 µL/cawan); dan 2% X-gal (50 µL/cawan). Biakan bakteri diinkubasi pada suhu 37^oC selama sekitar 14 jam. Untuk menyeleksi adanya insersi gen dalam plasmid pada situs pengklonan (multiple cloning site, MCS), bakteri yang mengandung plasmid akan membentuk koloni berwarna putih, sedangkan bakteri yang mengandung plasmid tetapi di dalam MSC-nya tidak tersisipi fragmen DNA akan menghasilkan koloni warna biru (lihat Lampiran 3). Bakteri yang tidak mengandung plasmid akan mati (tidak membentuk koloni). Koloni bakteri warna putih yang tumbuh diperbanyak dalam medium LB yang mengandung antibiotik ampisilin (100 µg/mL) dan diinkubasikan pada suhu 37^oC untuk dipersiapkan dalam perbanyakan plasmid.

Identifikasi Transforman

Cracking Bakteri. Seleksi koloni bakteri yang membawa plasmid hasil

ligasi dilakukan dengan metode cracking. Koloni bakteri warna putih diambil menggunakan tusuk gigi steril dan dioleskan ke dasar tabung mikro 1,5 mL dan dilanjutkan dengan menggoreskannya ke dalam master plate, yang merupakan sumber koloni bakteri untuk tahap penelitian berikutnya. Master plate berisi bakteri diinkubasi pada suhu 37oC selama 8 jam. Ke dalam tabung mikro yang berisi bakteri ditambahkan 10 μL buffer cracking (0,2 g sakarosa; 40 µL NaOH 5 M; 50 µL SDS 10%; dan sisanya SDW sehingga volume larutan menjadi 1 mL), 10 μL larutan EDTA 10 mM. Gabungan campuran larutan antara 2 µL 6 X buffer loading DNA dengan KCl 4 M dengan perbandingan volume 1:1 diletakkan di bagian dalam penutup tabung mikro. Setelah diinkubasi sekitar 5 menit, larutan di-spin down pada kecepatan 5.000 rpm selama 3 detik dan kemudian divorteks. Larutan disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4^oC. Sebanyak 10 µL supernatan yang terbentuk digunakan untuk elektroforesis menggunakan gel agaroasa 0,7%. Untuk mengetahui koloni bakteri yang membawa DNA dalam plasmid, bakteri biru digunakan sebagai kontrol. Ukuran DNA plasmid koloni bakteri yang membawa insersi akan lebih besar dibandingkan dengan kontrol.

Teknik PCR. Klon-klon bakteri yang memperlihatkan indikator positif pada uji cracking dilanjutkan dengan uji konfirmasi fragmen DNA yang terinsersi melalui teknik PCR, dengan menggunakan primer ProAV-F dan ProAV-R dimana templat DNA yang digunakan adalah larutan hasil cracking sebanyak 0,5 μL. Amplifikasi fragmen DNA target gen dilakukan seperti yang dijelaskan dalam isolasi promoter sebelumnya. Klon-klon bakteri rekombinan yang positif membawa promoter antivirus digoreskan ke dalam media agar yang mengandung ampisilin (100 µg/mL) untuk dikoleksi sebagai sumber plasmid untuk kegiatan selanjutnya. Skema pelaksanaan kloning promoter antivirus ProAV pada vektor pGEM-T Easy disajikan pada Lampiran 4.

Penderetan Nukleotida Promoter

Isolasi Plasmid. Plasmid pGEM-T Easy yang mengandung promoter antivirus ProAV diisolasi dari bakteri E. coli dengan menggunakan kit GF-1 Plasmid DNA Extraction Kit (Vivantis) dengan prosedur yang sesuai dengan manual kit yang digunakan. Satu koloni bakteri yang mengandung plasmid rekombinan ditumbuhkan di dalam 10 mL media LB (10 g/L tripton, 5 g/L ekstrak khamir, 10 g/L NaCl, pH 7,5) yang mengandung ampisilin 100 mg/L pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 250 rpm pada suhu 37^oC selama semalam (sekitar 16-18 jam). Bakteri diendapkan dalam tabung mikro secara bertahap dengan sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4^oC selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet dilarutkan dengan 250 μL larutan S-1, kemudian divorteks pelan atau pipeting sampai pelet larut sempurna. Suspensi larutan ditambah dengan 250 μL larutan S-2 kemudian dicampur dengan pelan dengan cara tabung mikro dibolak-balik selama 4-6 kali dan diinkubasi di suhu ruangan tidak lebih dari 5 menit. Larutan dinetralkan dengan penambahan 250 μL buffer NB (neutralizing buffer) dan dicampur dengan pelan dengan cara tabung mikro dibolak-balik selama 6-10 kali kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipindah ke kolom spin dan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit. Kolom spin dicuci dengan 700 μL wash buffer kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit. Plasmid DNA diresuspensi dengan 100 μL SDW dan dibiarkan selama 1 menit, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit untuk melarutkan DNA, dan selanjutnya disimpan dalam freezer -20^oC untuk digunakan pada tahap selanjutnya. Kuantitas dan kualitas isolat plasmid diukur dengan menggunakan UV-VIS spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm seperti yang dijelaskan pada tahapan ekstraksi DNA genom sebelumnya. Skema isolasi DNA plasmid dengan menggunakan kit GF-1 Plasmid DNA Extraction disajikan pada Lampiran 5.

Penderetan Sekuen Nukleotida. Hasil PCR promoter gen antivirus ProAV dari plasmid dipurifikasi dengan menggunakan kit Gel/PCR DNA Fragment Extraction (Geneaid). Secara singkat, potongan gel agarosa ditambah dengan 500 µL buffer DF kemudian divorteks, dan selanjutnya diinkubasi pada

suhu 55^oC selama 10-16 menit sampai agarosa larut sempurna. Sebanyak 700 µL larutan sampel dipindahkan ke kolom DF, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit. Kolom DF ditambahkan dengan 600 µL wash buffer, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit. Setelah larutan dibuang, kolom DF ditempatkan ke dalam tabung mikro baru, dan disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit. DNA dilarutkan dengan menambahkan 50 µL SDW kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit. Amplifikasi PCR untuk sekuensing dilakukan dengan menggunakan campuran larutan (3 µL 5 X buffer sekuensing, 2 µL primer (1,6 ρmol/µL), 1 µL Big Dye, 4 µL templat DNA) dengan program PCR adalah suhu 96^oC selama 2 menit, 96^oC selama 10 menit, 55^oC selama 5 menit, dan 60^oC selama 4 menit. Hasil PCR dipurifikasi dengan menambahkan 10 µL air bebas DNA dan RNA, dan 5 µL EDTA 125 mM, 5 µL natrium asetat 3 M, 60 µL etanol absolut. Sampel diinversi sebanyak 4 kali dan diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm selama 30 menit. Supernatan dibuang dan pelet ditambah dengan 70 µL etanol 70%, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm selama 30 menit. Setelah supernatan dibuang, pelet dikering-anginkan dan kemudian dilarutkan dengan 10 µL air bebas DNA dan RNA. Sampel selanjutnya siap untuk disekuensing dengan menggunakan alat sekuenser automatis AB-3130 (Applied Biosystem). Hasil sekuensing dilihat secara manual dengan menggunakan program sequence navigator.

Analisis Data

Untuk mengetahui kemiripan (similaritas) promoter yang dihasilkan, sekuen promoter disejajarkan (alignment) dengan sekuen promoter yang telah ada di dalam Bank Gen dengan menggunakan program BLAST-N (basic local alignmen search tool-nucleotide). Sekuen promoter hasil penderetan dianalisis dengan menggunakan program Genetyx Versi 7 (Genetyx Coorporation) untuk mendapatkan similaritas sekuen, motif faktor transkripsi (regulator), dan keberadan sekuen spesifik promoter antivirus. Data hasil analisis disajikan secara deskriptif.