Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Juni 2005 sampai Desember 2006 di Kandang Hewan Percobaan, Laboratorium Terpadu, Laboratorium Bakteriologi, Laboratorium Produksi Bahan Biologis dan Imunologi Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Metode Penelitian
Preparasi Antigen S. Enteritidis
Bakteri S. Enteritidis rujukan ATCC 130706 dan lokal 821/94 ditumbuhkan pada media BHI dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 18 jam. Suspensi disentrifugasi pada kecepatan 10 000 rpm selama 10 menit. Pelet diresuspensikan dengan 5 ml NaCl fisiologis, disentrifugasi pada 10 000 rpm 10 menit, dilakukan 2 kali. Pelet dilarutkan dalam 5 ml NaCl fisiologis, dihomogenkan dan diukur pada Ȝ 620 nm dengan transmisi 10% konsentrasi selnya untuk menentukan kandungan bakteri 109 sel/ml. Suspensi diinaktifkan dalam penangas air pada suhu 56 oC selama 60 menit, didinginkan dan siap digunakan sebagai vaksin untuk memproduksi antibodi.
Produksi Antibodi
Ayam petelur Single Comb Brown Leghorn berumur 24 minggu diinjeksi dengan 0.5 ml (109sel/ml) suspensi S. Enteritidis secara intravena (Carlander 2002) selama tiga hari berturut-turut. Kemudian dilanjutkan dengan menyuntik 1 ml (109sel/ml) suspensi S. Enteritidis dalam Freund’s adjuvant complete pada minggu II , serta 1 ml (109sel/ml) suspensi S. Enteritidis dalam Freund’s adjuvant incomplete pada minggu III dan IV secara intramuskular (Wibawan & Laemmler 1992). Satu minggu setelah penyuntikan terakhir dilakukan panen serum dan keberadaan antibodi diuji dengan uji Agar Gel Prepisipitasi (AGP). Telur-telur yang memiliki antibodi terhadap S. Enteritidis dikoleksi dan disimpan dalam suhu 4 oC.
Persiapan Antigen Untuk Uji Agar Gel Presepitasi (AGP)
Bakteri S. Enteritidis ditumbuhkan pada media BHI, diinkubasi pada suhu 37 oC selama 18 jam. Suspensi disentrifugasi pada kecepatan 10 000 rpm selama
10 menit. Pelet diresuspensikan dengan 5 ml NaCl fisiologis, disentrifugasi pada 10 000 rpm dilakukan 2 kali. Pelet dicuci, ditambah 0.5 ml HCl 0.2 N dan
ditangas dalam penangas air dengan suhu 56 oC selama 1 jam. Kemudian ditambah satu tetes phenol red dan ditambah NaOH 1 N hingga berwarna merah. Suspensi disentrifugasi pada 10 000 rpm selama 10 menit, dilakukan 2 kali. Supernatan digunakan sebagai antigen (Wibawan & Laemmler 1992).
Pengujian IgY anti S. Enteritidis dengan Uji AGP
Agar dibuat dengan melarutkan 0.4 g agarose dan 1.2 g Poly Ethylene Glycol 6000 dalam 20 ml akuades dan 25 ml PBS 0.5 M pH 7.4. Campuran dididihkan pada suhu 70 sampai 80 oC hingga larut. Campuran dipipet sebanyak 3.75 ml, dituangkan pada gelas obyek dan ditunggu sampai mengeras. Kemudian dibuat sumur-sumur dengan puncher. Pada sumur tengah dimasukkan antigen (25 ȝl) dan 25 ȝl antibodi (IgY) dari serum pada sumur sekelilingnya. Gelas obyek diletakkan di atas kertas saring basah agar terjaga kelembabannya. Reaksi dibaca setelah 18 sampai 48 jam, reaksi positif ditunjukkan dengan adanya garis prepisitasi pada daerah antigen tersebut.
Ekstraksi IgY dari Kuning Telur Ayam
Kuning telur dipisahkan dari bagian putih telur, dan dicuci dengan air deionisasi. Kuning telur diletakkan di atas kertas saring untuk menghilangkan putih telur yang melekat. Membran kuning telur dilubangi dengan cara diangkat dengan pinset, cairan kuning telur ditampung pada gelas beaker dan dilarutkan secara perlahan dalam milli-Q pH 4. Setelah homogen ditambahkan lagi milli-Q pH 2 hingga pH suspensi 5.0 sampai 5.2 dan diinkubasi pada suhu 4 oC minimal 12 jam. Suspensi disenrifugasi dengan kecepatan 4 880 rpm pada suhu 4 oC selama 20 menit dan supernatan diambil (Water Soluble Fractination) serta dikembalikan hingga pH 7.5.
WSF dipekatkan dengan PEG 6000 dan amonium sulfat. WSF ditambahkan PEG 6000 sehingga kosentrasi akhir 12% (w/v). Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 3 000 rpm selama 15 menit suhu 20oC. Pelet ditambahkan dengan amonium sulfat 40% sebanyak 5 ml dan disentrifugasi dengan kecepatan 11 700 rpm selama 15 menit, dilakukan 3 kali. Pelet disuspensikan dengan PBS sebanyak 1 ml, dan ditambahkan dua tetes 0.1% Na-azide. Suspensi didialisis selama 24 jam dengan PBS pH 8.0 (Polson et al. 1980).
Pemurnian IgY dengan FPLC
Pemurnian dilakukan dengan fast protein liquid chromatography (FPLC) menggunakan kolom Hi-trap IgY (Anonim 2006). Matriks dalam kolom dibilas dengan buffer K2SO4 20 mM dalam larutan NaH2PO4 20 mM pH 7.5. IgY hasil dialisis dimasukkan ke dalam kolom, bersamaan dengan buffer K2SO4 20 mM. Matriks akan mengikat IgY dan protein-protein, selain IgY akan lolos protein lain yang dapat dilihat dari kenaikan garis pada grafik. Protein-protein ini dibuang.
Selanjutnya dilakukan elusi IgY dari matriks dengan larutan NaH2PO4 20 mM pH 7.5. IgY yang terelusi akan terdeteksi oleh monitor absorban yang ditandai dengan naiknya garis sampai terbentuk garis puncak. Larutan ini ditampung dalam tabung reaksi, kemudian dipekatkan sampai kira-kira kembali ke volume asal. Matriks dicuci dengan cleaning buffer (larutan 30% propanol dalam NaH2PO4 20 mM pH 7.5).
Penentuan Konsentrasi Protein
Kosentrasi protein ditentukan dengan menggunakan metode Bradford (1976). Absorbansi sampel ditentukan dengan pembacaan pada spektrofotometer UV pada
Ȝ 280 nm. Konsentrasi sampel dihitung berdasarkan kurva larutan standard (Bovine Serum Albumin) yang telah dibuat.
Penentuan Berat Molekul Sampel dengan SDS-PAGE
Untuk mengetahui berat molekul dari IgY dilakukan dengan metode SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
(Laemmli 1970). SDS-PAGE dengan menggunakan sistem diskontinu, terdiri atas gel pemisah konsentrasi 12% dan gel pengumpul 4%. Masing-masing dari sampel IgY hasil FPLC (fraksi ke-3 dan fraksi ke-4) ditambah dengan buffer sampel dengan perbandingan 1:1 dan ditangas dalam penangas air pada suhu 70 oC selama 5 menit sebelum dimasukkan ke dalam sumur gel elektroforesis.
Marker dan sampel IgY sebanyak 10 µl dimasukkan dalam masing-masing sumur, kemudian perangkat elektroforesis dijalankan dengan arus listrik 80 mA dan 100 volt selama 180 menit. Elektroforesis dihentikan apabila pewarna sampel telah mencapai 0.5 cm dari bagian atas bawah gel. Gel diangkat dari lempeng kaca dan direndan dengan pewarna comassie brilliant blue (Sigma chemical co.)
selama 3 jam pada suhu ruang sambil diagitasi secara perlahan. Pewarna yang tidak terikat pada protein dihilangkan dengan merendam gel pada larutan pemucat methanol dan asam asetat hingga pita-pita protein pada gel terbentuk dengan jelas (Svendsen et al. 1994).
Uji Biologis Ig Y Preparasi S. Enteritidis
Preparasi bakteri dilakukan menurut metode Estuningsih (1998) dengan modifikasi. Preparasi bakteri digunakan untuk uji adhesi, anti adhesi dan opsonisasi. Bakteri S. Enteritidis ditumbuhkan pada media BHI kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 18 jam. Inokulum disentrifugasi pada kecepatan 10 000 rpm selama 10 menit. Pelet diresuspensikan dengan 5 ml NaCl fisiologis kemudian disentrifugasi pada 10 000 rpm 10 menit, dilakukan 2 kali. Pelet dilarutkan dalam 5 ml NaCl fisiologis, dihomogenkan dengan vortek mixer, diukur pada Ȝ 620 nm dengan transmisi 10% konsentrasi selnya untuk menentukan kandungan bakteri 109 sel/ml. Suspensi diinaktifkan dalam penangas air dengan suhu 56 oC selama 60 menit dan didinginkan.
Suspensi Sel
Sel epitel pipi yang digunakan berasal dari kerokan mukosa pipi manusia. Kerokan mukosa pipi manusia tersebut diambil dengan menggunakan spatel yang steril dan disuspensikan dalam 10 ml PBS. Sel epitel pipi yang mengambang
diambil dengan menggunakan pipet pasteur dan disentrifugasi dengan kecepatan 3 000 rpm selama 10 menit. Larutan sel epitel pipi dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali dan dengan menggunakan haemasitometer dihitung jumlah sel epitel pipi yang digunakan dalam penelitian sebanyak 106 sel/ml (Wibawan et al. 1999).
Uji adhesi
Uji adhesi dilakukan menurut metode Wibawan et al. (1999) dengan modifikasi. Uji ini dilakukan sebagai kontrol uji hambat anti adhesi, dengan cara membuat bahan percobaan yang terdiri dari sel epitel dan bakteri. Bahan percobaan terdiri dari suspensi sel epitel pipi 0.5 x 106 sel/ml dan 0.5 x 108 sel/ml bakteri . Bahan coba tersebut ditempatkan pada tabung mikro dan diinkubasikan selama 1 jam suhu 37 oC. Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 10 menit. Preparat ulas difiksasi dengan methanol selama 15 menit, diwarnai dengan Giemsa selama 60 menit, dan selanjutnya dilihat di bawah mikroskop menggunakan perbesaran 1000x. Perhitungan dilakukan terhadap 20 sel pada setiap pengamatan.
Uji Hambat Adhesi
Uji hambat adhesi dilakukan dengan cara membuat bahan percobaaan bakteri, yang terdiri dari campuran antibodi, sel epitel pipi dan bakteri (Pruimboom et al. 1996). Dalam penelitian ini bahan percobaan bakteri terdiri dari IgY (100 µg/ml), suspensi sel epitel pipi 0.5 x 106 sel/ml dan 0.5 x 108 sel/ml bakteri . Bahan coba tersebut ditempatkan pada tabung mikro dan diinkubasikan selama 1 jam suhu 37 OC. Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 10 menit. Preparat ulas difiksasi dengan metanol selama 15 menit, diwarnai dengan Giemsa selama 60 menit, dan selanjutnya dilihat di bawah mikroskop menggunakan perbesaran 1000x.
Preparasi Makrofag
Makrofag mengandung maksimal 50% limfosit disiapkan dengan mencuci ruang peritonium mencit yang sehat (Hudson & Hay 1989). Penelitian ini
menggunakan makrofag yang berasal dari mencit putih (Mus musculus albinus) strain Ddy, umur 5 sampai 6 minggu dengan berat rata-rata 20 sampai 30 gram per ekor dengan jenis kelamin jantan yang berasal dari PT. Biofarma Bandung. Makrofag didapat dengan cara menyuntikkan cairan PBS dan IgY pada bagian perut mencit. Satu jam kemudian dilakukan pembedahan pada perut, sebelum dibedah terlebih dahulu dilakukan pemijatan pada perut mencit. Setelah pembedahan cairan peritonium dipanen dan dihitung dengan haemasitometer jumlah makrofag sebanyak 105 sel/ml yang digunakan dalam bahan coba fagositosis.
Uji Aktifitas IgY Sebagai Opsonin
Untuk mengetahui IgY sebagai opsonin ditunjukkan dalam uji fagositosis.
Assay fagositosis dilakukan menurut metode Wibawan et al. (1999) dengan modifikasi. Bahan coba fagositosis dibuat dengan cara menambahkan IgY (100 µg/ml), suspensi makrofag 0.5 x 106 sel/ml dan 0.5 x 108 sel/ml bakteri ditempatkan pada tabung mikro, diinkubasi selama 1 jam suhu 37 oC. Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 10 menit dan pelet dibuat preparat ulas. Preparat ulas difiksasi dengan metanol selama 15 menit, diwarnai dengan Giemsa selama 60 menit, lalu dilihat di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x.
Penentuan Nilai Aktifitas dan Kapasistas Fagositosis a. Nilai Aktifitas Fagositosis
Nilai aktifitas fagositosis ditetapkan menurut jumlah sel makrofag yang secara aktif melakukan proses fagositosis dalam 100 sel dibandingkan dengan banyaknya makrofag, dinyatakan dalam persen.
Aktifitas makrofag = Jumlah makrofag aktif X 100% Jumlah makrofag total
b. Nilai Kapasitas Fagositosis
Nilai kapasitas fagositosis ditetapkan menurut jumlah bakteri S. Enteritidis ditambah IgY dan S. Enteritidis tanpa IgY yang dimakan oleh 50 sel PMN yang masih aktif.