Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di laboratorium, ruang penumbuh (growth chamber), dan rumah kaca. Penelitian di laboratorium dan ruang penumbuh dilaksanakan di Laboratorium Biologi dan Kesehatan Tanah, Balai Penelitian Tanah, Bogor. Sedangkan percobaan di rumah kaca dilakukan di Instalasi Rumah Kaca, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Cimanggu, Bogor.
Bahan Penelitian
Penelitian ini menggunakan isolat bakteri Pseudomonas; cendawan patogen Fusarium oxysporum, Sclerotium rolfsii, dan Rhizoctonia solani; bakteri bintil akar Bradyrhizobium japonicum Bj11 dan Sinorhizobium fredii Rif5; benih kedelai varietas Wilis; plastik kantong tumbuh (growth pouches); dan tanah untuk pengujian tanaman di rumah kaca.
Bakteri Pseudomonas yang diuji adalah sebanyak 82 isolat Pseudomonas
non-patogen yang diisolasi dari rizosfer tanaman kedelai di daerah Plumbon, Cirebon, Jawa Barat. Sebanyak 81 isolat merupakan isolat penghasil hormon asam indol asetat (IAA) dengan kemampuan sintesis secara in vitro berkisar dari 1,13 – 20,49 µg ml-1 (Wahyudi et al. 2007). Isolat Pseudomonas tersebut adalah isolat dengan kode Crb1 sampai Crb6, Crb8 sampai Crb37, Crb39 sampai Crb56, Crb60, Crb74, Crb75, Crb78 sampai Crb87, Crb89, Crb92 sampai Crb95, Crb102, Crb104, dan Crb109 sampai Crb115. Satu isolat yang bukan penghasil IAA, yaitu
Pseudomonas Crb38 yang disertakan dalam penelitian ini, digunakan sebagai kontrol negatif. Daftar isolat dan kemampuannya menghasilkan IAA dalam media cair yang diperkaya dengan triptofan (prekursor IAA) disajikan pada Tabel 1.
12
Tabel 1. Isolat-isolat Pseudomonas dan kemampuannya menghasilkan IAA yang digunakan dalam penelitian ini.
No Kode Isolat IAA (ppm) No Kode Isolat IAA (ppm)
1 Crb1 10,21 42 Crb43 5,08 2 Crb2 9,58 43 Crb44 3,73 3 Crb3 2,32 44 Crb45 9,65 4 Crb4 9,46 45 Crb46 15,80 5 Crb5 12,75 46 Crb47 10,36 6 Crb6 8,35 47 Crb48 8,98 7 Crb8 7,40 48 Crb49 16,19 8 Crb9 8,98 49 Crb50 10,01 9 Crb10 7,64 50 Crb51 10,17 10 Crb11 8,35 51 Crb52 17,53 11 Crb12 6,68 52 Crb53 16,86 12 Crb13 7,40 53 Crb54 16,90 13 Crb14 3,45 54 Crb55 8,79 14 Crb15 13,99 55 Crb56 18,47 15 Crb16 4,89 56 Crb60 8,04 16 Crb17 16,02 57 Crb74 7,72 17 Crb18 7,82 58 Crb75 7,13 18 Crb19 3,37 59 Crb78 6,40 19 Crb20 5,16 60 Crb79 19,67 20 Crb21 14,15 61 Crb80 4,45 21 Crb22 3,45 62 Crb81 18,67 22 Crb23 13,17 63 Crb82 6,63 23 Crb24 15,16 64 Crb83 5,04 24 Crb25 2,20 65 Crb84 14,63 25 Crb26 12,53 66 Crb85 19,72 26 Crb27 1,98 67 Crb86 6,31 27 Crb28 12,16 68 Crb87 6,26 28 Crb29 2,64 69 Crb89 5,45 29 Crb30 4,31 70 Crb92 1,44 30 Crb31 5,45 71 Crb93 7,60 31 Crb32 2,60 72 Crb94 1,13 32 Crb33 3,26 73 Crb95 7,24 33 Crb34 2,82 74 Crb102 6,48 34 Crb35 12,53 75 Crb104 20,49 35 Crb36 4,39 76 Crb109 9,18 36 Crb37 2,34 77 Crb110 5,85 37 Crb38 0 78 Crb111 10,93 38 Crb39 3,91 79 Crb112 6,88 39 Crb40 8,66 80 Crb113 9,30 40 Crb41 3,73 81 Crb114 9,62 41 Crb42 4,61 82 Crb115 7,75
13
Biakan murni cendawan patogen akar kedelai R. solani diperoleh dari Laboratorium Biologi dan Kesehatan Tanah, Balai Penelitian Tanah, Bogor, sedangkan F. oxysporum dan S. rolfsii diperoleh dari Dr. Abjad Asih Nawangsih, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor (IPB), Bogor. Bakteri bintil akar B. japonicum Bj11 diperoleh dari Dr. Aris Tri Wahyudi, Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB Bogor; sedangkan
S. fredii Rif5 diperoleh dari Laboratorium Biologi dan Kesehatan Tanah, Balai Penelitian Tanah, Bogor.
Benih kedelai varietas Wilis diperoleh dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor. Tanah untuk penelitian di rumah kaca adalah tanah Ultisol lapisan atas (0-20 cm) yang berasal dari tanah pertanian di daerah Leuwiliang-Jasingga, Bogor.
Tahapan Penelitian
Penelitian dimulai dengan kegiatan penapisan (screening) isolat-isolat
Pseudomonas yang mampu memacu pertumbuhan tanaman kedelai pada media steril kantong tumbuh (growth pouch) yang dilaksanakan di ruang penumbuh (growth chamber). Isolat-isolat yang mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman kedelai, selanjutnya diuji aktivitas ACC deaminase dan kompatibilitasnya dengan bakteri bintil akar B. japonicum Bj11 dan S. fredii Rif5 secara in vitro.
Isolat-isolat Pseudomonas terbaik yang diperoleh, yaitu isolat yang mampu memacu pertumbuhan tanaman, memiliki aktivitas ACC deaminase, dan tidak antagonis terhadap bakteri bintil akar, selanjutnya diuji pada tanaman kedelai pada tanah pada pot di rumah kaca. Pengujian ini mencakup kemampuan isolat Pseudomonas yang terpilih dalam meningkatkan pertumbuhan dan ketahanan tanaman kedelai terhadap penyakit pada tanah steril dan non-steril di rumah kaca. Secara skematis alur tahapan penelitian disajikan pada Gambar 3.
14
15
Penapisan in plantaPseudomonas Pemacu Tumbuh
Penapisan kemampuan isolat-isolat Pseudomonas memacu pertumbuhan tanaman kedelai dilakukan pada media steril kantong tumbuh yang ditempatkan pada rak-rak di ruang penumbuh (Gambar 4).
Gambar 4. Penapisan Pseudomonas pemacu tumbuh pada media steril kantong tumbuh. Rak kantong tumbuh (A), penempatan kantong tumbuh pada rak (B), dan penempatan kedelai pada tiap kantong tumbuh (C).
Prosedur penapisan dengan kantong tumbuh mengikuti protokol pengujian Liftshitz et al. (1987). Kantong tumbuh terbuat dari plastik tebal tahan panas berukuran 18 cm (lebar) x 19 cm (panjang). Di dalam tiap kantong diberi 3 potongan kertas saring, masing-masing selebar 5 cm dengan panjang seukuran bagian dalam kantong tumbuh. Bagian atas kertas saring diberi lipatan untuk dudukan biji kedelai yang ditumbuhkan. Kantong tumbuh sebelum digunakan disterilisasi dengan autoklaf selama 3 hari berturut-turut (1 jam per hari).
Penapisan isolat dilakukan dalam 6 set percobaan (A sampai dengan F), masing-masing set terdiri atas 14 sampai dengan 17 perlakuan (termasuk perlakuan kontrol tanpa inokulasi isolat dan kontrol inokulasi dengan isolat bukan-penghasil IAA Crb38). Isolat Pseudomonas yang digunakan pada masing- masing set percobaan disajikan pada Tabel 2.
Percobaan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL), masing-masing perlakuan diulang 5 kali, tiap ulangan terdiri atas 3 tanaman (1 kantong tumbuh terdiri atas 3 tanaman), sehingga nilai tiap ulangan merupakan nilai rata-rata dari 3 tanaman.
16
Tabel 2. Isolat-isolat Pseudomonas pada masing-masing set percobaan.
No. Set Percobaan
A B C D E F
1. K (Blanko) K (Blanko) K (Blanko) K (Blanko) K (Blanko) K (Blanko) 2. K (Crb38) K (Crb38) K (Crb38) K (Crb38) K (Crb38) K (Crb38) 3. Crb1 Crb3 Crb2 Crb5 Crb4 Crb9 4. Crb18 Crb15 Crb6 Crb8 Crb10 Crb11 5. Crb19 Crb16 Crb13 Crb12 Crb14 Crb20 6. Crb25 Crb21 Crb17 Crb24 Crb51 Crb30 7. Crb29 Crb26 Crb23 Crb36 Crb55 Crb37 8. Crb33 Crb27 Crb23 Crb39 Crb82 Crb45 9. Crb42 Crb28 Crb31 Crb53 Crb84 Crb50 10. Crb44 Crb32 Crb43 Crb75 Crb92 Crb52 11. Crb46 Crb34 Crb79 Crb78 Crb93 Crb54 12. Crb49 Crb35 Crb80 Crb83 Crb102 Crb89 13. Crb60 Crb40 Crb81 Crb87 Crb104 Crb95 14. Crb74 Crb41 Crb85 Crb94 Crb109 Crb111 15. Crb47 Crb86 Crb110 Crb112 16. Crb48 Crb115 Crb114 Crb113 17. Crb56
Keterangan: K (Blanko) = tanpa inokulasi dengan isolat; K (Crb38) = inokulasi kedelai dengan isolat yang tidak menghasilkan IAA.
Biji kedelai sebelum digunakan disterilisasi dengan alkohol 70% dan larutan natrium hipokhlorida (NaOCl 0,21 M). Biji dibasahi alkohol 70% selama 1 menit, kemudian direndam dalam larutan sodium hipokhlorida (NaOCl) selama 5 menit. Pembilasan untuk menghilangkan sisa NaOCl menggunakan akuades steril, kemudian HCl 0,01 M, dan terakhir dengan akuades steril sebanyak 5 kali. Biji kedelai yang sudah steril diinokulasi dengan masing-masing suspensi sel.
Suspensi sel disiapkan dengan menumbuhkan masing-masing isolat dalam
media cair King’s B selama 24 jam pada mesin pengocok (shaker) pada kecepatan 125 rpm, kemudian dipindahkan ke media cair kaya M26 untuk produksi sel. Komposisi media cair King’s B adalah 20 g proteose pepton; 10 ml gliserol; 1,5 g K2HPO4; dan 1,5 g MgSO4.7H2O yang dilarutkan dalam 1000 ml akuades. Media cair M26 mengandung 10 g ekstrak beef; 10 g pepton; dan 5 g NaCl yang
17
dilarutkan dalam 1000 ml akuades. Sterilisasi media dilakukan dengan autoklaf pada suhu 121oC dan tekanan 0,1 MPa selama 15 menit. Suspensi sel pada media cair M26 (setelah ditumbuhkan selama 24 jam pada mesin pengocok pada kecepatan 125 rpm) disentrifus pada kecepatan 4000 g selama 10 menit untuk mendapatkan pelet sel. Pelet sel dibilas dengan akudes steril dan selanjutnya disuspensikan kembali dalam larutan 100 mM MgSO4 steril (pH 7). Suspensi sel diatur pada absorbansi 0,5 dengan panjang gelombang 780 nm yang jumlah selnya setara dengan 108 - 109 sel ml-1.
Inokulasi biji kedelai steril dilakukan dengan merendam biji dalam masing-masing suspensi sel isolat (108 - 109 sel ml-1) sesuai dengan masing- masing perlakuan selama 1 jam. Perlakuan kontrol tanpa inokulasi merupakan biji kedelai steril yang direndam pada larutan 100 mM MgSO4 tanpa sel. Biji yang sudah diinokulasi kemudian dikecambahkan pada kertas saring lembab steril pada cawan Petri dan ditempatkan pada ruang gelap pada suhu 28oC selama 2 hari. Tiga kecambah kedelai (panjang radikel 1 cm) ditumbuhkan pada tiap kantong tumbuh steril yang diberi 20 ml akuades steril (Gambar 5). Kantong tumbuh yang berisi kecambah kedelai diletakkan tegak lurus pada rak. Kecambah ditumbuhkan selama 7 hari di ruang tumbuh dengan suhu 24oC dengan intensitas cahaya harian sebesar 1300 lux selama 12 jam dan masa gelap harian selama 12 jam.
Perkembangan perakaran dari tiap tanaman dievaluasi dari panjang akar dan bobot akar basah. Data dianalisis dengan analisis sidik ragam (analysis of variance) yang dilanjutkan dengan uji beda nyata terkecil (least significant difference) antara hasil tanaman yang diinokulasi dan yang tidak inokulasi dengan isolat Pseudomonas. Analisis dilakukan dengan perangkat lunak SAS (statistical analysis software) system for Windows v6.12.
18
Gambar 5. Biji kedelai yang sudah diinokulasi dengan isolat Pseudomonas dan dikecambahkan pada cawan Petri (A), penempatan kecambah kedelai umur 2 hari pada media kantong tumbuh (B).
Pengujian Aktivitas Enzim ACC Deaminase
Pengujian aktivitas ACC deaminase dilakukan pada isolat Pseudomonas
yang mampu meningkatkan panjang dan bobot akar kedelai secara in planta di ruang penumbuh. Media yang digunakan adalah media garam minimal Dworkin- Foster (DF) (Dworkin & Foster 1958) yang diperkaya dengan substrat 1-
aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) atau amonium sulfat sebagai sumber nitrogen mengikuti prosedur Glick et al. (1995). Komposisi media DF adalah 4 g KH2PO4; 6 g Na2HPO4; 0,2 g MgSO4.7H2O; 1 mg FeSO4.7H2O; 10 µg H3BO3; 10 µg MnSO4; 70 µg ZnSO4; 50 µg CuSO4; 10 µg MoO3; 2 g glukosa; 2 g asam glukonat, 2 g asam sitrat; 12 g agar (untuk media padat) yang dilarutkan dalam 1000 ml akuades. Jumlah ACC atau amonium sulfat yang ditambahkan ke dalam media DF, masing-masing adalah 0,3033 g ACC atau 2 g amonium sulfat.
Kecuali bahan ACC yang tidak tahan panas (heat-labile), semua bahan media disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121oC dan tekanan 0,1 Mpa. Bahan ACC disterilisasi dengan membran filter berukuran 0,2 µ m sebelum ditambahkan (dicampurkan) ke dalam bahan yang sudah disterilkan.
Biakan isolat Pseudomonas ditumbuhkan pertama kali dalam media King’s B selama 24 jam. Pelet sel selanjutnya dipanen dengan cara sentrifusi seperti diuraikan di atas. Pelet sel dibilas dengan 100 mM MgSO4 steril dan selanjutnya diinokulasikan ke media cair dan padat DF, DF + ACC, dan DF + amonium sulfat, masing-masing sebanyak 1 ml (1 x 109 sel/ml). Pertumbuhan
19
isolat pada media cair dimonitor tiap 6 jam selama 48 jam dengan mengukur kerapatan optik biakan pada panjang gelombang 600 nm mengadaptasi metode yang dijelaskan oleh Wang et al. (2000). Nilai kerapatan optik 0,05 atau lebih, khususnya isolat yang ditumbuhan pada media DF + ACC, mengindikasikan bahwa isolat memiliki aktivitas enzim ACC deaminase. Begitu pula dengan media padat yang inokulasi dengan isolat dengan teknik gores. Isolat yang mampu tumbuh pada salah satu media DF + ACC atau DF + amonium sulfat menjadi indikasi adanya aktivitas enzim ACC deaminase. Penggunaan media DF saja (tanpa ACC maupun amonium sulfat) digunakan sebagai kontrol untuk mengetahui apakah isolat yang digunakan tergolong bakteri diazotrof yang mampu mendapatkan sumber N dengan menambat N2 dari udara.
Uji Kompatibilitas Pseudomonas dengan Rhizobia
Pengujian menggunakan bakteri bintil akar Bradyrhizobium japonicum
Bj11 dan Sinorhizobium fredii Rif5. Suspensi B. japonicum Bj11 (fase log, 100 µl dengan jumlah sel 107 per ml) diinokulasikan ke agar cawan dengan cara disebar. Media agar yang digunakan adalah media King’s B yang mampu menumbuhkan
B. japonicum Bj11 atau S. fredii Rif5 dan isolat Pseudomonas. Bulatan kertas saring steril (diameter 1 cm) dicelupkan ke suspensi isolat Pseudomonas (dari biakan 24 jam), kemudian diinokulasikan ke media agar cawan yang sudah diinokulasi B. japonicum Bj11 atau S. fredii Rif5. Media diinkubasi pada suhu 28°C selama 5 hari. Pengamatan dilakukan dengan mengamati zona hambatan oleh Pseudomonas. Sebaliknya, untuk mengetahui zona hambatan oleh rhizobia dilakukan dengan prosedur yang sama, tetapi B. japonicum Bj11 atau S. fredii
Rif5 diinokulasikan ke media agar cawan yang terlebih dahulu diinokulasi dengan isolat Pseudomonas. Isolat Pseudomonas terbaik yang tidak antagonis terhadap B. japonicum Bj11 maupun S. fredii Rif5 dipilih untuk pengujian tanaman di rumah kaca.
20
Uji Pemacu Tumbuh di Rumah Kaca
Pengujian dilakukan terhadap isolat terbaik, yakni Pseudomonas penghasil ACC deaminase yang mampu memacu pertumbuhan kedelai di ruang penumbuh (growth room) dan kompatibel dengan rhizobia atau tidak bersifat antagonis terhadap B. japonicum Bj11 ataupun S. fredii Rif5. Prosedur pengujian pada tanah di rumah kaca mengikuti metode seperti yang diterapkan Cattelan et al. (1999). Contoh tanah percobaan diayak dengan ayakan 2 mm dan ditempatkan dalam pot plastik polietilen seberat 0,5 kg/pot (tanah steril) dan 2 kg/pot (tanah non-steril). Tanah dalam polibag plastik polietilen disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121oC dan tekanan 0,1 Mpa, sebanyak 2 kali, masing-masing selama 1 jam dengan interval waktu 2 hari. Sterilisasi pot plastik polietilen dilakukan dengan cara sterilisasi permukaan plastik dengan alkohol 95%. Contoh tanah sebelum percobaan dianalisis untuk penetapan tekstur, pH, C-organik, N, P, K, dan kandungan kation dapat-tukar (basa-basa) di Balai Penelitian Tanah, Bogor. Hasil analisis tanah disajikan pada Lampiran 1.
Berdasarkan hasil analisis tanah dan kriteria Balai Penelitian Tanah (2005) tanah yang digunakan bertekstur lempung liat berdebu, pH masam (pH H2O 4,5), kandungan C-organik dan nitrogen tergolong rendah (C = 1,69% dan N = 0,13%), kandungan P tersedia sangat rendah (P2O5 Bray 1 = 2,7 ppm), kandungan K terekstrak HCl 25% tergolong rendah (K2O HCl 25% = 11 mg/100 g tanah), kapasitas tukar kation (KTK) dan kejenuhan basa (KB) tergolong rendah (KTK = 13,67 cmol(+)/kg dan KB = 40%). Berdasarkan sifat tanah dan kriteria yang diuraikan di atas, maka tanah yang digunakan tergolong memiliki kesuburan rendah .
Percobaan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL), masing-masing perlakuan diulang 5 kali. Sebagai perlakuan adalah kedelai yang diinokulasi dengan masing-masing 8 isolat Pseudomonas terpilih dan kedelai tanpa inokulasi sebagai kontrol. Penempatan pot di rumah kaca disajikan pada Gambar 6.
Biji kedelai steril diinokulasi dengan masing-masing isolat dan kemudian dikecambahkan selama 2 hari seperti prosedur yang sudah diuraikan di atas. Dua kecambah kedelai dari masing-masing perlakuan ditanam pada masing-masing pot. Untuk menghindari kontaminasi dari udara, permukaan tanah dilapisi pasir steril
21
setebal 1 cm. Kadar air tanah pada pot diatur dengan penyiraman harian untuk mendapatkan potensial air tanah (soil water potential) yang setara dengan -0,03 MPa. Penjarangan dilakukan setelah tanaman muncul ke permukaan dan hanya satu tanaman yang dipelihara per pot. Tanaman ditumbuhkan selama 14 hari.
1 Crb17 K Crb24 Crb56 Crb12 Crb46 Crb47 Crb5 Crb49
2 Crb12 Crb17 Crb47 K Crb56 Crb24 Crb46 Crb49 Crb5
3 Crb56 Crb24 Crb17 K Crb49 Crb47 Crb46 Crb12 Crb5
4 Crb56 Crb46 K Crb5 Crb24 Crb47 Crb17 Crb49 Crb12
5 Crb47 Crb24 Crb49 Crb56 K Crb12 Crb5 Crb17 Crb46
Gambar 6. Skema penempatan pot secara acak dalam uji pemacu tumbuh pada media tanah steril dan tanah non-steril di rumah kaca (K = kontrol tanpa inokulasi; Crb17 adalah kedelai yang diinokulasi dengan isolat
Pseudomonas Crb17; angka 1 sampai 5 adalah nomor ulangan).
Parameter pemacu tumbuh yang diukur meliputi tinggi tanaman dan bobot basah tajuk dan akar. Perbedaan hasil antar perlakuan dianalisis dengan analisis sidik ragam yang dilanjutkan dengan uji beda nyata bertingkat DMRT (Duncan multiple range test) antar perlakuan menggunakan perangkat lunak SAS system for Windows v6.12.
Uji Penekanan Penyakit
Pengujian dilakukan terhadap tiga cendawan patogen, F. oxysporum, S. rolfsii, dan R. solani. Sebelum digunakan untuk pengujian isolat, kemampuan cendawan patogen dalam menghambat perkembangan akar dan pertumbuhan kedelai diverifikasi dengan mengujinya menggunakan media agar semi-padat seperti tampak pada Gambar 7. Hasil pengujian menunjukkan bahwa ketiga cendawan patogen tersebut menghambat pertumbuhan kedelai.
22
Gambar 7. Hambatan pertumbuhan tanaman kedelai pada media agar semi-padat yang diinfestasi dengan cendawan patogen F. oxysporum, S. rolfsii, dan R. solani.
Pengujian penekanan penyakit dilakukan pada media tanah steril dan non- steril di rumah kaca mengikuti prosedur Wang et al. (2000) dan Cattelan et al. (1999). Pengujian pada media tanah steril menggunakan campuran 400 g tanah dan 100 g pasir kuarsa yang disterilisasi 2 kali dengan autoklaf, masing-masing selama 1 jam dengan interval waktu 2 hari. Sterilisasi pot plastik polietilen dilakukan dengan cara sterilisasi permukaan plastik dengan alkohol 95%.
Masing-masing cendawan patogen disiapkan dengan menumbuhkan satu potong cendawan patogen pada media padat potato dextrose agar (PDA) pada cawan Petri. Setelah 4 hari, beberapa potongan agar yang ditumbuhi patogen diperbanyak dengan menumbuhkannya dalam 500 ml media cair potato dextrose broth (PDB) selama 4 hari pada mesin pengocok dengan kecepatan 125 rpm. Cendawan diperbanyak dengan cara menginokulasikan 500 ml biakan patogen ke media PDB dalam galon berisi 3 sampai 5 L media PDB. Setelah diinkubasi selama 4 hari pada mesin pengocok, cendawan patogen dipisahkan dengan alat blender secara aseptik dan selanjutnya disuspensikan dalam akuades steril. Tanah pada pot diinfestasi dengan suspensi patogen, masing-masing dengan kepadatan 8,11 x 104 propagul F. oxysporum; 1,2 x 103 propagul S. rolfsii; dan 1,0 x 103
23
propagul R. solani per gram tanah. Kepadatan populasi biakan cendawan yang digunakan dihitung berdasarkan kurva standar yang ditetapkan dengan teknik pengenceran bertingkat dan pencawanan. Tingkat kepadatan populasi cendawan patogen per gram tanah mengikuti tingkat kepadatan cendawan yang digunakan Cattelan et al. (1999), yaitu minimal 103 propagul per gram tanah.
Pada pengujian dengan tanah steril, tanah diinokulasi dengan isolat
Pseudomonas. Inokulasi ini dilakukan satu hari setelah infestasi cendawan patogen ke tanah. Isolat Pseudomonas diperbanyak dalam media kaya M26 seperti prosedur yang diuraikan di atas. Kepadatan isolat Pseudomonas yang diinokulasikan ke tanah adalah sebanyak 107 cfu per g tanah mengikuti prosedur Wang et al. (2000). Kecambah kedelai dari hasil inokulasi biji (seperti diuraikan di atas) ditanam pada pot sesuai masing-masing perlakuan, masing-masing 4 tanaman tiap pot.
Penempatan pot percobaan mengikuti rancangan acak kelompok (RAK). Jumlah perlakuan adalah 10 perlakuan, yaitu 8 perlakuan adalah kedelai yang diinokulasi dengan isolat Pseudomonas terpilih, 1 perlakuan dimana kedelai tidak diinokulasi dengan isolat tetapi tanah pada pot diinfestasi dengan cendawan patogen (kontrol positif), dan 1 perlakuan kedelai tidak diinokulasi dengan isolat serta tanah juga tidak diinfestasi dengan cendawan patogen (kontrol negatif). Tiap perlakuan diulang 3 kali (3 kelompok), tiap ulangan terdiri atas 4 pot, dan tiap pot terdiri atas 4 tanaman (Gambar 8). Kadar air tanah pada pot diatur dengan penyiraman harian untuk mendapatkan potensial air tanah (soil water potential) yang setara dengan -0,01 MPa (tanah lebih lembab).
Prosedur pengujian pada tanah non-steril hampir sama dengan prosedur pengujian pada tanah steril seperti diuraikan di atas. Tanah yang digunakan adalah 2 kg per pot. Tanah hanya diinfestasi dengan cendawan patogen mengikuti prosedur Cattelan et al. (1999), sedangkan inokulasi dengan suspensi sel isolat
Pseudomonas seperti pada percobaan dengan tanah steril di atas tidak dilakukan. Kecambah kedelai dari hasil inokulasi biji dengan masing-masing isolat ditanam pada pot, masing-masing 1 tanaman per pot. Pengujian menggunakan rancangan acak lengkap (RAL). Jumlah perlakuan adalah 10 perlakuan seperti diuraikan di atas. Tiap perlakuan diulang 4 kali (Gambar 8).
24 Tanah Steril 0FS-1 FS46-1 FS24-1 SS17-1 SS56-1 0SS-1 RS5-1 1RS-1 RS47-1 FS17-1 FS12-1 FS5-1 SS46-1 SS12-1 SS49-1 RS49-1 0RS-1 RS12-1 FS47-1 FS56-1 FS49-1 SS24-1 SS47-1 SS5-1 RS24-1 RS56-1 RS46-1 1FS-1 1SS-1 RS17-1 FS5-2 FS47-2 FS17-2 SS49-2 1SS-2 SS56-2 1RS-2 0RS-2 RS24-2 FS24-2 FS56-2 1FS-2 SS5-2 SS17-2 SS46-2 RS17-2 RS49-2 RS47-2 FS46-2 FS49-2 0FS-2 SS12-2 0SS-2 SS47-2 RS12-2 RS56-2 RS46-2 FS12-2 SS24-2 RS5-2 FS49-3 0FS-3 FS46-3 SS49-3 SS17-3 SS56-3 0RS-3 RS56-3 1RS-3 FS5-3 FS17-3 FS12-3 SS47-3 SS5-3 SS46-3 RS17-3 RS47-3 RS24-3 FS56-3 FS47-3 1FS-3 1SS-3 SS12-3 0SS-3 RS46-3 RS12-3 RS49-3 FS24-3 SS24-3 RS5-3
(1) Fusarium oxysporum (2) Sclerotium rolfsii (3) Rhizoctonia solani
Tanah Non-Steril FN56-3 FN56-2 0FN-3 FN17-3 SN46-3 SN24-4 SN47-3 1SN-1 RN47-2 RN46-1 RN47-3 RN12-1 FN17-4 FN12-4 FN17-2 FN24-1 SN24-2 SN49-2 SN56-1 SN17-3 RN49-1 RN5-3 RN56-2 RN56-3 1FN-4 FN47-2 FN49-4 FN49-1 1SN-4 SN12-2 SN5-1 0SN-4 RN12-2 RN47-1 0RN-3 RN12-4 FN12-1 FN24-2 FN47-3 FN56-1 SN49-4 SN49-1 SN12-3 SN46-1 RN24-4 RN17-4 RN24-3 RN17-2 1FN-3 FN12-3 FN17-1 FN5-2 SN17-1 SN17-4 SN49-3 SN24-3 RN46-2 RN24-1 RN12-3 RN56-1 FN46-1 0FN-2 FN12-2 FN56-4 SN12-4 SN47-1 SN47-2 SN47-4 RN49-4 RN24-2 0RN-4 RN17-3 FN5-1 FN47-4 1FN-2 FN24-3 0SN-1 SN5-4 SN24-1 SN5-2 0RN-1 1RN-3 0RN-2 RN46-4 FN46-3 FN5-4 FN24-4 FN49-2 SN56-3 SN46-4 SN5-3 SN56-4 RN49-3 RN17-1 RN49-2 RN5-4 FN5-3 FN46-2 0FN-1 FN47-1 SN56-2 SN12-1 0SN-3 SN46-2 RN46-3 1RN-4 RN56-4 RN47-4 1FN-1 FN49-3 FN46-4 0FN-4 SN17-2 1SN-3 1SN-2 0SN-2 1RN-2 RN5-1 1RN-1 RN5-2
(1) Fusarium oxysporum (2) Sclerotium rolfsii (3) Rhizoctonia solani
Gambar 8. Skema penempatan pot pada pengujian ketahanan tanaman kedelai yang inokulasi dengan Pseudomonas penghasil ACC deaminase terhadap cendawan patogen pada tanah steril (atas) dan non-steril (bawah) di rumah kaca. (FS46-1 = tanah steril yang diinfestasi dengan
Fusarium oxysporum dan Pseudomonas Crb46 pada ulangan 1; FN56- 3 = inokulasi tanah steril dengan Fusarium oxysporum dan
25
Tanaman ditumbuhkan selama 14 hari. Parameter yang diukur meliputi jumlah tanaman yang hidup (% hidup) dan bobot basah tajuk dan akar. Perbedaan hasil dari masing-masing perlakuan dianalisis dengan analisis sidik ragam (ANOVA) yang dilanjutkan dengan uji beda nyata bertingkat DMRT antar perlakuan dengan perangkat lunak SAS system for Windows v6.12.