BAHAN DAN METODE

Probandus

Probandus penderita diare yang diperoleh selama proses sampling di Puskesmas Cangkurawok, Dramaga, Bogor mulai tanggal 24 Februari 2010 hingga 10 Juni 2010 adalah 100 pasien penderita diare. Seluruh sampel yang diperoleh telah melalui proses perizinan (lampiran 1). Probandus penderita diare yang diperoleh dikelompokkan berdasarkan tingkatan usia, yaitu usia bayi (0-1 tahun) sebanyak 13 pasien, batita (1-3 tahun) 42 pasien, balita (3-5 tahun) 13 pasien, anak-anak (5-18 tahun) 13 pasien, dan dewasa (>18 tahun) sebanyak 19 pasien (Lampiran 2).

Metode

Pengambilan sampel Feses

Feses diambil dengan cara usap rektum (rectal swab) menggunakan cuttonbud steril secara langsung pada lubang anal lalu diinokulasikan ke dalam tabung berisi larutan PBS (Phosphate Buffered Saline) steril dan ditempatkan pada kondisi dingin (Adkins & Santiago 1987).

Darah

Jari dibersihkan dengan alkohol kemudian darah diambil pada bagian jari tengah atau manis dengan menggunakan lancet. Darah dimasukkan pada tabung hematokrit berheparin (Marienfeld) dan disumbat dengan lilin pada salah satu bagian.

Isolasi bakteri Salmonella

Sampel feses dalam larutan PBS dipipet sebanyak 0.1 ml, kemudian disebar pada media SSA (Salmonella Shigella Agar/Criterion) lalu diinkubasi pada suhu 37^oC selama 24-48 jam. Koloni berwarna hitam diambil sebanyak satu lup kemudian digores kuadran pada media SSA dan diinkubasi kembali pada suhu yang sama. Koloni tunggal digoreskan pada media SSA miring untuk disimpan.

Pewarnaan Gram

Sebanyak satu lup koloni hitam dioleskan pada kaca objek yang telah ditetesi dengan akuades. Olesan bakteri dikeringkan dengan cara dilewatkan di atas bunsen. Olesan bakteri diwarnai dengan pewarna crystal violet selama 1 menit lalu dibilas dengan akuades. Kemudian dilanjutkan dengan tahap pewarnaan dengan iodium gram selama 2 menit lalu dibilas kembali dengan akuades. Olesan bakteri digenangi dengan alkohol 95% kemudian diwarnai kembali dengan safranin selama 30 detik lalu dibilas (Tortora et al. 2007). Setelah kering, olesan bakteri diamati di bawah mikroskop.

Identifikasi

Identifikasi dilakukan untuk mengetahui keberadaan Salmonella menggunakan uji biokimia mengacu pada Madigan et al. (2009), yaitu uji MR (Methyl Red), VP (Voges Proskauer), urease, H₂S (Hidrogen Sulfida), KCN (Kalium Sianida), indol, dan sitrat.

Uji MR dan VP

Koloni hitam dari media SSA diambil sebanyak satu lup, kemudian diinkubasi dalam media MR/VP (Difco^TM) pada suhu 37⁰C selama 24 jam untuk MR dan 4 hari untuk VP. Setelah diinkubasi, media diberi reagen methyl red

untuk MR dan α-napthol serta KOH untuk VP. Uji Urease

Koloni hitam dari media SSA diambil sebanyak satu lup, kemudian diinkubasi pada media urease (Difco^TM) selama kurang lebih 4 hari.

Uji H2S

Koloni hitam dari media SSA diambil sebanyak satu lup, kemudian digoreskan ke media miring TSIA (Triple Sugar Iron Agar/Difco^TM) lalu ditusuk menggunakan lup di bagian bawah media. Inkubasi dilakukan pada suhu 37^oC selama 24 jam.

Uji KCN

Bakteri yang tumbuh pada media TSIA dari uji H₂S ditumbuhkan pada media TB (Terrifict Broth), lalu diinkubasi selama 24 jam. Setelah 24 jam, sebanyak satu lup bakteri dipindahkan ke media KCN lalu diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 37^oC.

Uji Indol

hingga Oktober 2010. Pengambilan sampel dilakukan di Puskesmas Cangkurawok, Dramaga, Bogor. Analisis sampel feses dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan sampel darah di Laboratorium Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, FMIPA, Institut Pertanian Bogor.

Probandus

Metode

Pengambilan sampel Feses

Darah

Isolasi bakteri Salmonella

Pewarnaan Gram

Identifikasi

Uji MR dan VP

untuk MR dan α-napthol serta KOH untuk VP. Uji Urease

Koloni hitam dari media SSA diambil sebanyak satu lup, kemudian diinkubasi pada media urease (Difco^TM) selama kurang lebih 4 hari.

Uji H2S

Uji KCN

Uji Indol

pada media tripton (Bacto^TM) pada suhu 37^oC selama 24 jam. Setelah diikubasi, media ditetesi dengan reagen Kovac.

Uji Sitrat

Sebanyak satu lup koloni hitam pada media SSA digores pada media simmon citrate (Acumedia), lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37^oC.

Penghitungan nilai hematokrit

Darah dalam tabung hematokrit berheparin disentrifugasi dengan sentrifuse (P Selecta Iso 9001) pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Nilai hematokrit dihitung dengan membandingkan tinggi porsi sel darah merah terhadap tinggi keseluruhan darah dalam bentuk persen.

Penghitungan Jumlah Leukosit

Darah dikeluarkan dari tabung hematokrit berheparin lalu dipipet dengan pipet leukosit hingga batas 0.5. Darah diencerkan dengan larutan Turk sampai batas skala 11 lalu dikocok (Simmons 1976). Larutan diteteskan pada hemasitometer kemudian dihitung butiran-butiran leukositnya.

Diferensiasi Leukosit

Perhitungan diferensiasi leukosit dilakukan dengan metode apus/smear (Simmons 1976). Apusan darah diwarnai dengan pewarna Giemsa 30% selama 30 menit, kemudian dihitung masing-masing jenis leukosit/100 jenis leukosit yang diamati.

HASIL

Hasil dari isolasi 100 sampel feses diperoleh 5 isolat membentuk koloni hitam pada media SSA yang diduga sebagai koloni Salmonella

(Gambar 1). Pewarnaan gram dari kelima isolat menunjukkan warna merah muda yang menandakan bahwa kelima isolat tersebut adalah bakteri gram negatif (Gambar 2).

Gambar 1 Koloni hitam yang diduga Salmonella

pada media SSA. Tanda panah: koloni hitam.

Gambar 2 Warna merah muda bakteri gram negatif setelah pewarnaan gram pada koloni hitam yang diduga

Salmonella. Tanda panah: bakteri gram negatif.

Hasil uji biokimia pada kelima isolat koloni hitam diperoleh 3 isolat yang teridentifikasi

Salmonella. Berdasarkan uji biokimia, sampel feses yang teridentifikasi terdapat Salmonella

berasal pasien nomor 12, 21 dan 85 (Tabel 1). Keberadaan Salmonella ditunjukkan dengan hasil positif untuk uji MR, yaitu terbentuk warna merah pada media setelah diinkubasi selama 24 jam dan diberi indikator methyl red

(Gambar 3). Salmonella dapat menghasilkan asam campuran (metilen glikon) yang akan menurunkan pH media hingga 4.4, sehingga warna media akan berubah menjadi merah setelah diberi indikator methyl red (WHO 2003).

Uji VP menunjukkan hasil negatif untuk keberadaan Salmonella pada media. Hasil negatif ditunjukkan jika tidak terbentuk warna merah pada media setelah inkubasi dan diberi reagen α-naphtol dan KOH (Gambar 4).

Salmonella tidak dapat memproduksi

acetilmethyl carbinol (acetoin) dari proses fermentasi glukosa (Garibaldi & Bayne 1970).

Keberadaan Salmonella ditunjukkan dengan hasil negatif untuk uji urease. Hasil yang terlihat adalah tidak terjadi perubahan warna menjadi merah keunguan pada semua media yang diujikan (Gambar 5). Salmonella tidak dapat mengubah urea menjadi amonia dan karbondioksida di dalam media sehingga menyebabkan kondisi media tidak berubah menjadi basa dan indikator phenol red tidak bekerja. Oleh karena itu media tidak berubah menjadi merah keunguan (WHO 2003).

Berdasarkan uji H₂S, diperoleh 2 isolat yang membentuk warna hitam pada bagian dasar media dan warna merah pada bagian lereng media miring (isolat nomor 3 dan 4), sedangkan 3 lainnya membentuk warna kuning (isolat nomor 1, 2, dan 5) (Gambar 6). Keberadaan

Salmonella seharusnya ditunjukkan dengan terbentuknya warna hitam pada dasar media, namun Salmonella yang diperoleh tidak

pada media tripton (Bacto^TM) pada suhu 37^oC selama 24 jam. Setelah diikubasi, media ditetesi dengan reagen Kovac.

Uji Sitrat

Sebanyak satu lup koloni hitam pada media SSA digores pada media simmon citrate (Acumedia), lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37^oC.

Penghitungan nilai hematokrit

Penghitungan Jumlah Leukosit

Diferensiasi Leukosit

HASIL

Hasil dari isolasi 100 sampel feses diperoleh 5 isolat membentuk koloni hitam pada media SSA yang diduga sebagai koloni Salmonella

(Gambar 1). Pewarnaan gram dari kelima isolat menunjukkan warna merah muda yang menandakan bahwa kelima isolat tersebut adalah bakteri gram negatif (Gambar 2).

Gambar 1 Koloni hitam yang diduga Salmonella

pada media SSA. Tanda panah: koloni hitam.

Gambar 2 Warna merah muda bakteri gram negatif setelah pewarnaan gram pada koloni hitam yang diduga

Salmonella. Tanda panah: bakteri gram negatif.

Hasil uji biokimia pada kelima isolat koloni hitam diperoleh 3 isolat yang teridentifikasi

Salmonella. Berdasarkan uji biokimia, sampel feses yang teridentifikasi terdapat Salmonella

Salmonella tidak dapat memproduksi

acetilmethyl carbinol (acetoin) dari proses fermentasi glukosa (Garibaldi & Bayne 1970).

Salmonella seharusnya ditunjukkan dengan terbentuknya warna hitam pada dasar media, namun Salmonella yang diperoleh tidak

membentuk warna hitam, karena Salmonella

yang diperoleh tidak menghasilkan H2S pada media TSIA. Produksi H₂S berasal dari pemecahan asam amino yang mengandung unsur belerang (sulfur) seperti lisin dan metionin lalu membentuk H₂S yang bereaksi dengan ion Fe²⁺sehingga menghasilkan warna hitam (WHO 2003). Salmonella tidak dapat hidup pada media KCN, hal ini ditunjukkan dengan tidak terjadi perubahan media KCN menjadi keruh (Gambar 7).

Keberadaan Salmonella menunjukkan hasil negatif untuk uji indol pada semua media yang diujikan. Hasil negatif ditunjukkan jika tidak membentuk cincin berwarna merah di permukaan media setelah diinkubasi dan diberikan reagen Kovac (Gambar 8). Salmonella

tidak dapat mengekstraksikan indol menjadi

amyle-alcohol. Ekstraksi indol ke dalam bentuk

amyle-alcohol setelah diberi reagen Kovac menyebabkan terbentuknya cincin berwarna merah pada bagian permukaan media (WHO 2003). Uji sitrat menunjukkan hasil yang positif untuk keberadaan Salmonella, yaitu terjadi perubahan warna media dari hijau menjadi biru, hal ini menandakan bahwa Salmonella mampu memanfaatkan sitrat sebagai sumber karbon (Gambar 9).

Gambar 3 Uji MR pada koloni hitam yang diduga Salmonella.

Gambar 4 Uji VP pada koloni hitam yang diduga Salmonella.

Gambar 5 Uji urease pada koloni hitam yang diduga Salmonella.

Gambar 6 Uji H₂S pada koloni hitam yang diduga Salmonella (a) isolat 1 (b) isolat 2 (c) isolat 3 (d) isolat 4 (e) isolat 5.

Gambar 7 Uji H₂S pada koloni hitam yang diduga Salmonella (a) isolat 1 (b) isolat 2 (c) isolat 3 (d) isolat 4 (e) isolat 5. Tanda panah: keruh.

Gambar 8 Uji indol pada koloni hitam yang diduga Salmonella.

Gambar 9 Uji sitrat pada koloni hitam yang diduga Salmonella

c d

e

b

a

Tabel 1 Uji biokimia koloni hitam yang diduga sebagai Salmonella pada media SSA No.

Pasien

No.

Isolat MR VP Urease H₂S KCN Indol Sitrat 12 1 + - - - - - +

21 2 + - - - - - +

38 3 + - - + + - +

72 4 + - - + + - +

85 5 + - - - - - + MR (methyl red), VP(Voges Proskauer), H₂S (Hidrogen Sulfida), KCN (Kalium Sianida). + (hasil positif), - (hasil negatif), : Salmonella

Berdasarkan analisis sampel darah, diperoleh nilai hematokrit normal pada ketiga pasien diare yang fesesnya teridentifikasi terdapat

Salmonella. Jumlah leukosit normal dimiliki oleh pasien nomor 12 dan 85, sedangkan pasien nomor 21 memiliki jumlah leukosit yang rendah (Tabel 2). Ketiga pasien tersebut secara umum mengalami diare cair, tanpa lendir dan darah serta memiliki berat badan yang cukup.

Hasil diferensiasi dari ketiga pasien yang fesesnya teridentifikasi terdapat Salmonella

diperoleh variasi persentase jenis leukosit (Tabel 3). Persentase limfosit tinggi dimiliki oleh

ketiga pasien yang fesesnya teridentifikasi terdapat Salmonella, sedangkan persentase monosit yang tinggi dimiliki oleh pasien nomor 12 dan 85. Persentase basofil tinggi dimiliki oleh pasien nomor 21, hal ini kemungkinan adanya respon alergi pada pasien. Pasien nomor 12 memiliki persentase eosinofil yang tinggi yang memperlihatkan bahwa telah terjadi infeksi oleh parasit. Persentase neutrofil yang rendah terjadi pada pasien nomor 12 dan 21, hal ini kemungkinan karena terjadinya infeksi yang berkepanjangan.

Tabel 2 Nilai hematokrit, jumlah leukosit, dan diagnosis pasien yang fesesnya teridentifikasi terdapat

Salmonella No. Pasien No. Isolat ^JK BB (kg) Usia (thn) ^{Diagnosis Hematokrit(%)} Jumlah Leukosit 12 1 P 46 29 ^{Sehari 2x, cair tanpa}

darah dan lendir ^46,15 ⁴²⁵⁰ 21 2 L 73 35 ^{Sehari 2x, cair tanpa}

darah dan lendir ^47,5 ²³⁵⁰ 85 5 P 8,7 2

Sudah 2 hari, 3x sehari, cair dengan

darah dan lendir

33,33 4375

Tabel 3 Diferensiasi leukosit pada pasien diare yang fesesnya teridentifikasi terdapat Salmonella

No. Pasien ^Status No. Isolat Limfosit (%) Monosit (%) Eosinofil (%) Basofil (%) Neutrofil (%) 12 Dewasa ^{1 68 11 5 - 16} 21 2 82 4 3 4 7 85 Balita 5 23 15 3 1 58

L : Limfosit, M : Monosit, E : Eosinofil, B : Basofil, N : Neutrofil

PEMBAHASAN

Kumpulan koloni bakteri di dalam feses akan terseleksi oleh media yang digunakan. Koloni bakteri yang dapat hidup di dalam media SSA antara lain Salmonella, Shigella, E.coli,

Citrobacter, Proteus, dan Pseudomonas (Bailey & Scott 1974).

Lima isolat koloni hitam yang diduga sebagai Salmonella pada media SSA menunjukkan bahwa bakteri tersebut tidak dapat memfermentasikan laktosa tetapi dapat memproduksi H₂S. Shigella dan Salmonella

merupakan salah satu bakteri yang tidak dapat memfermentasikan laktosa. Kedua bakteri ini dapat dibedakan melalui kemampuannya memproduksi H₂S (Jawetz et al. 1974; Madigan

et al. 2009).

Pewarnaan gram terhadap kelima isolat koloni hitam yang diduga sebagai salmonella

menunjukkan bakteri gram negatif. Bakteri gram negatif akan menunjukkan warna merah muda pada pewarnaan gram karena bakteri gram negatif memiliki komponen lipid yang lebih tebal pada dinding selnya. Bakteri gram negatif tidak dapat menjerap pewarna crystal violet

karena lipid akan terekstraksi ketika dicuci dengan alkohol 95%, pori-pori membesar, dan pewarna crystal violet akan tercuci (White 1995; Tortora 2007).

Kelima isolat koloni hitam yang diduga sebagai Salmonella diidentifikasi dengan uji biokimia. Menurut Madigan et al. (2009) uji biokimia yang dilakukan untuk mengidentifikasikan keberadaan Salmonella adalah uji MR, VP, urease, H₂S, KCN, indol, dan sitrat. Suatu uji akan dihentikan jika bakteri yang diujikan menunjukkan hasil yang tidak sesuai. Keberadaan Salmonella ditunjukkan dengan hasil positif untuk uji MR, H₂S, dan sitrat, serta hasil negatif untuk uji VP, urease, KCN, dan indol.

Berdasarkan uji identifikasi yang dilakukan pada penelitian ini, diperoleh hasil identifikasi yang kurang sesuai dengan yang diungkapkan oleh Madigan et al. (2009) untuk uji H2S dan KCN. Salmonella yang diperoleh pada penelitian ini menunjukkan hasil negatif untuk uji H₂S, karena tidak memproduksi H₂S pada media TSIA. Sebagian besar Salmonella dapat menghasilkan H2S, namun ada beberapa serotipe dari Salmonella yang tidak atau hanya sedikit sekali membentuk H₂S pada media TSIA, yaitu Salmonella typhi dan Salmonella paratyphi (Olitzky et al. 1956). Salmonella parathyphi diketahui dapat memproduksi asam yang berlebih pada media TSIA sehingga dapat mengubah warna media menjadi kuning. Hal ini yang memungkinkan Salmonella yang diperoleh tidak membentuk H₂S. Identifikasi seperti ini dapat menjadi masalah dalam proses identifikasi bakteri non-Salmonella (Procop et al. 2008).

Oleh karena itu, uji H₂S dengan menggunakan media TSIA kurang menunjukkan hasil yang maksimal, karena tidak semua serotipe

Salmonella dapat menghasilkan H₂S pada media tersebut.

Uji KCN dilakukan untuk meyakinkan pengujian keberadaan Salmonella dari koloni hitam lainnya setelah pengujian H₂S. Menurut Munson (1974), uji KCN digunakan untuk membedakan beberapa grup bakteri dari famili Enterobacteriaceae khususnya Salmonella

(sensitif KCN) dan Citrobacter (tahan KCN).

Selain uji biokimia, terdapat alternatif lain untuk proses identifikasi yaitu menggunakan kit. Identifikasi dengan menggunakan kit (Microbac 2000) pernah dilakukan pada salah satu isolat yang menunjukkan hasil positif uji H₂S (isolat nomor 3). Identifikasi menggunakan kit yang dilakukan pada penelitian ini bertujuan untuk memastikan hasil yang diperoleh dari uji biokimia. Hasil yang diperoleh ternyata tidak menunjukkan genus Salmonella melainkan

Citrobacter. Oleh karena itu, tahapan metode yang diungkapkan oleh Madigan et al. (2009) tidak cocok untuk identifikasi ragam Salmonella

yang menginveksi penderita diare di Puskesmas Cangkurawok, Dramaga, Bogor.

Persentase pasien diare yang fesesnya teridentifikasi terdapat Salmonella hanya 3% dari 100 pasien. Kondisi tersebut memperlihat-kan bahwa tidak hanya Salmonella yang dapat menyebabkan diare, tetapi ada faktor lain yang menyebabkan diare seperti adanya infeksi bakteri lain, virus, atau parasit.

Diare erat kaitannya dengan dehidrasi. Tingkatan dehidrasi dapat dilihat dari nilai hematokrit. Nilai hematokrit normal pada pria berkisar antara 45-52%, wanita 37-48%, dan pada balita berkisar antara 29-41% (Fox 2004). Nilai hematokrit akan meningkat ketika komponen darah meningkat atau kadar plasma darah menurun (Retno 2009). Berdasarkan nilai hematokrit yang diperoleh, ketiga pasien diare yang fesesnya teridentifikasi terdapat

Salmonella, memiliki nilai hematokrit yang normal. Hal ini menandakan bahwa belum terjadi dehidrasi pada penderita diare. Dehidrasi tidak terjadi karena waktu terjadinya diare belum terlalu lama dan frekuensi buang air besar penderita diare tidak terlalu sering, sehingga belum terjadi penurunan cairan di dalam tubuh. Hilangnya cairan tubuh dapat ditanggulangi dengan pemberian oralit pada penderita diare (Harianto 2004).

Analisis perhitungan leukosit memperlihat-kan jumlah leukosit normal dan rendah. Leukosit normal pada manusia berkisar antara 4000-10.000 butir/mm³ darah (Fox 2004). Rendahnya jumlah leukosit dapat diakibatkan

karena adanya infeksi virus, terjadi irradiasi ionisasi pada sumsung tulang, dan malnutrisi (Gidali et al. 1964; Nassar et al. 2009). Umumnya infeksi dapat mempengaruhi sel pertahanan tubuh yang dapat terlihat dari meningkatnya jumlah leukosit.

Jumlah leukosit normal tidak menandakan penderita terbebas infeksi, hal ini dapat terlihat dari hasil diferensisasi leukosit. Normalnya jumlah leukosit yang normal kemungkinan dipengaruhi oleh waktu terjadi infeksi yang belum terlalu lama, sehingga ketika dilakukan pemeriksaan jumlah leukosit masih dalam keadaan normal. Hasil diferensiasi leukosit memperlihatkan adanya persentase jenis leukosit yang bervariasi. Diferensiasi leukosit menunjukkan keadaan normal apabila persentase limfosit 25-33%, monosit 3-9%, neutrofil 54-62%, eosinofil 1-3%, dan basofil kurang dari 1% (Fox 2004). Persentase limfosit yang tinggi menunjukkan telah terjadi infeksi oleh bakteri. Limfosit berperan sebagai sistem imun yang berfungsi membunuh bakteri dan membantu tipe sel lain dalam sistem imun (Fatmah 2006)

.

Monosit berperan untuk proses fagositosis. Monosit dapat berdiferensiasi menjadi makrofag pada sel atau jaringan yang terluka dan memakan benda asing yang menyebabkan infeksi (Santos et al. 2003).

Neutrofil adalah pertahanan pertama dalam melawan mikroorganisme yang masuk ke dalam tubuh. Ketika ada serangan mikroorganisme patogen, mekanisme pertahanan ditandai oleh peningkatan jumlah neutrofil dalam pembuluh darah periferal dan bermigrasi ke bagian yang terinfeksi untuk memfagositasi mikrorganisme penyebab infeksi (Karan et al. 2005). Persentase basofil dan eosinofil menandakan terjadinya respon alergi dalam tubuh dan adanya infeksi oleh parasit (Fox 2004).

Dalam dokumen Salmonella, leukosit, dan hematokrit dari penderita diare di Puskesmas Cangkurawok, Dramaga, Bogor (Halaman 27-34)