Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan selama kurang lebih tiga bulan dimulai dari 23 Februari sampai dengan 3 Juni 2009. Penelitian ini dilakukan di PT IndoAnilab Bogor serta Laboratorium Patologi Pusat Studi Satwa Primata Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat Institut Pertanian Bogor (PSSP LPPM-IPB).
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain formula pakan tinggi energi yang berasal dari beef tallow (lemak sapi) dan gandum, pakan komersial
(monkey chow), nikotin cair 0,75 mg/kg BB, air minum ad libitum, buah pisang
dan jambu sebanyak 10 g/ekor/hari, sampel darah (serum), ketamin 10 mg/kg BB, alkohol, dan kapas.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kandang individu (0,6x0,6x9 m), timbangan digital untuk pakan dan bobot badan, alat pengukur tinggi duduk, tempat penampungan feses dan urin, tempat makan dan minum hewan, spoit 5ml, tabung penyimpanan sampel darah, dan spektrofotometer.
Hewan Laboratorium
Hewan coba laboratorium yang digunakan untuk penelitian ini adalah monyet ekor panjang jantan dewasa, umur 6 sampai 8 tahun (susunan gigi Molar3/Molar3), bobot badan 4 sampai 5,5 kg sebanyak 10 ekor. Seluruh perlakuan yang berkaitan dengan hewan percobaan dilakukan berdasarkan peraturan yang telah ditetapkan oleh Animal Care and Use Committee (ACUC) yang merupakan komisi Kesejahteraan dan Penggunaan Hewan Percobaan dari PT IndoAnilab dengan nomor 04-IA-ACUC-09.
Metode Penelitian Rancangan Percobaan
Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian utama membentuk hewan model obesitas dengan induksi pakan tinggi energi yang dilaksanakan selama 12 bulan (Februari 2008 sampai dengan Februari 2009). Penelitian selanjutnya adalah pemberian nikotin selama tiga bulan. Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap in time. Waktu pengamatan dilakukan berulang terhadap sampel (hewan coba) yang sama dengan periode tiga bulan dan kondisi sampel percobaan dianggap homogen dengan dua perlakuan pakan yang terdiri dari lima ulangan untuk sampel yang sama. Sebelum intervensi nikotin, dilakukan pengumpulan data untuk semua peubah yang diamati sebagai data base line (data awal). Bulan pertama, kedua dan ketiga dilakukan pengamatan dan pengumpulan data untuk semua peubah selama intervensi nikotin (0,75 mg/kg BB).
Perlakuan pada Hewan
Monyet ekor panjang yang berjumlah 10 ekor dikelompokkan secara acak menjadi dua perlakuan pakan dengan sumber energi yang tinggi, masing-masing perlakuan terdiri dari 5 ekor. Perlakuan pertama, diberikan pakan tinggi energi (bersumber dari lemak sapi), sedangkan perlakuan kedua diberikan pakan tinggi energi (bersumber dari protein), yaitu monkey chow komersial. Hewan dikandangkan dalam kandang individu yang ditempatkan pada posisi agar antar individu dapat berinteraksi secara audiovisual. Pemberian minum dilakukan secara ad libitum dan pakan perlakuan diberikan 2 kali sehari, pagi (sekitar pukul 08:00 WIB) dan siang hari (sekitar pukul 14:00 WIB) sebanyak 150 g/ekor/hari. Selain itu, ada pakan tambahan lain yang diberikan sebagai pengkayaan lingkungan, yaitu berupa buah-buahan seperti pisang dan jambu sebanyak 10 g/ekor/hari yang sudah dibekukan, di berikan dalam bentuk beku.
Masing-masing monyet dari setiap perlakuan diamati terlebih dulu (23 Februari-11 Maret 2009) yang dilanjutkan dengan penimbangan BB, pengukuran IMT dan pemeriksaan glukosa darah sebagai data awal sebelum intervensi nikotin (11 Maret 2009). Setelah itu, dilakukan intervensi nikotin (12 Maret-3 Juni 2009) dengan dosis 0,75 mg/kg BB, namun semua pakan yang diberikan tidak habis
terkonsumsi, sehingga kemungkinan nikotin yang masuk ke dalam tubuh berkisar antara 0,5 sampai 0,75 mg/kg BB. Pada penelitian ini, nikotin diperoleh dari suatu pabrik yang memproduksi nikotin murni dan digunakan dalam bentuk cairan yang sebelumnya dilarutkan menggunakan air bersih. Penambahan nikotin dilakukan dengan cara dicampurkan ke dalam kedua jenis pakan ketika dibuat menjadi padatan. Pemberian nikotin dilakukan bersamaan dengan pemberian pakan, yaitu pagi dan siang hari. Penimbangan BB, pengukuran IMT dan pemeriksaan kadar glukosa darah dilakukan setiap minggu pertama bulan April, Mei dan Juni.
Pembuatan Pakan dan Penambahan Nikotin
Pembuatan kedua jenis pakan dilakukan setiap minggu. Bahan yang digunakan untuk pakan kelompok pertama (Kelompok I) adalah beef tallow (lemak sapi), gandum, minyak goreng, tepung ikan, gula, dedak padi, agar-agar, tepung maizena, bungkil kedelai, kalsium karbonat, kalsium fosfat, dan campuran mineral yang berasal dari bahan-bahan lokal. Pakan kelompok kedua (Kelompok II) menggunakan monkey chow yang berbentuk biskuit padat, kering dan agak keras yang berasal dari pabrik dan merupakan pakan yang biasa dikonsumsi oleh monyet. Kandungan nutrien formula untuk masing-masing kelompok pakan dapat dilihat pada Tabel 6.
Tabel 6 Kandungan nutrien formula pakan untuk masing-masing perlakuan
Kandungan Nutrien Kelompok I Kelompok II
Protein (%) 12,02 26,82
Lemak (%) 20,80 4,15
Serat Kasar (%) 2,12 2,25
Bahan Ekstrak Tanpa Nitrogen (%) 53,24 58,12
Bahan Kering (%) 78,02 88,07
Gross Energi (kal/g) 4.479,11 4.492,87
Nikotin Cair (mg/kg BB) 0,75 0,75
Sumber : Hasil Analisis Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan Fakultas Peternakan IPB Bogor 2009.
Penambahan nikotin cair ke dalam pakan dilakukan bersamaan dengan pembuatan pakan menjadi padatan. Sebelum dicampur dengan pakan, nikotin terlebih dulu dihitung jumlahnya (dalam setiap ml cairan nikotin yang digunakan mengandung 0,4 mg nikotin). Dosis nikotin cair didasarkan pada rerata umum bobot badan monyet ekor panjang untuk masing-masing kelompok perlakuan.
Untuk mengetahui dosis nikotin yang harus ditambahkan ke dalam pakan, dapat dihitung menggunakan rumus sebagai berikut:
Jumlah nikotin cair (ml):
Keterangan : x : rerata bobot badan secara umum setiap perlakukan (kg) dp : dosis nikotin cair yang digunakan (0,75 mg/kg BB) jp : jumlah pakan yang dibuat (g)
bp : berat perbiji dari pakan yang dibuat akan menjadi padatan (g)
Pakan Kelompok I dalam sekali pembuatan sebanyak 1,5 kg pakan dengan berat padatan perbiji 30 g, sedangkan untuk pakan kelompok II dibuat sebanyak 5 kg pakan dengan berat padatan perbiji 50 g. Dari formula tersebut dapat diketahui jumlah nikotin (ml) yang digunakan dikalikan dengan 2, hal ini karena dalam setiap 1 ml cairan nikotin mengandung 0,4 mg nikotin, sehingga diperlukan 2 ml cairan untuk kurang lebih setara dengan dosis 0,75 mg/kg BB.
Parameter yang Diukur
Parameter yang diukur pada penelitian ini adalah BB, IMT, dan glukosa darah. Sebelum pengukuran, hewan sudah dipuasakan minimal 12 jam. Selanjutnya, hewan disedasi menggunakan ketamin dosis 10 mg/kg BB secara intramuskular. Setelah hewan terbius, dilakukan penimbangan BB, pengukuran IMT dan pemeriksaan glukosa darah.
Penimbangan BB untuk masing-masing monyet dilakukan dengan alat timbangan yang sudah disediakan. Setelah itu, dilakukan pengukuran IMT dengan cara bobot badan (kg) yang sudah diketahui dibagi dengan tinggi duduk yang dipangkat dua (m2). Data IMT digunakan sebagai data penunjang untuk mengetahui reaksi dari nikotin cair terhadap bobot badan.
Gambar 2 Penimbangan bobot badan dan pengukuran indeks massa tubuh monyet ekor panjang. Sumber : Chusnul Choliq (koleksi pribadi).
Pengambilan darah dilakukan setelah penimbangan BB dan pengukuran IMT. Ketika monyet ekor panjang masih dalam keadaan terbius, bagian tubuh yang akan diambil darahnya (v. femoralis) dibersihkan terlebih dulu menggunakan alkohol 70% dan dibiarkan sampai kering. Selanjutnya, pengambilan darah sekitar 5 ml dilakukan dengan cara menyuntikkan jarum pada bagian kulit yang berada di atas v. femoralis menggunakan spoit 5 ml hingga masuk ke lumen v. femoralis, kemudian darah diambil dan dimasukkan ke tabung sampel darah secara perlahan- lahan melalui dinding tabung yang bersih dan kering, tanpa antikoagulan dan didiamkan selama 15 menit dalam suhu kamar.
Gambar 3 Pengambilan darah melalui vena femoralis monyet ekor panjang. Sumber : Chusnul Choliq (koleksi pribadi).
Darah yang sudah didiamkan selama 15 menit disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit untuk menghasilkan serum, berupa cairan jernih berwarna kuning muda. Kemudian, pemeriksaan glukosa darah dilakukan dengan metode glukosa oksidase (GOD). Tiga buah tabung reaksi 5 ml disiapkan, tabung pertama berisi reagen 1000 µl, tabung kedua berisi reagen 1000 µl dan sampel serum 10 µl, dan tabung ketiga berisi reagen 1000 µl dan larutan standar 10 µl (larutan standar berisi glucose 100 mg/dl) tanpa pengenceran. Ketiga tabung tersebut diinkubasi pada suhu kamar selama 5 menit. Dalam penelitian ini, reagen glukosa darah yang digunakan berasal dari produk Human no. catalog 10-260 dengan komposisi phosphatebuffer (pH 7,5), 4-aminophenazoid (0,25 mmol/l),
phenol (0,75 mmol/l), glucoseoxidase (>15 KU/l), peroxsidase (>1,5 KU/l), dan
mutarotase (>2,0 KU/l). Kemudian nilai kadar glukosa darah dibaca
menggunakan alat spektrofotometer analiser BS 3000P dengan program C/St, panjang gelombang 546 nm dan faktor 36,77.
Analisis Data
Data yang ditampilkan merupakan hasil rerata dari masing-masing parameter (BB, IMT, dan glukosa darah) bagi setiap kelompok perlakuan. Hasil tersebut dianalisis lebih lanjut menggunakan metode General Linear Model (GLM) untuk melihat interaksi dari waktu dan perlakuan yang diberikan.