Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli 2010 sampai dengan Mei 2011. Koleksi sampel dilakukan pada beberapa lokasi di Jawa Tengah, Daerah Istimewa Yogyakarta (DIY), Jawa Timur, dan Bali. Analisis DNA dan analisis data dilakukan di Bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, FMIPA, Institut Pertanian Bogor.
Objek Penelitian
Objek penelitian yang digunakan yaitu penggerek batang padi kuning S. incertulas yang dikoleksi dari beberapa lokasi pengambilan sampel. Fase perkembangan S. incertulas yang digunakan untuk analisis DNA yaitu fase dewasa. Sampel S. incertulas dikoleksi dengan menggunakan jaring serangga dan secara manual dengan menggunakan bantuan tabung reaksi. Sampel S. incertulas
yang diperoleh disimpan di dalam tabung 1.5 ml yang berisi etanol absolut.
Tahapan Analisis DNA S. incertulas
Ekstraksi DNA
Sebelum ekstraksi DNA, sampel S. incertulas yang disimpan di dalam etanol absolut dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml yang berisi 500 µl Tris HCl- EDTA (TE) 0.5 mM (Tris HCl 2 M; EDTA 0.2 M; air destilata) untuk menggantikan etanol absolut dari jaringan sampel. Metode ekstraksi DNA yang digunakan adalah metode Cetyl Trimetil Ammonium Bromide (CTAB) dan presipitasi alkohol (Sambrook et al. 1989) dengan modifikasi berdasarkan Raffiudin dan Crozier (2007). Sumber DNA yang diekstraksi yaitu jaringan bagian toraks S. incertulas. Bagian toraks S. incertulas dengan bagian tubuh lain (kepala, abdomen, dan tungkai) dipisahkan menggunakan scalpel steril. Kemudian, toraks dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml dan tabung direndam di dalam kotak berisi nitrogen cair (15 menit). Nitrogen cair berfungsi untuk membekukan jaringan, sehingga mempermudah proses penghancuran toraks.
Toraks di dalam tabung digerus menggunakan grinder steril. Selanjutnya, toraks di dalam tabung ditambahkan 300 µl larutan CTAB 0.2 % (b/v) (7.5 ml 1M Tris- HCl pH 8; 3 ml 0.5 M NaEDTA pH 8; 6.135 g NaCl; 1.5 g CTAB; air hingga 75 ml). Proses berikutnya, supernatan ditambahkan 10 µl Proteinase K (5mg/ml). Fungsi Proteinase K yaitu untuk menghancurkan protein. Kemudian, sampel diinkubasi pada suhu 55 oC (2 jam). Setelah inkubasi, campuran disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (10 menit). Supernatan yang berisi DNA dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml baru.
Supernatan yang berisi DNA ditambahkan 300 µl larutan Phenol Chloroform Isoamyl alcohol (PCI) di dalam ruang asam, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (5 menit). Larutan PCI dibagian bawah tabung dibuang, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit). Supernatan yang berisi DNA dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml baru. Selanjutnya, supernatan tersebut ditambahkan kembali 240 µl larutan PCI, putar perlahan lalu disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (3 menit). Larutan PCI dibagian bawah tabung dibuang dan disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit), lalu supernatan yang berisi DNA dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml baru dan disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit) untuk memastikan tidak ada lagi fenol. Tahap berikutnya, supernatan yang berisi DNA ditambahkan 240 µl larutan Chloroform Isoamyl Alcohol (CIAA), lalu disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (3 menit). Kemudian, larutan CIAA di bagian bawah tabung dibuang, sentrifugasi kembali dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit). Supernatan yang berisi DNA di bagian atas tabung dipindahkan ke tabung 1.5 ml baru dan ditambahkan 360 µl isopropanol murni untuk proses presipitasi DNA.
Proses presipitasi DNA dilakukan pada suhu -4 oC (overnight). Selanjutnya, supernatan disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (30 menit) pada suhu 4 oC, lalu isopropanol dibuang. Endapan DNA ditambahkan 300 µl alkohol 70% (v/v) steril, sentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (10 menit). Kemudian, etanol 70% steril dibuang dan endapan DNA dikeringkan dengan cara divakum (30 menit). Endapan DNA yang diperoleh dilarutkan dalam TE 0.5 mM, lalu disimpan pada suhu -4 0C.
Amplifikasi DNA
Amplifikasi DNA hasil ekstraksi dilakukan untuk dua individu S. incertulas dari tiap lokasi pengambilan sampel. Proses amplifikasi menggunakan mesin PCR (ESCO). Amplifikasi fragmen gen COI S. incertulas menggunakan primer forward Mt D4 dan reverse Mt D9 (Simon et al. 1994). Sedangkan amplifikasi fragmen gen COII S. incertulas menggunakan primer forward A-298 dan reverse Bt-LYS (Liu & Beckenbach 1992; Simon et al. 1994) (Tabel 1, Gambar 4). 100 pb A-298 Bt-LYS Mt D4 Mt D9 tRNA-Leu tRNA-Tyr tRNA-Lys 1442 2977 Gen COI 3040 3721 Gen COII
Gambar 4 Posisi primer forward Mt D4 dan primer reverse Mt D9 untuk amplifikasi gen COI S. incertulas serta primer forward A-298 dan primer reverse Bt-LYS untuk amplifikasi gen COII S. incertulas. Tabel 1 Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen COI dan gen COII S.
incertulas dan posisi primer berdasarkan mtDNA O. furnacalis
Primer Sekuen 5’-3’ Posisi primer pada mtDNA O. furnacalis (No. Akses GenBank: NC003368) Gen COI Mt D4 TACAATTTATCGCCTAAACTTCAGCC 1339-1365 Mt D9 CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC 2131-2157 (Simon et al. 1994) Gen COII A-298 ATTGGACATCAATGATATTGA 3337 - 3357 Bt-LYS GTTTAAGAGACCAGTACTTG 3739 - 3758
Total volume pereaksi PCR yang digunakan adalah 20 µl. Pereaksi tersebut terdiri atas 7.4 µl air destilata steril, 0.8 µl primer forward 10 µM, 0.8 µl primer reverse 10 µM, 1 µl DNA cetakan, dan 10 µl 2x Ready Mix (Kapa Taq DNA Polymerase (1 U per 20 µl), bufer Mg2+ 1.5 mM, dan dNTP 0.4 mM). Amplifikasi DNA pada mesin PCR terdiri atas pra-denaturation pada suhu 95 oC (2 menit), denaturation pada suhu 95 oC (1.5 menit), annealing pada suhu 50 oC (1-1.5 menit), elongation pada suhu 72 oC (1 menit), dan elongation akhir pada suhu 72 oC (2 menit). Tahap denaturation, annealing, dan elongation masing- masing 30 siklus.
Elektroforesis dan visualisasi DNA
Hasil amplifikasi DNA S. incertulas dimigrasikan sebanyak 1 µl pada
polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 6% dengan menggunakan buffer 1x TBE (Tris 0.5 M, Asam Borat 0.65 M, EDTA 0.02 M). Visualisasi DNA menggunakan pewarnaan perak nitrat (Byun et al. 2009).
Sekuen DNA
Sekuen DNA S. incertulas dilakukan pada gen COI dan gen COII mtDNA menggunakan primer yang sama dengan primer yang digunakan pada amplifikasi DNA. Proses sekuen DNA dilakukan untuk dua individu S. incertulas dengan menggunakan jasa pelayanan sekuen. Selanjutnya, hasil sekuen DNA berupa kromatogram di-edit secara manual.
Analisis Data DNA S. incertulas
Database hasil perunutan DNA gen COI dan gen COII S. incertulas
disimpan pada program Genetyx Win versi 4.0. Selanjutnya, database sekuen DNA tersebut diedit secara manual dengan menggunakan program Genetyx Win
Analisis Homologi DNA S. incertulas
Gen COI
Analisis homologi dilakukan pada sekuen gen COI S. incertulas penelitian ini dengan data GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Analisis homologi tersebut menggunakan program Basic Local Alignment Seacrh Tool-Nucleotide (BLAST- N) dari website National Center for Biotechnology Information (NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Sekuen nukleotida gen COI S. incertulas pada penelitian ini di-alignment
dengan data sekuen nukleotida gen COI ngengat anggota Crambidae yang diperoleh dari GenBank. Data sekuen nukleotida untuk gen COI S. incertulas
yang sudah ada diperoleh dari GenBank (Tabel 2). Analisis homologi sekuen nukleotida gen COI menggunakan program Clustal X (Thompson 1997) dan program MEGA 5 (http://www.megasoftware.net/mega.php).
Gen COII
Sekuen gen COII S. incertulas penelitian ini dilakukan analisis homologi menggunakan program BLAST-N dari situs NCBI. Selanjutnya, sekuen gen COII
S. incertulas pada penelitian ini di-alignment terhadap data sekuen gen COII hasil penelitian Raffiudin dan Samudra (2010) (Tabel 3). Analisis alignment
mengunakan program Clustal X (Thompson 1997) dan program MEGA 5.
Tabel 2 Database haplotipe gen COI S. incertulas yang ada di GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov)
No Sampel Haplotipe Lokasi No. Akses
Sampel GenBank
1 Lep.12062007 Lep.12062007.H1 Dieng, Wanasaba, Jateng AB495265 2 Lep.20032007 Lep.20032007.H1 Pakembinangun, Sleman, DIY AB495267
3 Lep.16042007 Lep.16042007.H1 Magetan, Jatim AB495268
4 Lep.23032006 Lep.23032006.H1 Karangmangu, Baturaden, Jateng AB495272
5 Lep.10062005 Lep.10062005.H1 Garut, Jabar AB495273
6 Lep.10042007 Lep.10042007.H2 Baluran National Park, Jatim AB495269 7 Lep.13042007 Lep.13042007.H3 Alas Purwo National Park, Jatim AB495270
8 Lep.20052006 Lep.20052006.H4 Ciamis, Jabar AB495271
9 Lep.10022006 Lep.10022006.H5 Wates, Kulon Progo, DIY AB495266 10 Lep.28052006 Lep.28052006.H6 Halimun-Salak National Park, Jabar AB495274 Keterangan:
H = Haplotipe; Jabar = Jawa Barat; Jateng = Jawa Tengah; DIY = Daerah Istimewa Yogyakarta; Jatim = Jawa Timur
Analisis Homologi Asam Amino PutataiveS. incertulas
Sekuen nukleotida gen COI dan gen COII S. incertulas penelitian ini masing-masing ditranslasi ke dalam asam amino dengan mengunakan program
Genetyx Win versi 4.0. Tahap berikutnya, sekuen asam amino putative gen COI dan gen COII S. incertulas penelitian ini dilakukan analisis homologi dengan data GenBank. Analisis homologi tersebut menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool-Protein (BLAST-P) dari situs NCBI. Selanjutnya, sekuen asam amino putative di-alignment terhadap individu S. incertulas untuk masing- masing gen COI dengan gen COII.
Analisis Jarak Genetik
Analisis jarak genetik dilakukan antara gen COI S. incertulas dan S. innotata (Si; No. Akses GenBank: AB495264). Sedangkan, analisis jarak genetik gen COII S. incertulas dilakukan antara S. excerptalis asal Papua Nugini dan India (Se.PNG dan Se.India; berturut-turut No. Akses GenBank: AY320508 dan AY320507). Proses analisis jarak gen COI dan COII S. incertulas menggunakan program MEGA 5.
Tabel 3 Database haplotipe gen COII S. incertulas berdasarkan penelitian Raffiudin dan Samudra (2010)
No Sampel Haplotipe Lokasi Titik Koordinat
Sampel
1 Sc7Bg Sc7Bg.H1 Bogor, Jabar L: -6,872
2 Sc9Bg Sc9Bg H1 Bogor, Jabar A: 109,359
3 Sc22Kr Sc22Kr.H1 Karawang, Jabar L: -6,256 A: 107,322
4 Sc8Id Sc8Id.H1 Indramayu, , Jabar L: -
5 Sc10Id Sc10Id.H1 Indramayu, Jabar A: -
6 Sc11Bg Sc11Bg.H2 Bogor, Jabar L: -6,872
A: 109,359
7 Sc24Kr Sc24Kr.H3 Karawang, Jabar L: -
8 Sc1Cb Sc1Cb.H4 Cirebon, Jabar A: -
Keterangan:
H = Haplotipe; Bg = Bogor; Kr = Karawang; Id = Indramayu; Cb = Cirebon L= Latitude, A= Altitude; = tidak ada data latitude dan altitude
Analisis Filogeni
Konstruksi pohon filogeni dilakukan antar gen COI S. incertulas (ingroup) dan spesies ngengat lain kelompok Crambidae (outgroup) yaitu S. innotata, C. suppressalis, dan O. furnacalis (Tabel 4). Pada gen COII, konstruksi pohon filogeni dilakukan antar S. incertulas (ingroup) spesies ngengat lain kelompok Crambidae (outgroup) yaitu S. excerptalis, C. suppressalis, dan O. furnacalis
(Tabel 5). Proses analisis filogeni tersebut menggunakan metode Neighbor Joining (NJ) dengan bootstrap 1000x pada program MEGA 5.
Tabel 4 Database gen COI Crambidae (outgroup) yang diperoleh dari GenBank untuk analisis filogeni pada penelitian ini
No Spesies Lokasi No. Akses GenBank Sampel
1 S. innotata Indonesia AB495264 Si.AB495264
2 C. suppressalis Cina EU362114 Cs.H1.EU362114
Cina EU362115 Cs.H2.EU362115
3 O. furnacalis Cina NC003368 Of.NC003368
Tabel 5 Database gen COII Crambidae (outgroup) yang diperoleh dari GenBank untuk analisis filogeni pada penelitian ini
No Spesies Lokasi No. Akses GenBank Sampel
1 S. excerptalis India AY320507 Se.India.AY320507
Papua Nugini AY320508 Se.PNG.AY320508
2 C. suppressalis Cina EU362116 Cs.H1.EU362116 Cina EU362117 Cs.H2.EU362117 3 O. furnacalis Cina NC003368 Of.NC003368
HASIL
Koleksi Penggerek Batang Padi Kuning S. incertulas
Koleksi S. incertulas dilakukan di daerah tanaman padi yang mengalami gejala kerusakan yang berbeda. Pada gejala sundep, koleksi sampel dilakukan pada S. incertulas dewasa yang menunjukkan perilaku hinggap di ujung daun pada fase vegetatif tanaman padi. Koleksi S. incertulas juga dilakukan di areal tanaman padi yang menunjukkan gejala beluk pada fase generatif. Pada areal tersebut, S. incertulas dewasa menunjukkan perilaku terbang di sekitar areal tanaman padi (Gambar 5).
Total S. incertulas dewasa yang berhasil dikoleksi yaitu 164 individu. Koleksi S. incertulas di Provinsi Jawa Tengah dan Daerah Istimewa Yogyakarta (DIY) diperoleh dari empat kabupaten yaitu Kebumen, Sleman, Klaten, dan Pemalang. Pengambilan sampel S. incertulas di Provinsi Jawa Timur dikoleksi dari enam kabupaten yaitu Mojokerto, Probolinggo, Situbundo, Jember, dan Lumajang. Selain itu, sampel S. incertulas juga diperoleh dari Kabupaten Tabanan, Bali (Tabel 6, Gambar 6).
B)
Gambar 5 Gejala kerusakan padi akibat serangan S. incertulas. A) Sundep; B) Beluk.
Tabel 6 Data lokasi koleksi S. incertulas yang dilakukan pada penelitian ini
No Lokasi Kode Jumlah Titik Kolektor
Jawa Tengah; DIY Sampel Sampel Koordinat
1 Kec. Kebumen, Sc-KBM 22 L: -7,670 RIR, RMW,
Kab. Kebumen A: 109,660 JAF
2 Kec. Berbah, Sc-SLM 3 L:-7,794 RMW, DZU
Kab. Sleman A: 110,455
3 Kec. Klaten Selatan, Sc-KLT 4 L: -7,717 RIR, RMW,
Kab. Klaten A: 110,583 JAF
4 Kec. Pemalang, Sc-PML 28 L: -6,872 RIR, RMW,
Kab. Pemalang A: 109,359 JAF
Jawa Timur
5 Kec. Mojosari, Sc-MJK 6 L: -7,471 IMS
Kab. Mojokerto A: 115,433
6 Kec. Gending, Sc-PBL 18 L: -7,827 RIR, RMW,
Kab. Probolinggo A: 113,437 CAN
7 Kec. Suboh, Sc-STB 3 L: -9,033 RIR, RMW,
Kab. Situbondo A: 164,616 CAN
8 Kec. Patrang, Sc-JMB 3 L: -8,183 RIR, RMW,
Kab. Jember A: 113,782 CAN
9 Kec. Mayang, Sc-JMB 1 L: -8,232 RIR, RMW,
Kab. Jember A: 113,848 CAN
10 Kec. Rowo Kangkung, Sc-LMJ 15 L: -8,1856 RIR, RMW,
Kab. Lumajang A: 113,347 CAN
Bali
11 Kec. Negara, Sc-JBR 0 L: -8,314 RMW
Kab. Jembrana A: 114,601
12 Kec. Kerambitan, Sc-TBN 61 L: -8,550 IMS
Kab. Tabanan A: 115,077
Total Sampel 164
Keterangan:
Kec. = Kecamatan, Kab. = Kabupaten;
Sc = S. incertulas; - = nomor urutan sampel S. incertulas;
KBM = Kebumen, SLM = Sleman, KLT= Klaten, PML = Pemalang, MJK = Mojokerto, PBL = Probolinggo, STB = Situbondo, JMB = Jember, LMJ = Lumajang, JBR = Jembrana, TBN = Tabanan;
L = Latitude, A = Altitude;
RIR= Rika Raffiudin, IMS= I Made Samudra, RMW= Ruth Martha Winnie, JAF= Jazirotul Fitriyati, DZU= Dzulfaqor, CAN= Cahyo Nugroho.
Gen COI S. incertulas
Amplifikasi DNA gen COI S. incertulas
Amplikon gen COI S. incertulas menggunakan primer forward Mt D4 dan
reverse Mt D9 menunjukkan ukuran pita DNA ± 900 pasang basa (pb). Panjang basa DNA S. incertulas tersebut sama pada tiap individu dari lokasi koleksi sampel. Sampel S. incertulas asal Sleman diwakili oleh yaitu Sc1SLM dan Sc2 SLM, lokasi Mojokerto diwakili oleh Sc1MJK dan Sc2MJK, lokasi Probolinggo diwakili oleh Sc1PBL dan Sc2PBL, lokasi Tabanan diwakili oleh Sc1TBN dan Sc2TBN, lokasi Kebumen diwakili oleh Sc2KBM, lokasi Klaten diwakili oleh Sc1KLT dan Sc2KLT, lokasi Pemalang diwakili oleh Sc1PML dan Sc2 PML, lokasi Jember diwakili oleh Sc1JMB dan Sc2JMB, serta lokasi Lumajang diwakili oleh Sc1LMJ dan Sc2LMJ (Gambar 7 & 8).
Gambar 6 Peta lokasi koleksi S. incertulas di Jawa Tengah, Daerah Istimewa Yogyakarta (DIY), Jawa Timur, dan Bali. Nomor merujuk pada Tabel 6. 1 4 10 6 9 8 7 11 12 5 3 2
Pulau Jawa dan Bali
Sekuen DNA gen COI S. incertulas
Sekuen DNA gen COI S. incertulas dilakukan pada dua individu yang mewakili tiap lokasi. Hasil sekuen gen COI diperoleh berupa kromatogram (Lampiran 1 & 2). Sekuen gen COI yang telah di-edit ditemukan sekuen nukleotida primer forward Mt D4 dan reverse Mt D9 (Gambar 9). Hasil sekuen DNA gen COI S. incertulas pada tiap lokasi menghasilkan panjang nukleotida yaitu ± 770 pb.
Gambar 7 Amplikon gen COI S. incertulas. A = 1: Sc1SLM, 2: Sc1MJK, 3: Sc1PBL, 4: Sc1TBN; B = 1: Sc1KLT, 2: Sc1PML, 3:Sc1JMB, 4: Sc2LMJ. M = Penanda DNA 100 pb (Promega). Kode sampel merujuk pada Tabel 6.
A
M 1 2 3 4
B
M 1 2 3 4
Gambar 8 Amplikon gen COI S. incertulas. A = 1: Sc2SLM, 2: Sc2MJK, 3: Sc2PBL, 4: Sc2TBN; B = 1: Sc2KBM, 2: Sc2KLT, 3: Sc2PML, 4:Sc2JM, 5: Sc2LMJ. M = Penanda DNA 100 pb (Promega). Kode sampel merujuk pada Tabel 6.
900 pb M 1 2 3 4 A 4 5 1 2 3 M 900 pb B
10 20 30 40 50 60 TTACAATTTATCGCCTAAACTTCAGCCATTTTATCATGCGAAAATGAATATACTCTACAA Y S T N 70 80 90 100 110 120 ATCATAAGGATATTGGTACTTTATATTTTATTTTTGGAATTTGAGCTGGTATAGTAGGAA H K D I G T L Y F I F G I W A G M V G T 130 140 150 160 170 180 CTTCTTTAAGCTTACTTATTCGAGCTGAATTAGGAACTTCTGGATCCTTAATTGGAGATG S L S L L I R A E L G T S G S L I G D D 190 200 210 220 230 240 ATCAAATCTATAACACTATTGTCACAGCCCATGCCTTTATTATAATTTTTTTTATAGTTA Q I Y N T I V T A H A F I M I F F M V M 250 260 270 280 290 300 TACCCATTATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATTAGTCCCCCTAATATTAGGAGCCCCAG P I M I G G F G N W L V P L M L G A P D 310 320 330 340 350 360 ATATAGCTTTCCCCCGAATAAATAACATAAGATTCTGATTATTACCCCCCTCTTTAACAC M A F P R M N N M S F W L L P P S L T L 370 380 390 400 410 420 TCCTCATTTCTAGAAGAATTGTAGAAAATGGGGCTGGAACAGGATGAACTGTTTACCCAC L I S S S I V E N G A G T G W T V Y P P 430 440 450 460 470 480 CCCTATCATCCAATATTGCTCATGGGGGAACATCAGTAGATTTAGCTATTTTTTCTCTAC L S S N I A H G G T S V D L A I F S L H 490 500 510 520 530 540 ACCTAGCAGGAATTTCATCTATTTTAGGAGCTATTAATTTTATTACAACCATTATTAATA L A G I S S I L G A I N F I T T I I N M 550 560 570 580 590 600 TACGAATTAATGGATTATCATTTGACCAAATACCTCTATTTGTGTGAGCTGTTGGTATTA R I N G L S F D Q M P L F V W A V G I T 610 620 630 640 650 660 CAGCCCTTCTTTTACTTCTCTCTCTCCCAGTTTTAGCTGGAGCTATTACCATATTACTAA A L L L L L S L P V L A G A I T M L L T 670 680 690 700 710 720 CAGATCGAAATTTAAATACATCTTTTTTTGATCCAGCTGGAGGAGGAGATCCAATTTTAT D R N L N T S F F D P A G G G D P I L Y 730 740 750 760 770 780 ATCAACACTTATTTTGATTTTTTGGGCATCCAGAAGTTTATATTTTAATTTTACC Q H L F W F F G H P E V Y I L I L
Gambar 9 Sekuen gen COI S. incertulas asal Tabanan (Sc1TBN) dan deduksi asam amino. Posisi nukleotida nomor 1-49 = sekuen t-RNA Tyrosin; posisi nukleotida nomor 50-775 = sekuen gen COI. Sekuen DNA yang digaris bawah menunjukkan primer forward Mt D4 (posisi nukleotida nomor 2- 27) dan primer reverse Mt D9 (posisi nukleotida nomor 753-775). Baris ke-1: panjang nukleotida; baris ke-2: sekuen nukleotida S. incertulas; baris ke-3: deduksi asam amino
Analisis homologi DNA gen COI S. incertulas
Berdasarkan alignment DNA gen COI S. incertulas penelitian ini terhadap data haplotipe gen COI S. incertulas yang ada di GenBank (Tabel 2) menunjukkan kesamaan sekuen nukleotida dengan haplotipe S. incertulas yang sudah ada yaitu haplotipe 1 (Lep.12062007.H1) dan haplotipe 5 (Lep.10022006.H5) (Gambar 10, Lampiran 3). S. incertulas yang termasuk haplotipe 1 adalah Sc2TBN.H1, Sc2PBL.H1, Sc2PML.H1, Sc2MJK.H1, dan Sc1JMB.H1. Sedangkan, S. incertulas penelitian ini yang sama dengan sekuen nukleotida S. incertulas
haplotipe 5 yaitu Sc1MJK.H5, Sc1TBN.H5, Sc1PBL.H5, Sc2JMB.H5, Sc1LMJ.H5, Sc2SLM.H5, Sc2KBM.H5, Sc2KLT.H5, dan Sc1KLT.H5. Individu
S. incertulas yang termasuk ke dalam haplotipe 5 merupakan haplotipe umum.
Alignment gen COI S. incertulas tersebut menunjukkan ada tiga haplotipe baru yaitu haplotipe 7 (Sc2LMJ.H7), haplotipe 8 (Sc1SLM.H8), dan haplotipe 9 (Sc1PML.H9) (Tabel 7, Lampiran 3). Pemberian nomor untuk haplotipe baru yang ditemukan melanjutkan nomor haplotipe S. incertulas yang sudah terdaftar pada GenBank (Tabel 7).
Variasi nukleotida pada haplotipe baru yang ditemukan pada penelitian ini disebabkan oleh beberapa subtitusi. Haplotipe 7 (Sc2LMJ.H7) pada S. incertulas
asal Lumajang terjadi subtitusi nukleotida pada posisi ke-482 yaitu C->T dan posisi basa ke-644 (T->C). Haplotipe 8 (Sc1SLM.H8) terjadi subtitusi nukleotida pada posisi basa ke-557 (C->T) dan posisi basa ke-644 (T->C) pada S. incertulas
asal Sleman. Selanjutnya, haplotipe 9 (Sc1PML.H9) terjadi subtitusi nukleotida pada posisi basa ke-677 (A->G) pada S. incertulas asal Pemalang (Tabel 7 & 8).
Berdasarkan analisis homologi DNA gen COI S. incertulas menggunakan program BLAST-N, masing-masing haplotipe baru yang ditemukan pada penelitian ini menunjukkan kesamaan dengan data haplotipe S. incertulas yang sudah ada di GenBank. Nilai kesamaan dan Expectation value (E-value) pada haplotipe 7 (Sc2LMJ.H7), haplotipe 8 (Sc1SLM.H8), dan haplotipe 9 (Sc1PML.H9) adalah 99% (0.0) (Tabel 9).
Tabel 7 Gabungan data haplotipe gen COI S. incertulas di Jawa Barat, Jawa Tengah, Daerah Istimewa Yogyakarta, Jawa Timur, dan Bali
No Sampel Haplotipe Posisi Perubahan
Sampel subtitusi nukleotida
1 Lep.12062007 Lep.12062007.H1 644 T->C
2 Lep.10042007 Lep.10042007.H2 51, 557, 644 A->G, C->T, T->C
3 Lep.13042007 Lep.13042007.H3 536 G->A
4 Lep.20052006 Lep.20052006.H4 117, 644 T->G, T->C
5 Lep.10022006 Lep.10022006.H5 - -
6 Lep.28052006 Lep.28052006.H6 29, 644 T->A, T->C
7 Sc2LMJ Sc2LMJ.H7* 482, 644 C->T, T->C
8 Sc1SLM Sc1SLM.H8* 557, 644 C->T, T->C
9 Sc1PML Sc1PML.H9* 677 A->G
Keterangan:
Sampel 1-6 merujuk Tabel 2. Sampel 7-9 merujuk Tabel 6. - = tidak ada perubahan nukleotida
* = haplotipe baru pada gen COI S. incertulas yang ditemukan pada penelitian ini.
2 5 8 2 4 6 7 1 9 3 100 200 300 400 500 600 680 Sc2LMJ.H7 Sc2TBN.H1 Sc2PBL.H1 Sc2PML.H1 Lep.20052006.H4 Lep.12062007.H1 Lep.28052006.H6 Lep.10022006.H5 Lep.13042007.H3 Sc1KLT.H5 Sc1PML.H9 Sc2MJK.H1 Sc1JMB.H1 Sc1LMJ.H5 Sc2SLM.H5 Sc2KBM.H5 Sc2KLT.H5 Nuk (pb) Lep.10042007.H2 Sc1MJK.H5 Sc1TBN.H5 Sc1PBL.H5 Sc2JMK.H5 Sc1SLM.H8
Gambar 10 Skema alignment sekuen DNA gen COI S. incertulas antara data hasil penelitian ini dengan data GeneBank. Alignment sekuen DNA dimulai dari posisi basa ke-50 berdasarkan Gambar 9. Nuk = nukleotida; pb = pasang basa; Skala 100-680 = posisi nukelotida; = variasi basa pada posisi nukleotida; = haplotipe baru pada sekuen gen COI yang ditemukan pada penelitian ini. Sampel di sebalah kiri garis skematik alignment merujuk pada Tabel 2 dan Tabel 6. Angka dalam kotak menunjukkan nomor haplotipe.
Tabel 8 Posisi nukleotida gen COI S. incertulas penelitian ini dengan database
sekuen nukleotida berdasarkan GenBank yang menunjukkan variasi haplotipe
Gen COI Nukleotida ke-
Sampel 29 51 117 482 536 557 644 677 Sc1MJK.H5 T A T C G C T A Sc1TBN.H5 . . . . . . . . Sc1PBL.H5 . . . . Sc2JMB.H5 . . . . Sc1SLM.H8 . . . . . T C . Lep.10042007.H2 . G . . . T C . Sc2LMJ.H7 . . . T . . C . Sc2TBN.H1 . . . . . . C . Sc2PBL.H1 . . . . C . Sc2PML.H1 . . . . C . Lep.20052006.H4 . . G . . . C . Lep.12062007.H1 . . . . C . Lep.28052006.H6 A . . . C . Sc2MJK.H1 . . . . C . Sc1JMB.H1 . . . . C . Sc1LMJ.H5 . . . . Sc2SLM.H5 . . . . Sc2KBM.H5 . . . . Sc2KLT.H5 . . . . Sc1KLT.H5 . . . . Sc1PML.H9 . . . . G Lep.10022006.H5 . . . . Lep.13042007.H3 . . . . A . . . Keterangan:
Sampel 1-6 merujuk Tabel 2; sampel 7-9 merujuk Tabel 6. = haplotipe baru yang ditemukan pada penelitian ini
Karakter Gen COI S. incertulas penelitian ini
Sc2LMJ.H7 Sc1SLM.H8 Sc1PML.H9
Panjang DNA (pb) 680 680 680
Kandungan AT (%) 66.48 66.57 66.86
Hasil BLAST:
Spesies lain S. incertulas S. incertulas S. incertulas
(Lep.12062007.H1) (Lep.10022006.H5) (Lep.12062007.H1)
No. Akses AB495265 AB495273 AB495265
E-value 0.0 0.0 0.0
Persentase Kesamaan 679/680 (99%) 679/680 (99%) 679/680 (99%)
Gap 0/680 (0%) 0/680 (0%) 0/680 (0%)
Tabel 9 BLAST-N gen COI S. incertulas haplotipe baru pada penelitian ini menggunakan program BLAST-N (www.ncbi.nlm.nih.gov)
Analisis homologi asam amino putative gen COI S. incertulas
Alignment sekuen asam amino putative gen COI S. incertulas pada penelitian ini menunjukkan kesamaan asam amino untuk semua sampel pada tiap lokasi. Panjang sekuen asam amino putative gen COI pada semua sampel S. incertulas adalah ± 249 pb.
Berdasarkan analisis homologi asam amino putative gen COI S. incertulas
menggunakan program BLAST-P, masing-masing haplotipe baru yang ditemukan pada penelitian ini menunjukkan kesamaan terhadap data haplotipe S. incertulas
yang sudah ada. Nilai kesamaan dan E-value pada asam amaino putative haplotipe 7 (Sc2LMJ.H7) dan haplotipe 8 (Sc1SLM.H8) yaitu 100% (1E-127), serta haplotipe 9 (Sc1PML.H9) yaitu 100% (7E-128) (Tabel 10).
Analisis jarak genetik dan filogeni gen COI
Analisis jarak genetik dan filogeni dilakukan antara S. incertulas dengan dan S. innotata (outgroup). Nilai jarak genetik tertinggi antara S. innotata dan S. incertulas asal Pemalang (Sc1PML.H9) sebesar 0.125. Selanjutnya, jarak genetik tertinggi antar S. incertulas ingroup yaitu individu asal Baluran (Lep.10042007.H2) dan individu asal Pemalang (Sc1PML.H9) dengan nilai 0.006. Sedangkan jarak genetik terendah dengan nilai 0.000 terjadi antara S. incertulas asal Tabanan (Sc2TBN.H1) dan S. incertulas asal Mojokerto (Sc2MJK.H1) (Tabel 11). Konstruksi filogeni untuk gen COI S. incertulas
(ingroup) dengan spesies lain kelompok Crambidae (outgroup) menunjukkan S. incertulas menjadi satu kelompok namun bersifat politom (Gambar 11).
Karakter Gen COI S. incertulas penelitian ini
Sc2LMJ.H7 Sc1SLM.H8 Sc1PML.H9
Panjang asam amino (pb) 226 226 226
Hasil BLAST:
Spesies lain S. incertulas S. incertulas S. incertulas
(Lep.12062007.H1) (Lep.10022006.H5) (Lep.12062007.H1)
No. Akses AB495265 AB495273 AB495265
E-value 1E-127 2E-127 7E-128
Persentase Kesamaan 226/226 (100%) 226/226 (100%) 226/226 (100%)
Gap 0/226 (0%) 0/226 (0%) 0/226 (0%)
Tabel 10 BLAST-P gen COI S. incertulas haplotipe baru penelitian ini menggunakan program BLAST-P (www.ncbi.nlm.nih.gov)
Tabel 11 Jarak genetik gen COI S. incertulas penelitian ini, data GenBank, serta S. innotata (Si.AB495264)
Keterangan: [ 1] Sc1SLM.H8 [ 7] Lep.20052006.H4 [13] Sc1KLT.H5 [19] Sc2SLM.H5 [ 2] Lep.10042007.H2 [ 8] Lep.12062007.H1 [14] Sc1PML.H9 [20] Sc1LMJ.H5 [ 3] Sc2TBN.H1 [ 9] Sc1MJK.H5 [15] Lep.10022006.H5 [21] Sc2PBL.H1 [ 4] Sc2MJK.H1 [10] Sc1TBN.H5 [16] Lep.13042007.H3 [22] Lep.28052006.H6 [ 5] Sc1JMB.H1 [11] Sc1PBL.H5 [17] Sc2KLT.H5 [23] Sc2LMJ.H7 [ 6] Sc2PML.H1 [12] Sc2KBM.H5 [18] Sc2JMB.H5 [24] Si.AB495264
Sampel penelitian ini merujuk pada Tabel 6; Sampel GenBank merujuk pada Tabel 2 dan 4. Angka yang didalam kotak menunujukkan jarak genetik yang terendah (0.000) dan tertinggi (0.125).
Gambar 11 Konstruksi pohon filogeni S. incertulas gen COI menggunakan metode Neighbor Joining dengan bootstrap 1000x. Sampel GenBank merujuk pada Tabel 2 dan 4; sampel penelitian ini merujuk pada Tabel 6.
Gen COII S. incertulas
Amplifikasi DNA gen COII S. incertulas
Amplikon gen COII S. incertulas dengan pasangan primer forward A-298 dan reverse Bt-LYS diperoleh ukuran pita ± 450 pb pada semua lokasi koleksi sampel. Panjang basa DNA S. incertulas tersebut sama pada tiap individu dari lokasi koleksi sampel. Sampel S. incertulas asal Sleman diwakili oleh yaitu Sc1SLM dan Sc2SLM, lokasi Mojokerto diwakili oleh Sc1MJK dan Sc2MJK, lokasi Probolinggo diwakili oleh Sc1PBL dan Sc2PBL, lokasi Tabanan diwakili oleh Sc1TBN dan Sc2TBN, lokasi Kebumen diwakili oleh Sc1KBM dan Sc2KBM, lokasi Klaten diwakili oleh Sc1KLT, asal Pemalang diwakili oleh Sc1PML dan Sc2 PML, lokasi Situbondo diwakili oleh Sc3STB dan Sc2STB, lokasi Jember diwakili oleh Sc1JMB dan Sc2JMB, serta lokasi Lumajang diwakili oleh Sc1LMJ dan Sc2LMJ (Gambar 12 & 13).
Gambar 12 Amplikon gen COII S. incertulas. 1: Sc1SLM; 2: Sc1MJK; 3: Sc1PBL; 4: Sc1TBN; 5: Sc1KBM; 6: Sc1KLT; 7: Sc1PML; 8: Sc3STB; 9:Sc1JMB; 10: Sc1LMJ; Kode sampel merujuk pada tabel 2; M = Penanda DNA 100 pb (Promega). Kode sampel merujuk pada Tabel 6.
8 M 1 2 3 4 5 6 7 9 10 450 pb M 1 2 3 4 A 4 1 2 3 5 M B
Gambar 13 Amplikon gen COII S. incertulas. A = 1: Sc2SLM, 2: Sc2MJK, 3: Sc2PBL, 4: Sc2TBN; B = 1: Sc2KBM, 2: Sc2PML, 3: Sc2STB, 4: Sc2JMB, 5: Sc2LMJ. M = Penanda DNA 100 pb (Promega). Kode sampel merujuk pada Tabel 6.
Sekuen gen COII S. incertulas
Sekuen gen COII dilakukan untuk dua individu S. incertulas pada tiap lokasi pengambilan sampel. Hasil sekuen berupa kromatogram, menunjukkan panjang sekuen DNA gen COII S. incertulas yaitu ± 420 pb (Lampiran 4 & 5).