Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Pusat Kajian Hortikultura Tropika (PKHT), laboratorium Mikroteknik, laboratorium analisis tanaman dan kromatografi Institut Pertanian Bogor, serta laboratorium Morfologi, Anatomi, dan Sitologi Tumbuhan, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia Cibinong Bogor. Adapun waktu penelitian dimulai Januari 2009 – Mei 2012.
Penelitian terdiri atas empat bagian percobaan besar yaitu :
1. Pengembangan teknologi induksi tunas manggis in vitro dari eksplan mata
tunas pucuk bibit manggis
2. Studi fisiologi dan anatomi keberhasilan sambung mikro tanaman manggis
3. Manipulasi media pada setek mikro manggis secara in vitro
4. Optimalisasi aklimatisasi setek mikro manggis dengan teknik media steril porous
Pengembangan Teknologi Induksi Tunas Manggis In Vitro Dari Eksplan Tunas Pucuk Bibit Manggis
Bahan
Bahan yang digunakan sebagai sumber eksplan adalah tunas manggis dari bibit manggis umur 3 - 4 tahun, yang didapatkan dari kebun percobaan Pusat Kajian Hortikultura Tropika Pasir Kuda Bogor. Media Murashige & Skoog (MS) (murashige & Skoog 1962), pure agar, zat pengatur tumbuh benzyl adenin (BA), thidiazuron (TDZ), dan Kinetin (KIN). Sterilisasi eksplan menggunakan deterjen, bayclin, alkohol 70 dan 96%, mercuri khlorid, fungisida dan bakterisida.
Metode Penelitian
Percobaan ini terdiri dari tiga sub percobaan yaitu induksi tunas, multiplikasi tunas, dan pemanjangan tunas. Pada tahap induksi tunas mengunakan rancangan lingkungan Rancangan Acak Lengkap faktor tunggal dengan 10 ulangan. Media yang digunakan adalah media MS, dengan perlakuan yaitu : 1) Tanpa penambahan ZPT (MS0), 2) BA 4,0 mg/l (B4), 3) BA 8,0 mg/l (B8), 4)
TDZ 0,2 mg/l (T0,2), 5) BA 4,0 mg/l+TDZ 0,2 mg/l (B4T0,2), dan 6) BA 8,0 mg/l+TDZ 0,2 mg/l (B8T0,2). Pada percobaan ini setiap eksplan mewakili satu ulangan, sehingga didapatkan 60 satuan percobaan.
Tahap multiplikasi tunas mengunakan rancangan lingkungan Rancangan Acak Lengkap faktor tunggal dengan 10 ulangan. Media yang digunakan adalah media MS, dengan perlakuan yaitu: 1) Tanpa penambahan ZPT (MS0), 2) BA 2,00 mg/l (B2), 3) BA 4,00 mg/l (B4), 4) BA 2,00 mg/l+TDZ 0.05 mg/l (B2T0,05), dan 5) BA 4,00 mg/l+TDZ 0,05 mg/l (B4T0,05) Pada percobaan ini terdapat 5 perlakuan 10 ulangan, setiap eksplan mewakili satu ulangan, sehingga didapatkan 50 satuan percobaan.
Tahap pemanjangan tunas mengunakan rancangan lingkungan Rancangan Acak Lengkap faktor tunggal dengan 10 ulangan. Media yang digunakan adalah media MS, dengan perlakuan yaitu: 1) BA 1 mg/l + Kinetin (KIN) 0 mg/l (B1), 2) BA 1 mg/l + KIN 1 mg/l (B1K1), dan 3) BA 1 mg/l + KIN 2 mg/l (B1K2). Pada percobaan ini terdapat 3 perlakuan 10 ulangan, setiap eksplan mewakili satu ulangan, sehingga didapatkan 30 satuan percobaan.
Pelaksanaan
Induksi Tunas
Pengambilan tunas dilakukan pada saat tanaman sedang dorman (Gambar 5). Tunas manggis dipotong daun dan tangkainya dengan menyisakan tangkai daun sepanjang 1,5 cm. Eksplan dicuci lalu direndam deterjen encer selama 15 menit, lalu dicuci dan dibilas aquades mengalir. Eksplan dibawa ke laminar, lalu direndam dalam larutan bakterisida dan fungsida masing-masing 8 g/l selama 20 menit, dibilas aquades steril sampai bersih, lalu direndam alkohol 70% selama 15 menit dan dibilas aquades steril sebanyak tiga kali. Eksplan kemudian direndam dalam larutan mercuri khlorid 0,1% selama 20 menit, dibilas aquades steril tiga kali, lalu ditiriskan di atas kertas saring steril.
31
Gambar 5. Eksplan tunas bibit manggis 4 tahun.
Media dasar yang digunakan adalah media dasar Murashige dan Skoog (Murashige & Skoog 1962), terdiri atas Garam makro, garam mikro, vitamin grup B dan myo inositol. Sebagai pemadat digunakan Pure Agar sebanyak 6,5 g/l. Sebagai sumber energi digunakan sukrosa konsentrasi 3%. pH media diatur menjadi 5,8 dengan menambahkan larutan HCl atau NaOH. Penambahan zat pengatur tumbuh dilakukan sesuai perlakuan percobaan. Media perlakuan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 1 atm selama 15 menit. Tunas yang sudah steril ditanam dalam media perlakuan dan diletakkan di dalam rak kultur dengan penyinaran selama 16 jam dalam sehari dengan suhu 25 – 27 oC.
Multiplikasi Tunas
Pada percobaan ini dilakukan penurunan konsentrasi BA ditambah thidiazuron (TDZ) dengan tujuan multiplikasi tunas. Tunas yang dihasilkan dari percobaan induksi tunas, selanjutnya disubkultur ke media untuk induksi multiplikasi tunas sesuai perlakuan. Sebagai pemadat digunakan Pure Agar sebanyak 6,5 g/l, sumber energi digunakan sukrosa konsentrasi 3%. Media diatur sehingga pH menjadi 5,8 dengan menambahkan larutan HCl atau NaOH. Media perlakuan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 1 atm selama 15 menit. Tunas steril hasil percobaan Induksi tunas ditanam dalam media perlakuan dan diletakkan di dalam rak kultur dengan penyinaran selama 16 jam dalam sehari dengan suhu 25 – 27 oC.
Pemanjangan Tunas
Pertumbuhan tunas manggis ke arah tinggi pada umumnya sangat lambat sehingga perlu dipindah ke media untuk pemanjangan tunas yaitu kombinasi BA dengan Kinetin (KIN). Media dasar yang digunakan adalah media dasar Murashige dan Skoog terdiri atas Garam makro, garam mikro, vitamin grup B dan myo inositol. Sebagai pemadat digunakan Pure Agar sebanyak 6,5 g/l. Sebagai sumber energi digunakan sukrosa sebanyak 3%. Media diatur sehingga pH menjadi 5,8 dengan menambahkan larutan HCl atau NaOH. Penambahan zat pengatur tumbuh dilakukan sesuai perlakuan percobaan. Media perlakuan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 1 atm selama 15 menit. Tunas yang sudah steril ditanam dalam media perlakuan dan diletakkan di dalam rak kultur dengan penyinaran selama 16 jam dalam sehari.
Pengamatan
1. Persentase membentuk tunas (%), yaitu jumlah eksplan membentuk tunas baru per jumlah eksplan yang ditanam. Pengamatan dilakukan setiap minggu sampai dua bulan.
2. Waktu pembentukan tunas (hari setelah perlakuan/HSP), adalah waktu yang diperlukan untuk membentuk tunas baru. Pengamatan dilakukan setiap minggu sampai 2 bulan.
3. Pertambahan panjang tunas (mm), selisih antara panjang tunas saat ditanam pada media pemanjangan tunas dan saat akhir pengamatan 3 bulan setelah dipindah ke media pemanjangan.
Studi Fisiologi dan Anatomi Keberhasilan Sambung Mikro Tanaman Manggis Bahan
Biji manggis yang berasal dari Purwakarta dan sekitarnya, tunas manggis dari tanaman dewasa, tunas in vitro dari eksplan tunas manggis umur 4 tahun.
Bahan sterilisasi yang digunakan adalah Bayclin, alkohol 70 dan 96%, fungisida dan bakterisida, deterjen. Media MS, dan zat pengatur tumbuh yang digunakan adalah BA.
33
Metode Penelitian
Penelitian terdiri atas dua percobaan besar yaitu 1) Sambung mikro manggis secara in vitro, dan 2) Sambung mikro manggis di pesemaian (masing-
masing terdiri atas tiga sub percobaan). Penyambungan manggis konvensional antara bibit manggis 2 tahun sebagai batang bawah dengan tunas manggis dari tanaman yang sudah berproduksi sebagai batang atas dilakukan juga sebagai pembanding,.
Sambung Mikro Secara In Vitro
Percobaan sambung mikro secara in vitro disusun menggunakan percobaan
faktorial Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 10 ulangan untuk setiap perlakuan. Ada dua faktor yang digunakan, faktor pertama adalah sumber batang bawah, yaitu : 1) batang bawah adalah tunas yang berasal dari perkecambahan biji dibelah empat, dan 2) batang bawah adalah tunas berasal dari perkecambahan biji utuh tanpa dibelah. Faktor kedua adalah fase pertumbuhan tunas untuk batang atas, yaitu 1) tunas manggis yang masih dorman (tunas dorman) dan 2) tunas manggis yang sedang tumbuh trubus baru 2-4 mm (tunas trubus). Terdapat empat kombinasi perlakuan, 10 ulangan, dan setiap tanaman sambung mikro mewakili satu ulangan, sehingga didapatkan 40 satuan percobaan.
Percobaan sambung mikro secara in vitro menggunakan tunas batang
bawah yang didapat dari perbanyakan in vitro. Batang atasnya menggunakan 3
jenis tunas, yaitu tunas yang didapat dari perbanyakan in vitro, mata tunas
tanaman manggis dewasa, dan tunas in vitro dari eksplan bibit manggis 4 tahun,
sehingga ada tiga sub percobaan. Ketiga sub percobaan itu yaitu: 1) sambung mikro antara sesama tunas manggis in vitro (batang atas dan batang bawahnya
adalah tunas in vitro), 2) sambung mikro antara tunas in vitro sebagai batang
bawah dengan mata tunas tanaman dewasa dari lapangan sebagai batang atas, dan 3) sambung mikro antara tunas in vitro sebagai batang bawah dengan tunas in vitro dari eksplan bibit manggis 4 tahun (tunas dari percobaan pengembangan
Sambung Mikro di Pesemaian
Percobaan sambung mikro di pesemaian disusun menggunakan percobaan faktorial Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan 10 ulangan untuk setiap perlakuan. Ada dua faktor yang digunakan, faktor pertama adalah sumber batang bawah, yaitu : 1) batang bawah adalah tunas yang berasal dari perkecambahan biji dibelah empat, dan 2) batang bawah adalah tunas berasal dari perkecambahan biji utuh tanpa dibelah. Faktor kedua adalah fase pertumbuhan tunas untuk batang atas, yaitu 1) tunas manggis yang masih dorman (tunas dorman) dan 2) tunas manggis yang sedang tumbuh trubus baru 2-4 mm (tunas trubus). Terdapat empat kombinasi perlakuan, 10 ulangan, dan setiap tanaman sambung mikro mewakili satu ulangan, sehingga didapatkan 40 satuan percobaan.
Batang bawah untuk percobaan sambung mikro di pesemaian didapat dari tunas hasil perkecambahan di pesemaian. Batang atasnya menggunakan 3 jenis tunas, yaitu tunas dari perbanyakan biji di pesemaian, tunas dari perbanyakan biji
in vitro, dan tunas in vitro dari eksplan bibit manggis 4 tahun, sehingga ada tiga
sub percobaan. Ketiga sub percobaan itu yaitu : 1) sambung mikro antara sesama tunas manggis di pesemaian (batang atas dan batang bawahnya adalah tunas manggis di pesemaian), 2) sambung mikro antara tunas manggis dari perkecambahan di pesemaian sebagai batang bawah dengan tunas hasil perbanyakan in vitro sebagai batang atas, dan 3) sambung mikro antara tunas in vitro sebagai batang bawah dengan batang atasnya adalah tunas in vitro dari
eksplan bibit manggis 4 tahun (tunas dari percobaan pengembangan teknologi induksi tunas manggis in vitro dari eksplan tunas manggis).
Pelaksanaan
Sambung Mikro Secara In vitro
Bahan yang digunakan adalah biji manggis yang berasal dari Purwakarta dan sekitarnya. Biji dibersihkan, kemudian dipilih yang besar dan beratnya hampir seragam (≥ 1 g). Batang bawah dan batang atas didapatkan dari hasil perbanyakan manggis secara in vitro. Biji manggis segar dilepaskan dari selaput
berserat tempat menempelnya daging buah. Biji kemudian dicuci dengan air deterjen encer selama 10 menit, lalu masuk ke laminar air flow cabinet. Biji
35
selanjutnya direndam dalam larutan fungisida dan bakterisida (masing-masing 8 g/l) selama 30 menit sambil dikocok. Biji dibilas dengan aquades steril, lalu direndam dalam larutan alkohol 70% selama tiga menit dan dibilas dengan aquades steril.
Biji Selanjutnya direndam dalam larutan Bayclin 30%, 20%, dan 10% masing-masing selama 10, 15, dan 20 menit lalu dibilas dengan air steril. Biji yang sudah steril lalu ditiriskan di atas kertas saring steril. Biji yang telah steril (biji utuh atau dibelah empat) kemudian segera ditanam pada media yang sudah disiapkan. Penanaman untuk memperoleh tunas batang atas dilakukan empat minggu lebih awal dari penanaman untuk tunas batang bawah. Media yang digunakan adalah media Murahige & Skoog (MS) (Murashige & Skoog 1962), yang diberi zat pengatur tumbuh Benzyl Adenin (BA) 5 mg/l dan sukrosa 3%. Pemadatan media dilakukan dengan penambahan agar 6,5 g/l dengan pH media 5,8. Pada biji manggis yang dibelah, penanaman dilakukan dengan bagian luka menempel pada media. Untuk setiap botol kultur ditanam empat eksplan (untuk biji belah empat), atau dua eksplan (untuk biji utuh). Botol-botol berisi biji yang akan menghasilkan tunas sumber batang bawah maupun batang atas ini lalu ditumbuhkan dalam ruang kultur bersuhu 25-27oC dengan penyinaran 16 jam terang 8 jam gelap.
Percobaan sambung mikro secara in vitro menggunakan tiga jenis tunas
batang atas yaitu tunas in vitro, mata tunas manggis dari tanaman dewasa, dan
tunas manggis in vitro dari eksplan tunas bibit manggis 4 tahun. Penyiapan
batang atas yang diambil dari tunas in vitro dilakukan sama seperti penyiapan
batang bawahnya. Batang atas tunas manggis in vitro dari eksplan tunas bibit
manggis 4 tahun didapatkan dari hasil percobaan bagian 1 (percobaan pengembangan teknologi induksi tunas manggis in vitro dari eksplan tunas
manggis).
Penyiapan batang atas dari mata tunas tanaman dewasa dimulai dari pengambilan mata tunas dari tanaman manggis dewasa yang telah berproduksi di lapangan. Pengambilan tunas dilakukan pada saat tanaman sedang mengalami masa dormansi maupun trubus (sesuai perlakuan).
Proses sambung mikro dilakukan dengan cara sambung celah V. Tunas manggis in vitro yang paling baik digunakan sebagai batang bawah adalah yang
sudah berumur 4 – 7 minggu setelah biji berkecambah, tinggi tanaman lebih dari 3 cm, dan setidaknya sudah memiliki sepasang daun. Tunas manggis in vitro yang
dapat digunakan sebagai batang atas adalah tunas yang sedang dalam keadaan dorman atau trubus (sesuai perlakuan).
Bagian tajuk batang bawah dipangkas horizontal lalu dibuat celah vertikal sedalam 0,3-0,5 cm untuk tempat menjepit tunas batang atas. Sementara itu dibuat irisan bentuk baji (huruf V) sepanjang 0,3-0,5 cm pada bagian basal batang atas. Bagian ini lalu ditancapkan pada celah batang bawah tanpa dilakukan pengikatan pada daerah sambungan. Setelah penyambungan, tunas ditumbuhkan dalam ruang kultur bersuhu 25-27oC dengan penyinaran 16 jam terang 8 jam gelap. Media tanam yang digunakan untuk pemeliharaan hasil sambung mikro adalah media MS padat ditambah BA 2 mg/l.
Proses sterilisasi eksplan mata tunas dari lapangan dilakukan berdasarkan percobaan pendahuluan. Tunas yang terpilih dicuci lalu direndam deterjen encer selama 15 menit, lalu dicuci dan dibilas air mengalir. Eksplan dibawa ke laminar, lalu direndam dalam larutan bakterisida dan fungsida masing-masing 8 g/l selama 20 menit. Dibilas air steril, lalu direndam alkohol 70% selama 15 menit. Dibilas air steril sebanyak tiga kali lalu direndam dalam larutan mercuri khlorid 0,1 % selama 20 menit, dibilas air steril tiga kali, lalu ditiriskan. Tunas yang sudah steril kemudian diambil mata tunasnya untuk segera disambungkan ke batang bawah sesuai perlakuan. Bagian mata tunas lalu ditancapkan pada celah batang bawah tanpa dilakukan pengikatan pada daerah sambungan. Setelah penyambungan, tunas ditumbuhkan dalam ruang kultur bersuhu 25-27oC dengan penyinaran 16 jam terang 8 jam gelap. Media tanam yang digunakan untuk pemeliharaan hasil sambung mikro adalah media MS padat ditambah BA 2 mg/l.
Sambung Mikro di Pesemaian
Batang bawah untuk percobaan sambung mikro di pesemaian diperoleh dari hasil perbanyakan biji manggis di pesemaian. Penyiapan tunas sebagai batang bawah dilakukan dengan melakukan penyemaian biji manggis utuh dan
37
dibelah 4 pada bak pesemaian. Biji yang digunakan adalah biji buah manggis asal Purwakarta. Biji manggis dibersihkan, kemudian dipilih yang besar dan beratnya hampir seragam (≥ 1 g). Benih manggis disemai di kotak persemaian dengan media tanam arang sekam : tanah kebun (2 : 1).
Percobaan sambung mikro di pesemaian menggunakan tiga jenis tunas batang atas yaitu tunas kecambah di pesemaian, tunas in vitro, dan tunas manggis in vitro dari eksplan tunas bibit manggis 4 tahun. Penyiapan batang atas yang
diambil dari tunas kecambah di pesemaian dilakukan sama seperti penyiapan batang bawahnya. Batang atas tunas manggis in vitro didapatkan dari hasil
perbanyakan in vitro. Penyiapannya sama seperti pada penyiapan batang bawah
sambung mikro in vitro. Penyiapan tunas in vitro dari eksplan tunas bibit
manggis 4 tahun didapatkan dari hasil percobaan bagian 1 (percobaan pengembangan teknologi induksi tunas manggis in vitro dari eksplan tunas
manggis).
Pelaksanaan Sambung Mikro di Pesemaian
Proses sambung mikro dilakukan dengan cara sambung celah V. Tunas manggis dari perkecambahan di pesemaian yang paling baik digunakan adalah yang sedang dalam pertumbuhan awal, berumur 4 – 7 minggu setelah biji berkecambah, tinggi tanaman lebih dari 3 cm, dan setidaknya sudah memiliki sepasang daun.
Bagian tajuk batang bawah dipangkas horizontal lalu dibuat celah vertikal sedalam 0,3-0,5 cm untuk tempat menjepit tunas batang atas. Sementara itu dibuat irisan bentuk baji (huruf V) sepanjang 0,3-0,5 cm pada bagian basal batang atas. Bagian ini lalu ditancapkan pada celah batang bawah lalu dilakukan pengikatan dengan plastik elastis di daerah sambungan. Setelah tahap sambung mikro, tunas ditumbuhkan pada media di pesemaian, lalu diberi sungkup plastik dan diletakkan di tempat yang teduh.
Percobaan Pembanding Grafting di Lapangan
Percobaan grafting konvenional di lapangan dilakukan sebagai perbandingan dengan sistem perbanyakan sambung mikro. Batang bawah adalah bibit manggis muda umur 2 tahun, yang memiliki penampilan baik, sehat dan
berbatang lurus. Batang atas yang akan digunakan untuk penyambungan diambil dari cabang plagiotrop tanaman manggis dewasa yang sudah berproduksi. Cabang plagiotrop yaitu cabang yang tumbuh secara horizontal pada tanaman manggis dewasa. Entris untuk batang atas sepanjang 10-20 cm dipotong langsung dari pohon induknya. Batang bawah yang dipersiapkan mempunyai diameter batang yang sama atau sedikit lebih besar dari batang atasnya. Bagian tajuk batang bawah dipangkas horizontal lalu dibuat celah vertikal sedalam 2 cm untuk tempat menjepit entris. Sementara itu dibuat irisan bentuk baji (huruf V) pada bagian basal batang atas. Bagian ini lalu ditancapkan pada celah batang bawah, diikat dengan tali plastik yang lentur, dan disungkup dengan plastik.
Pengamatan
1. Persentase keberhasilan (%). Yaitu jumlah tanaman manggis hasil sambung mikro yang dapat menghasilkan trubus baru. Diamati dari mulai awal perlakuan sampai akhir pengamatan.
2. Waktu pembentukan tunas (Hari setelah perlakuan). Adalah waktu yang dibutuhkan untuk menghasilkan trubus baru.
3. Panjang tunas (cm). Diukur dari batas sambungan sampai titik tumbuh terakhir.
4. Jumlah pasangan daun hasil sambung mikro (buah). Dihitung jumlah pasangan daun baru yang dihasilkan setelah dilakukan sambung mikro. 5. Anatomi jaringan daerah sambungan. Dilakukan pengamatan mikroskopis
komparatif jaringan bidang sambungan pada 4 bulan setelah penyambungan. Pengambilan sampel dilakukan pada hasil sambung mikro dan grafting di lapangan.
6. Diameter batang (cm). Pengukuran diameter batang dilakukan dengan menggunakan mikroskop pada 4 bulan setelah tanam. Pengamatan diameter batang diukur pada batang in vitro, batang manggis seedling dan
cabang plagiotrop. Pengambilan sampel batang dari manggis seedling dan
cabang plagiotrop dilakukan di tiga posisi, yaitu 1) ¾ ruas cabang pertama; 2) ruas kedua ; 3) 1¼ ruas cabang pertama. Pengambilan sampel irisan batang in vitro dilakukan pada dua bagian batang, yaitu : 1) di atas 2,5 cm
39
sambung mikro), 2) 2-2,5 cm dari pangkal batang (yang biasa digunakan untuk batang bawah sambung mikro).
7. Jaringan pembuluh batang (cm). Pengukuran jaringan pembuluh batang dilakukan dengan menggunakan mikroskop pada 4 bulan setelah tanam. Pengamatan diameter pembuluh batang diukur pada batang in vitro, batang
manggis seedling dan cabang plagiotrop. Pengambilan sampel untuk
pengamatan jaringan pembuluh batang dilakukan sama seperti nomor 6. Pengambilan sampel untuk pengamatan anatomi jaringan bidang sambungan sambung mikro in vitro dilakukan pada 4 bulan sesudah
penyambungan lalu dilakukan pengawetan dengan metode Parafin (Lampiran 1) dan metode pengirisan segar. Adapun pengambilan sampel untuk anatomi jaringan bidang sambungan pada sambung mikro di pesemaian dan grafting di lapangan juga dilakukan pada 4 bulan sesudah penyambungan, kemudian dilakukan metode pengirisan segar. Sampel yang akan diiris dibekukan di atas
microtome, lalu dilakukan pengirisan dengan ketebalan 20-25 µm. Pengamatan
anatomi jaringan dilakukan di bawah mikroskop Olympus BX51 menggunakan kamera digital mikroskop tipe DP25, software DP2-BSW, dengan pembesaran 4x/0,16.
Manipulasi Media pada Setek Mikro Manggis Secara In Vitro
Bahan
Bahan tanaman yang digunakan adalah setek mikro dari perkecambahan manggis in vitro. Media MS, Pure Agar, vermikulit diameter 2-4 mm, Bayclin,
alkohol 70 dan 96%, fungisida dan bakterisida, deterjen. Zat pengatur tumbuh yang digunakan adalah indole butiric acid (IBA).
Metode Penelitian
Percobaan disusun menggunakan percobaan faktorial Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 15 ulangan untuk setiap perlakuan. Ada tiga faktor yang digunakan yaitu, 1) Konsentrasi komposisi media dasar MS (100%, 50%, 25%), 2) jenis substrat (agar 7 g/l, agar 4 g/l, vermikulit (dengan media cair), 3) konsentrasi IBA (indole butiric acid) (0 dan 5 mg/l).
Pelaksanaan
Penyiapan Tunas Mikro
Tunas mikro yang digunakan pada penelitian ini didapatkan dari hasil perbanyakan in vitro. Bahan yang digunakan adalah biji manggis yang berasal
dari Purwakarta dan sekitarnya. Biji dibersihkan arilnya, kemudian dipilih yang besar dan beratnya hampir seragam (≥ 1 g). Biji manggis segar dilepaskan dari selaput berserat tempat menempelnya daging buah. Biji kemudian dicuci dengan air deterjen encer selama 10 menit, lalu masuk ke laminar air flow cabinet. Biji
selanjutnya direndam dalam larutan fungisida dan bakterisida (masing-masing 8 g /l selama 30 menit sambil dikocok. Biji dibilas dengan aquades steril, lalu direndam dalam larutan alkohol 70% selama tiga menit dan dibilas dengan aquades steril.
Biji Selanjutnya direndam dalam larutan bayclin 30%, 20%, dan 10% masing-masing selama 10, 15, dan 20 menit lalu dibilas dengan air steril. Biji yang sudah steril lalu ditiriskan di atas kertas saring steril. Biji yang telah steril lalu dibelah empat dan segera ditanam pada media yang sudah disiapkan. Penanaman untuk memperoleh tunas mikro dilakukan pada media MS yang diberi zat pengatur tumbuh Benzyl Adenin (BA) 5 mg/l dan sukrosa 3%. Pemadatan media dilakukan dengan penambahan agar 6,5 g/ldengan pH media 5,8. Pada biji manggis yang dibelah, penanaman dilakukan dengan bagian luka menempel pada media. Untuk setiap botol kultur ditanam empat eksplan. Botol- botol berisi potongan biji yang akan menghasilkan tunas mikro ini lalu ditumbuhkan dalam ruang kultur bersuhu 25-27oC dengan penyinaran 16 jam terang 8 jam gelap.
Setek Mikro
Tunas manggis dari perbanyakan in vitro dipilih yang telah berumur 4
sampai 8 minggu, berukuran tinggi lebih dari 3 cm dan sudah mempunyai sepasang daun. Tunas manggis mikro yang belum berakar kemudian dipotong sampai batas 2 cm dari pangkal batang. Tunas lalu ditanam pada media yang sudah disiapkan dengan tambahan lain sesuai perlakuan. Tunas disimpan pada ruang kultur bersuhu 25-27oC tanpa penyinaran selama 2 minggu. Setelah
41
mengalami masa gelap selama 2 minggu, botol-botol berisi tunas mikro tersebut kemudian dipindahkan pada ruang inkubasi dengan penyinaran 16 jam terang 8 jam gelap.
Tunas manggis dikulturkan selama 3 bulan, setelah itu dilakukan