Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Riset Anatomi Bagian Anatomi, Histologi dan Embriologi, Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor mulai bulan Februari sampai Juli 2008.
Hewan Coba
Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan masing-masing satu sampel hipofise fetus MEP umur kebuntingan 70 hari (F70), 85 hari (F85), 100 hari (F100), 120 hari (F120) dan 150 hari (F150) serta anak umur 10 hari (A10) dan 105 hari (A105). Sampel tersebut, diperoleh dari Pusat Studi Satwa Primata Institut Pertanian Bogor (PSSP-IPB) dan proses pelaksanaan pengambilan sampel dilakukan di bawah pengawasan dan persetujuan Komisi Kesejahteraan Hewan (Animal Care and Use Committee/ACUC) PSSP, LPPM-IPB nomor 02-0030IR.
Sampel diperoleh dari fetus yang berasal dari induk hasil tangkapan dari alam yang telah dikarantina dan dikandangkan secara individu untuk pemeriksaan kesehatan. Untuk mendapat ketepatan umur fetus yang akan digunakan, induk tersebut dikawinkan dengan metode time mating. Sebelum dikawinkan, induk betina diamati siklus mensturasinya dengan menggunakan metode ulas vagina. Setelah diperoleh induk dengan siklus yang teratur, induk tersebut dimasukkan ke dalam kandang kawin. Pada masa subur yang ditandai dengan adanya lendir vagina yang encer (hari ke 11), jantan dimasukkan kedalam kandang selama 3 hari. Hari kedua pada saat pejantan berada dalam kandang kawin ditetapkan sebagai hari ke nol kebuntingan dengan standar deviasi satu hari. Proses perkawinan dan pengambilan fetus dilakukan oleh PSSP-IPB.
Bahan Penelitian
Sampel hipofise diperfusi menggunakan paraformaldehid 0,2% dalam larutan phosphate buffered saline (PBS) 0,1 M pH 7,4, sedangkan hipofise diambil dan dilakukan fiksasi di dalam larutan paraformaldehid 4% dan dehidrasi serta clearing masing-masing menggunakan alkohol dan xylol bertingkat serta proses parafinisasi dengan menggunakan parafin Histoplast® (dengan titik leleh 56-57oC).
Untuk keperluan pewarnaan imunohistokimia (IHK) diperlukan bahan-bahan antara lain: larutan PBS, destilated water (DW), larutan 3% hidrogen peroksida (H2O2), larutan 10% normal goat serum (Vector Laboratories, Inc.),
anti human βLH rabbit serum dan anti human βFSH rabbit serum dengan
pengenceran 1:500, 0,02% anti rabbit IgG goat serum (Vector Laboratories, Inc.), larutan avidin dan biotin, larutan 0,03% 3,3 diaminobenzidine (DAB), 2% silan (3-aminopropyltrietoxysilane/APES) dalam aseton dan hematoksilin.
Alat Penelitian
Pada proses parafinisasi dan pemotongan jaringan peralatan yang digunakan antara lain gelas piala, inkubator, sliding microtome dan gelas objek. Untuk proses pewarnaan peralatan yang digunakan antara lain rak slide, gelas penutup, kotak lembab, mikro pipet, pena parafin, tissue dan timer. Pengamatan dan visualisasi hasil pewarnaan dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya dan peralatan mikrofotografi.
Pengambilan Sampel
Setelah mencapai umur kebuntingan yang telah ditentukan, fetus diambil dengan metode laparotomi medianus. Fetus dibius dengan menggunakan pentobarbital (6 mg/kg BB) melalui intra-umbilikal, sedangkan untuk anak MEP umur A10 dan A105 dibius dengan pentobarbital (20 mg/kg BB) secara intra-peritoneal.
Setelah terbius, sampel monyet diperfusi dengan menggunakan paraformaldehid 0,2% dalam PBS pada suhu 37oC secara intrakardial dengan kecepatan 10 ml/menit sebagai pembilasan awal. Proses selanjutnya adalah perfusi sampel dilakukan dengan menggunakan larutan paraformaldehid 4% dalam PBS pada suhu 4oC selama 20 menit sebagai larutan fiksatif. Selanjutnya hipofise dimasukkan ke dalam alkohol 70% sebagai stopping point.
Proses Pembuatan Blok Parafin dan Pemotongan Sampel
Sampel hipofise selanjutnya dimasukkan ke dalam tissue cassette untuk proses dehidrasi, yaitu direndam secara berurutan di dalam alkohol 70%, 80%, 90% dan 95% masing-masing selama 6 jam dan di dalam alkohol 100%(1), 100%(2) dan 100%(3) masing-masing selama 1 jam pada suhu kamar. Proses selanjutnya, yaitu proses clearing dengan merendam sampel di dalam larutan xylol (I, II dan III) masing-masing selama 30 menit pada suhu kamar. Proses selanjutnya, yaitu proses infiltrasi jaringan sampel di dalam larutan parafin dengan tiga kali pemindahan masing-masing selama 30 menit pada suhu 67oC.
Sampel hipofise selanjutnya dilakukan proses pencetakan di dalam parafin. Pemotongan jaringan dilakukan dengan menggunakan sliding microtome dengan ketebalan 10 µm secara serial dengan berpedoman pada teknik pemotongan hipofise babi (Gambar 4) (Sasaki et al. 1992). Hasil pemotongan, diletakkan di atas gelas objek yang telah di coating dengan 2% silan
(3-aminopropyltrietoxysilane/APES) dalam aseton sebelumnya.
Gambar 4 Pembagian daerah pemotongan kelenjar hipofise pada babi.
Potongan a, b dan c adalah potongan medial, paramedial dan lateral (Sasaki et al. 1992).
Pewarnaan Imunohistokimia pada Hipofise
Pewarnaan imunohistokimia (IHK) dilakukan dengan menggunakan metode Avidin-Biotin Complex (ABC) (Hsu et al. 1981). Setelah proses deparafinisasi dan rehidrasi, sampel dibilas dengan menggunakan destilated water (DW) sebanyak tiga kali masing-masing selama lima menit. Setelah itu, di sekitar potongan sampel dikeringkan dengan menggunakan tisue dan diberi batas dengan menggunakan pena parafin mengelilingi sampel. Slide selanjutnya, ditempatkan mendatar dalam kotak lembab dan ditetesi dengan 3% H2O2 dalam DW selama 15 menit pada suhu ruang, kemudian dibilas menggunakan PBS sebanyak tiga kali masing-masing selama lima menit.
Slide selanjutnya, diinkubasi dengan 10% normal goat serum (Vector Laboratories, Inc.) selama 30 menit pada suhu ruang, kemudian dibilas menggunakan PBS sebanyak tiga kali masing-masing selama lima menit. Selanjutnya slide, diinkubasi dengan anti human βLH rabbit serum dan anti
human βFSH rabbit serum masing-masing dengan pengenceran 1:500 selama
semalam pada suhu 4oC untuk LH dan 4 malam untuk FSH.
Slide kemudian, diinkubasikan dengan 0,02% rabbit IgG goat serum (Vector Laboratories, Inc.) selama 30 menit pada suhu 37oC, pada waktu yang bersamaan dibuat campuran 10 µl avidin dan 10µl biotin (Vector Laboratories, Inc.) dalam 1ml PBS. Slide jaringan kemudian, diinkubasi dengan campuran avidin dan biotin selama 30 menit pada suhu 37oC, kemudian dibilas menggunakan PBS sebanyak tiga kali masing-masing selama lima menit. Untuk visualisasi hasil pewarnaan, slide jaringan diinkubasi dengan larutan 0,03% DAB selama 5-20 menit sambil diamati di bawah mikroskop. Sel-sel imunoreaktif terlihat berwarna coklat pada sitoplasmanya. Untuk pewarnaan latar belakang, digunakan pewarnaan hematoksilin. Tahapan terakhir adalah proses dehidrasi dan
clearing jaringan kemudian ditutup dengan gelas penutup (cover glass)
Pengamatan.
Pengamatan sel-sel imunoreaktif terhadap LH (ir-LH) dan imunoreaktif terhadap FSH (ir-FSH) meliputi waktu pertama kali sel imunoreaktif terdeteksi, pola distribusi dan densitas/kepadatan sel yang positif terhadap antibodi kedua hormon tersebut dari setiap tingkatan umur sampel. Hal ini dilakukan, untuk mempelajari pola perkembangan sel-sel LH dan FSH. Untuk mempermudah pengamatan, hipofise dibagi menjadi beberapa daerah pengamatan dengan berpedoman pada pembagian daerah pengamatan hipofise babi menurut Sasaki et
al. (1992), yaitu pars tuberalis (T), caudal anterior Rathke`s lumen (Ca), caudal distal (Cd), middle zone (M), sex zone (S) dan menambahkan satu daerah
pengamatan yaitu anterior middle zone (Am) (Gambar 5).
Pengamatan terhadap kepadatan sel dilakukan dengan menggunakan metode skoring. Pada pengamatan terhadap densitas/kepadatan sel, skor yang diberikan adalah negatif (-), sangat rendah (+/-), jarang/sedikit (+), sedang (++), padat (+++) dan paling padat (++++).
Gambar 5 Pembagian daerah pengamatan kelenjar hipofise.
T: pars tuberalis, S: sex zone, M: middle zone, Am: anterior middle zone, C: caudal area, Ca: caudal anterior Rathke`s lumen, Cd: caudal distal, I: pars intermedia, R: lumen kantung Rathke, B: buluh darah, E: median eminence dan N: pars nervosa, (Dimodifikasi dari Sasaki et al.1992).
Analis Data
Pengamatan dilakukan terhadap distribusi dan densitas/kepadatan sel-sel ir-LH dan ir-FSH. Data yang diperoleh kemudian diolah secara deskriptif.