VARIASI HAPLOTIPE GEN
Cytochrome c Oxidase
1 DAN 2
(COI DAN COII) DNA MITOKONDRIA PADA PENGGEREK
BATANG PADI KUNING
Scirpophaga incertulas
(Walker)
(Lepidoptera: Crambidae)
RUTH MARTHA WINNIE
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Variasi Haplotipe Gen
Cytochrome c Oxidase 1 dan 2 (COI dan COII) DNA Mitokondria pada Penggerek Batang Padi Kuning Scirpophaga incertulas (Walker) (Lepidoptera: Crambidae) adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada Perguruan Tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Agustus 2011
Ruth Martha Winnie
ABSTRACT
RUTH MARTHA WINNIE. Haplotype Variations of Yellow Rice Stem Borer Scirpophaga incertulas Based on Cytochrome c Oxidase 1 and 2 (COI and COII) Mitochondria Genes. Supervised by RIKA RAFFIUDIN and I MADE SAMUDRA.
Scirpophaga incertulas or yellow rice stem borer (Lepidoptera: Crambidae) is one of the main insects caused damage yields in rice in Asia, including Indonesia. In the first instar of S. incertulas larva, the moth cannot be discriminated with other species of rice stem borers. Hence, a molecular approach is needed for early detection purpose. Previous study found six haplotypes of
cytochrome oxidase 1 (COI) of S. incertulas from Java and four haplotypes of
cytochrome oxidase 2 COII gene in S. incertulas from West Java. The objective of this research was to explore further the haplotype variations of the S. incertulas of COI and COII genes in Central Java, Special Region of Yogyakarta (DIY), East Java, and Bali, to fulfill the haplotypes variation data in Indonesia. The study found three new haplotypes (haplotype 7, 8, and 9) of S. incertulas COI sequences as well as three new haplotypes (haplotype 5, 6, and 7) of COII sequences. Those new haplotypes of S. incertulas COI gene were found in Lumajang, Sleman, and Pemalang regions. DNA alignment analyzes result based on S. incertulas COII gene revealed three new haplotypes i.e. haplotype 5 in Mojokerto, Tabanan, Lumajang, Pemalang, Klaten, Jember, and Kebumen region, haplotype 6 in Probolinggo regions, and haplotype 7 in Situbondo region. Nucleotide variations of moth S. incertulas COII were higher compare to COI gene. Database of COI and COII haplotype variations of yellow rice stem borer can be used as markers to differentiate S. incertulas with other species of rice stem borers during the first larva instar for their early detection. Phylogenetic analysis of S. incertulas COII revealed three clusters in Java and Bali.
RINGKASAN
RUTH MARTHA WINNIE. Variasi Haplotipe Gen Cytochrome c Oxidase 1 dan 2 (COI dan COII) DNA Mitokondria pada Penggerek Batang Padi Kuning Scirpophaga incertulas (Walker) (Lepidoptera: Crambidae). Dibimbing oleh RIKA RAFFIUDIN dan I MADE SAMUDRA.
Penggerek batang padi kuning, Scirpophaga incertulas merupakan salah satu serangga utama yang menyerang tanaman padi di Indonesia. Kerusakan tanaman padi disebabkan oleh aktivitas larva S. incertulas di dalam batang padi. Dua gejala kerusakan tanaman padi yang disebabkan oleh larva S. incertulas yaitu gejala sundep pada fase vegetatif dan gejala beluk pada fase generatif. Gejala sundep disebabkan oleh titik tumbuh tanaman padi yang mati pada fase vegetatif. Sedangkan, gejala beluk disebabkan oleh pangkal malai tanaman padi yang dikerat oleh larva serangga ini. Aktivitas larva S. incertulas pada fase generatif tersebut menyebabkan pangkal malai menjadi mati sehingga bulir padi menjadi hampa.
Pengendalian dapat dilakukan dengan deteksi dini untuk menentukan spesies penggerek. Secara morfologi, fase larva instar ke-1 sulit dibedakan antar spesies penggerek batang padi. Aplikasi molekular dengan mempelajari variasi genetik dapat digunakan untuk deteksi dini untuk membedakan antar spesies penggerek batang padi. Oleh karena itu, database molekular S. incertulas di Asia diperlukan karena penyebaran melalui manusia memungkinkan serangga tersebut tersebar dari tempat asalnya. Apabila terjadi dominansi S. incertulas di suatu wilayah maka informasi variasi genetik dapat digunakan untuk mempelajari asal usul serangga tersebut.
Genom DNA mitokondria (mtDNA) merupakan salah satu metode yang digunakan untuk mempelajari variasi genetik dan hubungan kekerabatan intraspesies. Gen mtDNA yang banyak digunakan sebagai penanda dalam analisis variasi genetik adalah gen cytochrome c oxidase 1 dan 2 (COI dan COII). Pada mtDNA, daerah COI dan COII memiliki variasi genetik yang sedikit konservatif, serta tidak ada delesi dan insersi. Oleh karena itu, gen COI dan gen COII banyak digunakan dalam studi molekular.
Data molekular mtDNA untuk genus Scirpophaga sudah dianalisis pada penggerek batang tebu (S. excerptalis), penggerek batang padi putih (S. innotata), dan S. incertulas. Analisis genetik mtDNA dilakukan pada S. excerptalis asal India dan Papua Nugini dengan menggunakan penanda gen COII. Di Indonesia, data sekuen mtDNA telah dianalisis untuk gen COI S. innotata dan S. incertulas. Pada gen COI S. incertulas ditemukan enam haplotipe dari beberapa daerah di Jawa. Selanjutnya, analisis variasi genetik menggunakan gen COII S. incertulas
menunjukkan ada empat haplotipe yang menyebar di Bogor, Karawang, Cirebon, Indramayu (Jawa Barat). Oleh karena itu, analisis lebih lanjut variasi haplotipe gen COI dan gen COII S. incertulas perlu dilakukan untuk melengkapi database
haplotipe serangga tersebut. Analisis lanjutan tersebut juga dapat digunakan untuk mempelajari hubungan kekerabatan antar individu S. incertulas di Indonesia.
perkembangan S. incertulas yang digunakan untuk analisis DNA adalah fase dewasa.
Tahapan analisis DNA S. incertulas adalah (1) ekstraksi DNA dengan metode CTAB dan presipitasi alcohol, (2) amplifikasi DNA, dan (3) penentuan runutan DNA. Tahapan analisis data DNA S. incertulas adalah (1) analisis homologi (alignment) DNA dan asam amino S. incertulas, (2) analisis jarak genetik, dan (3) analisis filogeni.
Sekuen individu S. incertulas untuk masing-masing gen COI dan gen COII dapat dikelompokkan menjadi haplotipe umum dan haplotipe-haplotipe lain yang merupakan gabungan data sekuen penelitian ini dengan data sekuen yang sudah ada. Haplotipe umum ditentukan berdasarkan sekuen DNA yang paling banyak ditemukan yaitu haplotipe 5 untuk gen COI dan haplotipe 1 untuk gen COII. Fenomena tersebut menunjukkan bahwa berdasarkan penanda gen COI dan gen COII kemungkinan disebabkan oleh adanya aliran gen maternal dari serangga penggerek batang padi pada semua lokasi di Jawa dan Bali.
Fenomena lain pada masing-masing gen mtDNA penelitian ini adalah ditemukan haplotipe baru. Jumlah individu S. incertulas untuk haplotipe baru gen COII yaitu haplotipe 5 yang tersebar di semua lokasi penelitian ini. Hal yang berbeda, pada gen COI S. incertulas untuk haplotipe baru (haplotipe 7, 8, 9) hanya ditemukan satu individu untuk tiap lokasi. Haplotipe baru yang ditemukan pada gen COII (haplotipe 5, 6, dan 7) menunjukkan variasi subtitusi nukleotida lebih tinggi dibandingkan dengan gen COI. Tiga haplotipe baru pada gen COII memiliki jumlah variasi subtitusi tiap individu antara 3-5 nukleotida yang menghasilkan jarak genetik berkisar antara 0.000-0.016. Jarak genetik yang lebih kecil (0.000-0.003) terjadi dari variasi yang sedikit pada gen COI dibandingkan gen COII pada penggerek batang padi kuning hasil penelitian ini. Jarak genetik yang lebih besar pada gen COII S. incertulas tersebut menghasilkan pohon filogeni COII yang lebih memberikan sinyal filogeni dibandingkan gen COI. Hal tersebut dapat dilihat berdasarkan panjang cabang (branch length) pada pohon filogeni. Konstruksi pohon filogeni berdasarkan penanda gen COII S. incertulas
lebih memberikan informasi kekerabatan dibandingkan penanda gen COI. Berdasarkan gen COII terdapat tiga kluster S. incertulas di Jawa dan Bali yaitu kluster A (haplotime umum, haplotipe 4, dan haplotipe 2), kluster B (haplotipe 3 dan S. incertulas asal Sleman), dan kluster C (haplotipe 5 dan 6). Haplotipe 7 pada pohon filogeni tersebut merupakan basal dari ketiga kluster tersebut. Variasi haplotipe baru S. incertulas yang ditemukan pada penelitian ini (haplotipe 5, 6 dan 7) menunjukkan pengelompokan yang terpisah dengan haplotipe yang sudah ada. Filogeni S. incertulas menggunakan gen COI dan gen COII belum memperlihatkan haplotipe yang spesifik dari tiap lokasi. Oleh karena itu, eksplorasi variasi haplotipe lebih lanjut perlu dilakukan di Sumatera, Kalimantan, dan Indonesia bagian timur.
RFLP tersebut dapat dilakukan untuk eksplorasi lanjutan database variasi haplotipe S. incertulas di Indonesia. Berdasarkan sekuen DNA gen COII hasil penelitian ini dapat dilanjutkan dengan metode RFLP yaitu dengan menganalis jenis enzim restriksi yang memotong gen COII. Pola pita DNA hasil pemotongan gen COII dengan enzim restriksi dipilih pola yang spesifik yang mencirikan masing-masing spesies penggerek batang padi.
Pemantauan S. incertulas dengan melakukan analisis DNA digunakan sebagai penanda genetik organisme. Penelitian ini memberikan data dasar bahwa sekuen DNA gen COII pada ngengat S. incertulas memiliki variasi yang lebih tinggi dibandingkan gen COI. Dengan demikian, untuk analisis atau aplikasi selanjutnya dapat menggunakan gen COII.
©Hak Cipta milik IPB, tahun 2011 Hak cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
VARIASI HAPLOTIPE GEN
Cytochrome c Oxidase
1 DAN 2
(COI DAN COII) DNA MITOKONDRIA PADA PENGGEREK
BATANG PADI KUNING
Scirpophaga incertulas
(Walker)
(Lepidoptera: Crambidae)
RUTH MARTHA WINNIE
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada Program Studi Biosains Hewan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
I dedicated this Master Thesis for Mom and Dad:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan YME atas segala karunia dan berkat-Nya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr. Ir. Rika Raffiudin, M.Si. dan Bapak Dr. Ir. I Made Samudra, M. Sc. yang telah banyak memberikan saran serta bimbingan. Penulis juga mengucapkan terimakasih kepada Bapak Dr. Ir. Idham Sakti Harahap, M. Si. selaku penguji luar komisi pada ujian tesis atas saran dan masukan untuk tesis ini. Selain itu, ucapan terimkasih penulis berikan kepada Bapak Dr. Ir. Achmad Farajallah, M. Si. sebagai wakil dari Mayor Biosains Hewan atas kehadirannya pada ujian tesis saya serta saran dan masukan membangun yang diberikan untuk tesis ini. Ucapan terimakasih penulis kepada IMHERE B2C-IPB tahun 2010/2011 yang telah mendanai penelitian ini atas nama Dr. Ir. Rika Raffiudin, M.Si., Dr. Ir. I Made Samudra, M. Sc., dan Dr. Ir. Idham Sakti Harahap, M. Si. dengan judul “Penggerek Batang Padi Scirpophaga incertulas di Jawa dan Bali: Variasi DNA Mitokondria dan Karakterisasi Protein Pengikat Feromon sebagai Dasar Biokontrol Hama Padi”. Ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada Dinas Pertanian Bali, Balai Pengkajian Teknologi Pertanian (BPTP) Yogyakarta, BPTP Malang, dan BPTP Bali untuk informasi lokasi penelitian ini. Penulis juga mengucapkan terimakasih kepada Ibu Tri Martini, M. Si., Bapak M. Ali, M. Si., Bapak Arif Rohmatullah, S. Si., M. Si., Bapak Puji, Dzulfaqor, S. Si, Cahyo Nugroho, S. Si, dan Jazirotul Fitriyati, M. Si atas bantuanya selama di lapangan untuk pengambilan sampel penelitian ini.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada staf pengajar Biosains Hewan (BSH) atas semua ilmu, pengalaman, bimbingan, nasihat, dan dorongan yang telah diberikan. Ucapan terimakasih untuk teman-teman Biosains Hewan 2009 dan Zoo Corner atas persahabatan yang indah selama ini. Ucapan terima kasih yang tulus penulis berikan untuk Orangtua, Kakak, serta Adik atas segala doa, kasih sayang, dan dukungannya kepada penulis.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, Agustus 2011
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 24 Juni 1986, merupakan putri dari pasangan Bapak Ir. I Wayan Sariasa dan Ibu dr. Dolly Olga Tenny Tahalele. Penulis adalah anak ketiga dari empat bersaudara. Setelah tamat dari SMUN 1 Pamulang pada tahun 2004, penulis diterima di Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) di Program Studi Biologi. Penulis menyelesaikan studi strata S1 tersebut pada tahun 2008.
Pada tahun 2009 penulis melanjutkan perkuliahan u n t u k s t r a t a S 2 di Sekolah Pascasarjana IPB, Mayor Biosains Hewan (BSH), Bagian Fungsi dan Perilaku Hewan. Pada masa perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Mikroteknik, Avertebrata, dan Fungsi Hayati Hewan untuk mahasiswa S1 Biologi. Pada tahun 2010 penulis menjadi peserta seminar internasional ATBC 2010 dengan judul poster “Haplotype Variations of
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ... x
DAFTAR GAMBAR ... xii
DAFTAR LAMPIRAN ... xiv
PENDAHULUAN ... 1
Latar Belakang... 1
Tujuan Penelitian ... 3
Hipotesis Penelitian ... 3
Manfaat Penelitian ... 3
TINJAUAN PUSTAKA ... 5
Penggerek Batang Padi di Indonesia ... 5
Biologi S. incertulas (Walker) ... 5
Siklus Hidup S. incertulas ... 7
Genom mitokondria ... 8
BAHAN DAN METODE ... 11
Waktu dan Tempat Penelitian ... 11
Objek Penelitian ... 11
Tahapan Analisis DNA S. incertulas... 11
Ekstraksi DNA ... 11
Amplifikasi DNA ... 13
Elektroforesis dan visualisasi DNA ... 14
Sekuen DNA ... 14
Analisis Data DNA S. incertulas ... 14
Analisis Homologi DNA S. incertulas ... 15
Gen COI ... 15
Gen COII ... 15
Analisis Homologi Asam Amino PutataiveS. incertulas ... 16
Analisis Jarak Genetik ... 16
Analisis Filogeni ... 17
HASIL ... 19
Koleksi Penggerek Batang Padi Kuning S. incertulas ... 19
Gen COI S. incertulas ... 21
Amplifikasi DNA gen COI S. incertulas ... 21
Sekuen DNA gen COI S. incertulas ... 22
Analisis homologi DNA gen COI S. incertulas ... 24
Analisis homologi asam amino putative gen COI S. incertulas ... 27
Analisis jarak genetik dan filogeni gen COI ... 27
Amplifikasi DNA gen COII S. incertulas ... 30 Sekuen gen COII S. incertulas ... 31 Analisis homologi DNA gen COII S. incertulas ... 32 Analisis homologi asam amino putative gen COII S. incertulas ... 36 Analisis jarak genetik gen COII ... 36 Analisis filogeni gen COII ... 38
PEMBAHASAN ... 41
Variasi Gen COI dan Gen COII S. incertulas di Jawa dan Bali ... 41 Deteksi Dini S. incertulas ... 43 Aplikasi dan Rencana Penelitian Selanjutnya ... 45
SIMPULAN ... 47
DAFTAR PUSTAKA ... 49
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen COI dan gen COII S. incertulas dan posisi primer berdasarkan mtDNA O. furnacalis ... 13 2 Database haplotipe gen COI S. incertulas yang ada di GenBank ... 15 3 Database haplotipe gen COII S. incertulas berdasarkan penelitian Raffiudin
dan Samudra (2010) ... 16 4 Database gen COI Crambidae (outgroup) yang diperoleh dari GenBank untuk analisis filogeni pada penelitian ini ... 17 5 Database gen COII Crambidae (outgroup) yang diperoleh dari GenBank untuk
analisis filogeni pada penelitian ini ... 17 6 Data lokasi koleksi S. incertulas yang dilakukan pada penelitian ini ... 20 7 Gabungan data haplotipe gen COI S. incertulas di Jawa Barat, Jawa Tengah,
Daerah Istimewa Yogyakarta, Jawa Timur, dan Bali ... 25 8 Posisi nukleotida gen COI S. incertulas penelitian ini dengan database sekuen nukleotida berdasarkan GenBank yang menunjukkan variasi haplotipe ... 26 9 BLAST-N gen COI S. incertulas haplotipe baru pada penelitian ini
menggunakan program BLAST-N ... 26 10 BLAST-P gen COI S. incertulas haplotipe baru penelitian ini menggunakan
program BLAST-P ... 27 11 Jarak genetik gen COI S. incertulas penelitian ini, data GenBank, serta S. innotata (Si.AB495264) ... 28 12 Gabungan data haplotipe gen COII S. incertulas di Jawa Barat, Jawa Tengah, DIY, Jawa Timur, dan Bali ... 34 13 Posisi sekuen DNA gen COII S. incertulas penelitian ini dengan database
sekuen gen COII S.incertulas Raffiudin & Samudra (2010) ... 35 14 BLAST-N gen COII S. incertulas pada haplotipe baru pada penelitian ini
menggunakan program BLAST-N ... 35 15 BLAST-P gen COII S. incertulas haplotipe baru pada penelitian ini
menggunakan program BLAST-P ... 38 16 Jarak genetik genCOII S. incertulas penelitian ini dan databaseS. incertulas
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Penggerek batang padi kuning S. incertulas: a) betina, b) jantan (Khan et al. 1991). ... 6 2 Perkembangan S. incertulas dari telur sampai dewasa (Pathak & Khan 1994;
Taylor 1996). ... 8 3 Genom DNA mitokondria lengkap O. furnacalis (Lepidoptera: Crambidae)
(Coates 2004). ... 8 4 Posisi primer forward Mt D4 dan primer reverse Mt D9 untuk amplifikasi gen COI S. incertulas serta primer forward A-298 dan primer reverse Bt-LYS untuk amplifikasi gen COII S. incertulas. ... 13 5 Gejala kerusakan padi akibat serangan S. incertulas. A) Sundep; B) Beluk. ... 19 6 Peta lokasi koleksi S. incertulas di Jawa Tengah, Daerah Istimewa Yogyakarta (DIY), Jawa Timur, dan Bali. ... 21 7 Amplikon gen COI S. incertulas.. ... 22 8 Amplikon gen COI S. incertulas.. ... 22 9 Sekuen gen COI S. incertulas asal Tabanan (Sc1TBN) dan deduksi asam amino ... 23 10 Skema alignment sekuen DNA gen COI S. incertulas antara data hasil
penelitian ini dengan data GeneBank.. ... 25 11 Konstruksi pohon filogeni S. incertulas gen COI menggunakan metode
Neighbor Joining dengan bootstrap 1000x. ... 29 12 Amplikon gen COII S. incertulas. ... 30 13 Amplikon gen COII S. incertulas. ... 30 14 Sekuen gen COII S. incertulas asal Probolinggo (Sc1 PBL) dan deduksi asam amino. ... 31 15 Skema alignment sekuen DNA gen COII S. incertulas antara data hasil
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Kromatogram sekuen gen COI mtDNA S. incertulas (Sc1TBN) menggunakan primer forward Mt D4 ... 55
2 Kromatogram sekuen gen COI mtDNA S. incertulas (Sc1TBN) menggunakan primer reverse Mt D9 ... 56
3 Alignment sekuen gen COI S. incertulas penelitian ini (Tabel 6) dengan sekuen
S. incertulas pada GenBank (Tabel 2) ... 57
4 Kromatogram sekuen gen COII mtDNA S. incertulas (Sc1PBL) menggunakan primer forward A-298 ... 64
5 Kromatogram sekuen gen COII mtDNA S. incertulas (Sc1PBL) menggunakan primer forward Bt-LYS ... 65
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Penggerek batang padi kuning, Scirpophaga incertulas (Walker)
(Lepidoptera: Crambidae), merupakan salah satu serangga utama yang menyerang
tanaman padi di Indonesia (Hattori & Siwi 1986). Larva S. incertulas merusak
tanaman padi pada semua fase pertumbuhan, yaitu pada masa persemaian, fase
vegetatif, dan fase generatif. Kerusakan tanaman padi disebabkan oleh aktivitas
larva S. incertulas di dalam batang padi. Dua gejala kerusakan tanaman padi yang
disebabkan oleh larva S. incertulas yaitu gejala sundep pada fase vegetatif dan
gejala beluk pada fase generatif. Gejala sundep disebabkan oleh titik tumbuh
tanaman padi yang mati pada fase vegetatif. Sedangkan, gejala beluk disebabkan
oleh pangkal malai tanaman padi yang dikerat oleh larva serangga ini. Aktivitas
larva S. incertulas pada fase generatif tersebut menyebabkan pangkal malai
menjadi mati sehingga bulir padi menjadi hampa (Pathak & Khan 1994).
Menurut penelitian Kurniati dan Hendarsih (2007), S. incertulas
merupakan penggerek batang padi yang dominan (outbreak) dibandingkan dengan
spesies penggerek batang padi lain. Larva S. incertulas menyerang tanaman padi
dan menyebabkan kerusakan sebesar 95% dari luas arael tanaman padi 300 000 ha
di beberapa daerah di pulau Jawa.
Pemantauan terhadap serangan S. incertulas yang merusak tanaman padi
perlu dilakukan untuk mengetahui tingkat serangan serangga tersebut. Tingkat
serangan S. incertulas termasuk dibawah ambang ekomoni apabila 1 anakan padi
mengalami kerusakan per 10 rumpun padi atau 1 kelompok telur per 1 m2 (Sudjianto 2010). Data hasil pemantauan S. incertulas tersebut dapat digunakan
untuk pemilihan pengendalian yang efektif.
Pengendalian yang aman terhadap serangga ini dapat dilakukan dengan
penggunaan perangkap feromon seks (Hendarsih & Usyati 1999; Cork et al. 2007)
atau pengambilan kelompok telur S. incertulas secara manual (Sudjianto 2010).
Selain itu, pengendalian dapat juga dilakukan dengan deteksi dini untuk
menentukan spesies penggerek. Secara morfologi, fase larva instar ke-1 sulit
mempelajari variasi genetik dapat digunakan untuk deteksi dini untuk
membedakan antar spesies penggerek batang padi. Deteksi dini secara molekular
telah dilakukan pada parasitoid dari larva penggerek batang jagung asal Eropa
(Ostrinia nubilalis) (Agusti et al. 2005). Selain itu, aplikasi molekular dilakukan
untuk identifikasi lima spesies kutu daun (Hemiptera: Pseudococcidae) yang
menyerang tanaman jeruk pada fase telur dan nimpa (Pieterse et al. 2010).
Distribusi S. incertulas adalah di wilayah Oriental dan Australia (Khan et
al. 1991; Pathak & Khan 1994). Database molekular S. incertulas di Asia penting
karena penyebaran melalui manusia memungkinkan serangga tersebut tersebar
dari tempat asalnya. Apabila terjadi dominansi S. incertulas di suatu wilayah
maka informasi variasi genetik dapat digunakan untuk mempelajari asal usul
serangga tersebut. Pengetahuan mengenai asal usul telah dipelajari pada
penggerek batang jagung (O. furnacalis) asal Jepang. Penelitian ini
menyim-pulkan bahwa terdapat dua garis asal usul yaitu kelompok A yang berasal dari
Jepang dan Cina, serta kelompok B yang berasal dari Jepang dan Filipina
(Hoshizaki et al. 2008a).
DNA mitokondria (mtDNA) merupakan salah satu metode yang
digunakan untuk mempelajari variasi genetik dan hubungan kekerabatan
intraspesies (Ridley 1996). Pada mtDNA tidak terjadi rekombinasi gen karena
pola pewarisan diturunkan secara maternal. Hal tersebut dapat menunjukkan
bahwa hubungan kekerabatan berdasarkan mtDNA antar individu S. incertulas
berasal dari aliran gen induk maternal serangga tersebut. Gen mtDNA yang
banyak digunakan sebagai penanda dalam analisis variasi genetik adalah gen
cytochrome c oxidase 1 dan 2 (COI dan COII) (King et al. 2002; Simon et al.
2006; Kourti 2006). Gen COI dan gen COII merupakan gen penyandi protein.
Pada mtDNA, daerah COI dan COII memiliki variasi genetik yang sedikit
konservatif, serta tidak ada delesi dan insersi (Hebert et al. 2003). Oleh karena itu,
gen COI dan gen COII banyak digunakan dalam studi molekular.
Data molekular mtDNA untuk genus Scirpophaga sudah dianalisis pada
penggerek batang tebu (S. excerptalis), penggerek batang padi putih (S. innotata),
dan S. incertulas. Analisis genetik mtDNA dilakukan pada S. excerptalis asal
2004). Di Indonesia, data sekuen mtDNA telah dianalisis untuk gen COI S.
innotata (No. Akses GenBank: AB495264) dan S. incertulas. Pada gen COI S.
incertulas ditemukan enam haplotipe dari beberapa daerah di Jawa (No. Akses
GenBank: AB495265-AB495274). Selanjutnya, analisis variasi genetik
menggunakan gen COII S. incertulas menunjukkan ada empat haplotipe yang
menyebar di Bogor, Karawang, Cirebon, Indramayu (Jawa Barat) (Raffiudin &
Samudra 2010). Oleh karena itu, analisis lebih lanjut variasi haplotipe gen COI
dan gen COII S. incertulas perlu dilakukan untuk melengkapi database haplotipe
serangga tersebut. Analisis lanjutan tersebut juga dapat digunakan untuk
mempelajari hubungan kekerabatan antar individu S. incertulas di Indonesia.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah (1) mengeksplorasi lebih lanjut data variasi
haplotipe intraspesies S. incertulas di Jawa Tengah, DIY, Jawa Timur, dan Bali
dengan menggunakan penanda gen COI dan gen COII mtDNA; (2) menganalisis
filogeni antar individu S. incertulas di Indonesia berdasarkan gen COI dan gen
COII.
Hipotesis Penelitian
Berdasarkan gen COI dan gen COII S. incertulas ditemukan variasi
haplotipe baru di Jawa Tengah, DIY, Jawa Timur, dan Bali. Selain itu, variasi
haplotipe baru S. incertulas yang ditemukan pada penelitian ini menunjukkan
pengelompokan yang terpisah dengan haplotipe yang sudah ada.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini akan melengkapi database haplotipe gen COI dan COII pada
mtDNA S. incertulas di Indonesia. Selain itu, data haplotipe tersebut dapat
digunakan untuk deteksi awal spesies penggerek batang padi serta digunakan
TINJAUAN PUSTAKA
Penggerek Batang Padi di Indonesia
Penggerek batang padi merusak tanaman padi pada semua tahap
pertumbuhan mulai dari masa persemaian, fase vegetatif, dan fase generatif. Larva
dari penggerek batang padi merupakan penyebab utama kerusakan tanaman padi
(Pathak & Khan 1994).
Berdasarkan morfologi, ada enam jenis larva penggerek batang padi di
Indonesia yaitu penggerek batang padi kuning (S. incertulas), penggerek batang
putih (S. innotata), penggerek batang padi bergaris (Chilo suppressalis),
penggerek batang padi kepala hitam (C. polychrysus), C. auricilius, dan
penggerek batang padi merah muda (Sesamia inferens) (Hattori & Siwi 1996).
Kelompok penggerek batang Scirpophaga dan Chilo termasuk kedalam Famili
Crambidae, sedangkan kelompok penggerek batang Sesamia termasuk kedalam
Famili Noctuidae (Pathak & Khan 1994).
Serangga S. incertulas dominan sebagai penggerek batang padi
dibandingkan dengan spesies penggerek batang padi lain. Serangga S. incertulas
yang menyerang tanaman padi sebesar 95% dari luas arael tanaman padi yaitu 300
000 ha di beberapa daerah di pulau Jawa (Kurniati & Hendarsih 2007). Menurut
Sudjianto (2010), tingkat serangan S. incertulas termasuk dibawah ambang
ekomoni apabila 1 anakan padi mengalami kerusakan per 10 rumpun padi atau 1
kelompok telur per 1 m2.
Biologi S. incertulas (Walker)
Distribusi geografis S. incertulas adalah Afghanistan, Nepal, India, Sri
Lanka, Bangladesh, Myanmar, Vietnam, Thailand, Malaysia, Singapura,
Indonesia, Filipina, Hongkong, Taiwan, China, Jepang (Khan et al. 1991), dan
Australia (Pathak & Khan 1994). Di Indonesia, S. incertulas diketahui menyebar
di Lampung (Sumatera Selatan), Jawa, Bali, dan Kalimantan (Hattori & Siwi
1986).
Penggerek batang padi kuning, S. incertulas, termasuk ke dalam Kelas
Schoenobiinae, dan Genus Scirphopaga (Kristensen et al. 2007). Dalam
klasifikasi Pyraloidea, Crambidae ditempatkan sebagai subfamili dari Pyralidae
yaitu Crambinae. Namun, berdasarkan penelitian Solis (2007) yang menyatakan
bahwa Pyraloidea dibagi menjadi dua famili yaitu Crambidae dan Pyralidae.
Pembagian dua famili tersebut berdasarkan morfolologi anggota Crambidae yang
memiliki dua membran tympani yang terbuka dengan lubang anteromedial lebar
dan menyatu yang disebut praecinctorium. Sedangkan, pada anggota Pyralidae
memiliki membran tympani yang tertutup dan tidak terdapat praecintorium.
S. incertulas jantan dan betina dapat dibedakan secara morfologi dari
ukuran sayap (Gambar 1). Berdasarkan morfologi sayap S. incertulas, ukuran
sayap betina lebih besar daripada ukuran sayap jantan. Ukuran sayap betina 24-36
mm, sedangkan ukuran sayap jantan 20-33 mm. Palpus labium berwarna kuning.
Segmen terakhir pada abdomen berwarna putih. Sayap bagian depan betina
berwarna pucat kekuning-kuningan sampai gelap kekuning-kuningan dengan titik
berwarna hitam di bagian discal. Frenulum berambut tebal. Sayap belakang jantan
memiliki fuscous dibagian samping dan dorsal dengan warna coklat dan terdapat
titik-titik gelap di bagian tengah sayap (Khan et al. 1991).
Gambar 1 Penggerek batang padi kuning S. incertulas: a) betina, b) jantan (Khan
Siklus Hidup S. incertulas
Perkembangan S. incertulas sangat tergantung dari kondisi lingkungan
terutama suhu udara (Stevenson et al. 2005). Penggerek batang padi kuning, S.
incertulas, memiliki fase perkembangan lengkap mulai telur, larva, pupa, sampai
dengan dewasa (Gambar 2). Ngengat S. incertulas betina meletakkan kelompok
telur yang ditutupi rambut-rambut halus di ujung daun padi. Jumlah telur yang
diletakkan berkisar 50-200 telur tiap tempat dari total 150-600 telur yang
dikeluarkan. Waktu inkubasi telur 5-9 hari dengan suhu optimum yaitu 24-29 oC (Taylor 1996). Telur akan menetas pada siang hari dengan suhu optimum yaitu
24-29 oC dan kelembaban kurang dari 70%. Arah penetasan telur bersifat geotropik negatif, larva akan bergerak keluar dengan merayap naik ke bagian
ujung tanaman padi. Lama perkembangan larva S. incertulas 17-46 hari. Larva S.
incertulas terdiri atas 4-7 instar sebelum berkembang sempurna (Pathak & Khan
1994). Jumlah instar tergantung dari kondisi suhu. Pada kondisi suhu rendah
jumlah instar larva akan lebih banyak dibandingkan dengan kondisi suhu tinggi.
Larva S. incertulas akan melalui lima tahapan instar pada suhu 23-29 oC, sedangkan empat tahapan instar akan dilalui larva S. incertulas apabila suhu udara
berkisar antara 29-30 oC (Pathak & Khan 1994, Stevenson et al. 2005). Perkembangan fase pupa S. incertulas terjadi di dalam pangkal batang padi.
Perkembangan fase pupa tejadi selama 9-12 hari dengan suhu optimum 15-16 oC. Setelah fase pupa, S. incertulas dewasa akan berkembang selama 2-5 hari (Pathak
& Khan 1994).
Penggerek batang padi kuning, S. incertulas, merupakan serangga endemik
yang setiap waktu dapat melakukan invasi. Ciri-ciri S. incertulas melakukan
invasi berupa perilaku terbang yang bertujuan untuk melakukan perilaku kawin.
Perilaku kawin tersebut terjadi pada sore hari hingga malam hari, setelah 35 hari
masa hujan. Serangga S. incertulas melakukan perilaku terbang selama dua
minggu, yang berorientasi di daerah-daerah persemaian tanaman padi (Khan et al.
Genom mitokondria
Mitokondria merupakan organel di dalam sel eukariot yang berfungsi
sebagai tempat proses metabolisme aerob. Isolasi DNA mitokondria (mtDNA)
serangga mudah dilakukan karena gen-gen pada mitokondria bersifat konservatif
(Hoy 2003). Analisis genom mitokondria lengkap pada penggerek batang jagung
asal Cina, O. furnacalis, menunjukkan ukuran sebesar 14 536 pasang basa (pb).
Genom mitokondria O. furnacalis terdiri atas 13 pengkode protein (ORFs atau
Open Reading Frames), 21 tRNA, gen large ribosomal RNA (rrnL atau 16S), dan
gen small ribosomal RNA (rrnS atau 12S) (Gambar 3) (Coates et al. 2005).
[image:36.595.89.491.69.841.2]Gambar 3 Genom DNA mitokondria lengkap O. furnacalis (Lepidoptera: Crambidae) (Coates 2004).
Genom mitokondria banyak digunakan sebagai penanda dalam analisis
variasi genetik (Simon et al. 2006; Hoshizaki et al. 2008b; Pieterse et al. 2010).
Pada mtDNA tidak terjadi rekombinasi gen karena pola pewarisan diturunkan
secara maternal (Ridley 1996). Gen-gen pada mtDNA yang dapat digunakan
sebagai penanda dalam analisis variasi genetik adalah gen cytochrome c oxidase 1
dan 2 (COI dan COII) (Simon et al. 2006). Gen COI dan COII merupakan gen
penyandi protein. Pada mtDNA, daerah COI dan COII memiliki variasi genetik
yang sedikit konservatif, serta tidak ada delesi dan insersi. Selain itu, gen COI
dapat digunakan sebagai penanda molekular untuk DNA barcode (Hebert et al.
2003).
Analisis variasi genetik menggunakan gen COI dan gen COII pada
serangga penggerek batang kelompok Crambidae telah banyak dilakukan. Data
variasi genetik pada gen COI dan gen COII C. suppressalis diketahui
berturut-turut ada 27 dan 24 haplotipe di dataran tinggi dan rendah Cina. Berdasarkan data
haplotipe C. suppressalis di Cina tersebut terbagi menjadi tiga kelompok yaitu
kelompok bagian tengah, kelompok bagian utara dan timur laut, dan kelompok
bagian barat daya (Meng et al. 2008). Penelitian Hoshizaki et al. (2008) berhasil
menentukan 29 haplotipe berdasarkan gabungan data sekuen gen COII O.
funacalis (penggerek batang jagung) di Jepang, Cina, dan Filipina. Data variasi
haplotipe tersebut menunjukkan ada dua garis asal-usul O. furnacalis di Jepang
yaitu garis asal usul A yang berasal dari Jepang dan Cina, serta garis asal-usul B
yang terdiri atas Jepang dan Filipina.
Data variasi genetik pada mtDNA dapat digunakan untuk mempelajari
hubungan kekerabatan interspesies. Lange et al. (2004) melakukan penelitian
menggunakan gen COII penggerek batang tebu (S. excerptalis) asal India dan
Papua Nugini. Analisis hubungan kekerabatan dilakukan antar data gen COII S.
excerptalis penelitian Lange et al. (2004) dan data gen COII spesies penggerek
lain yang diperoleh dari GenBank. Berdasarkan penanda gen COII tersebut
menunjukkan bahwa S. excerptalis termasuk ke dalam kluster Crambidae, serta
terpisah dengan spesies penggerek lain yang termasuk ke dalam kluster Pyralidae.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli 2010 sampai dengan Mei 2011.
Koleksi sampel dilakukan pada beberapa lokasi di Jawa Tengah, Daerah Istimewa
Yogyakarta (DIY), Jawa Timur, dan Bali. Analisis DNA dan analisis data
dilakukan di Bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi,
FMIPA, Institut Pertanian Bogor.
Objek Penelitian
Objek penelitian yang digunakan yaitu penggerek batang padi kuning S.
incertulas yang dikoleksi dari beberapa lokasi pengambilan sampel. Fase
perkembangan S. incertulas yang digunakan untuk analisis DNA yaitu fase
dewasa. Sampel S. incertulas dikoleksi dengan menggunakan jaring serangga dan
secara manual dengan menggunakan bantuan tabung reaksi. Sampel S. incertulas
yang diperoleh disimpan di dalam tabung 1.5 ml yang berisi etanol absolut.
Tahapan Analisis DNA S. incertulas
Ekstraksi DNA
Sebelum ekstraksi DNA, sampel S. incertulas yang disimpan di dalam
etanol absolut dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml yang berisi 500 µl Tris
HCl-EDTA (TE) 0.5 mM (Tris HCl 2 M; HCl-EDTA 0.2 M; air destilata) untuk
menggantikan etanol absolut dari jaringan sampel. Metode ekstraksi DNA yang
digunakan adalah metode Cetyl Trimetil Ammonium Bromide (CTAB) dan
presipitasi alkohol (Sambrook et al. 1989) dengan modifikasi berdasarkan
Raffiudin dan Crozier (2007). Sumber DNA yang diekstraksi yaitu jaringan
bagian toraks S. incertulas. Bagian toraks S. incertulas dengan bagian tubuh lain
(kepala, abdomen, dan tungkai) dipisahkan menggunakan scalpel steril.
Kemudian, toraks dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml dan tabung direndam di
dalam kotak berisi nitrogen cair (15 menit). Nitrogen cair berfungsi untuk
Toraks di dalam tabung digerus menggunakan grinder steril. Selanjutnya, toraks
di dalam tabung ditambahkan 300 µl larutan CTAB 0.2 % (b/v) (7.5 ml 1M
Tris-HCl pH 8; 3 ml 0.5 M NaEDTA pH 8; 6.135 g NaCl; 1.5 g CTAB; air hingga 75
ml). Proses berikutnya, supernatan ditambahkan 10 µl Proteinase K (5mg/ml).
Fungsi Proteinase K yaitu untuk menghancurkan protein. Kemudian, sampel
diinkubasi pada suhu 55 oC (2 jam). Setelah inkubasi, campuran disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (10 menit). Supernatan yang berisi DNA
dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml baru.
Supernatan yang berisi DNA ditambahkan 300 µl larutan Phenol
Chloroform Isoamyl alcohol (PCI) di dalam ruang asam, lalu disentrifugasi
dengan kecepatan 13 000 rpm (5 menit). Larutan PCI dibagian bawah tabung
dibuang, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit). Supernatan
yang berisi DNA dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml baru. Selanjutnya,
supernatan tersebut ditambahkan kembali 240 µl larutan PCI, putar perlahan lalu
disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (3 menit). Larutan PCI dibagian
bawah tabung dibuang dan disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit),
lalu supernatan yang berisi DNA dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml baru dan
disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit) untuk memastikan tidak
ada lagi fenol. Tahap berikutnya, supernatan yang berisi DNA ditambahkan 240
µl larutan Chloroform Isoamyl Alcohol (CIAA), lalu disentrifugasi dengan
kecepatan 13 000 rpm (3 menit). Kemudian, larutan CIAA di bagian bawah
tabung dibuang, sentrifugasi kembali dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit).
Supernatan yang berisi DNA di bagian atas tabung dipindahkan ke tabung 1.5 ml
baru dan ditambahkan 360 µl isopropanol murni untuk proses presipitasi DNA.
Proses presipitasi DNA dilakukan pada suhu -4 oC (overnight). Selanjutnya, supernatan disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (30 menit)
pada suhu 4 oC, lalu isopropanol dibuang. Endapan DNA ditambahkan 300 µl alkohol 70% (v/v) steril, sentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (10 menit).
Kemudian, etanol 70% steril dibuang dan endapan DNA dikeringkan dengan cara
divakum (30 menit). Endapan DNA yang diperoleh dilarutkan dalam TE 0.5 mM,
Amplifikasi DNA
Amplifikasi DNA hasil ekstraksi dilakukan untuk dua individu S.
incertulas dari tiap lokasi pengambilan sampel. Proses amplifikasi menggunakan
mesin PCR (ESCO). Amplifikasi fragmen gen COI S. incertulas menggunakan
primer forward Mt D4 dan reverse Mt D9 (Simon et al. 1994). Sedangkan
amplifikasi fragmen gen COII S. incertulas menggunakan primer forward A-298
dan reverse Bt-LYS (Liu & Beckenbach 1992; Simon et al. 1994) (Tabel 1,
Gambar 4).
100 pb
A-298
Bt-LYS Mt D4
Mt D9
tRNA-Leu
tRNA-Tyr tRNA-Lys
1442 2977
Gen COI
3040 3721
Gen COII
Gambar 4 Posisi primer forward Mt D4 dan primer reverse Mt D9 untuk amplifikasi gen COI S. incertulas serta primer forward A-298 dan primer reverse Bt-LYS untuk amplifikasi gen COII S. incertulas. Tabel 1 Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen COI dan gen COII S.
incertulas dan posisi primer berdasarkan mtDNA O. furnacalis
Primer Sekuen 5’-3’
Posisi primer pada mtDNA O. furnacalis (No. Akses GenBank: NC003368)
Gen COI
Mt D4 TACAATTTATCGCCTAAACTTCAGCC 1339-1365
Mt D9 CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC 2131-2157
(Simon et al. 1994)
Gen COII
A-298 ATTGGACATCAATGATATTGA 3337 - 3357
Bt-LYS GTTTAAGAGACCAGTACTTG 3739 - 3758
[image:41.595.110.512.81.829.2]Total volume pereaksi PCR yang digunakan adalah 20 µl. Pereaksi
tersebut terdiri atas 7.4 µl air destilata steril, 0.8 µl primer forward 10 µM, 0.8 µl
primer reverse 10 µM, 1 µl DNA cetakan, dan 10 µl 2x Ready Mix (Kapa Taq
DNA Polymerase (1 U per 20 µl), bufer Mg2+ 1.5 mM, dan dNTP 0.4 mM). Amplifikasi DNA pada mesin PCR terdiri atas pra-denaturation pada suhu 95 oC (2 menit), denaturation pada suhu 95 oC (1.5 menit), annealing pada suhu 50 oC (1-1.5 menit), elongation pada suhu 72 oC (1 menit), dan elongation akhir pada suhu 72 oC (2 menit). Tahap denaturation, annealing, dan elongation masing-masing 30 siklus.
Elektroforesis dan visualisasi DNA
Hasil amplifikasi DNA S. incertulas dimigrasikan sebanyak 1 µl pada
polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 6% dengan menggunakan buffer 1x
TBE (Tris 0.5 M, Asam Borat 0.65 M, EDTA 0.02 M). Visualisasi DNA
menggunakan pewarnaan perak nitrat (Byun et al. 2009).
Sekuen DNA
Sekuen DNA S. incertulas dilakukan pada gen COI dan gen COII mtDNA
menggunakan primer yang sama dengan primer yang digunakan pada amplifikasi
DNA. Proses sekuen DNA dilakukan untuk dua individu S. incertulas dengan
menggunakan jasa pelayanan sekuen. Selanjutnya, hasil sekuen DNA berupa
kromatogram di-edit secara manual.
Analisis Data DNA S. incertulas
Database hasil perunutan DNA gen COI dan gen COII S. incertulas
disimpan pada program Genetyx Win versi 4.0. Selanjutnya, database sekuen
DNA tersebut diedit secara manual dengan menggunakan program Genetyx Win
Analisis Homologi DNA S. incertulas
Gen COI
Analisis homologi dilakukan pada sekuen gen COI S. incertulas penelitian
ini dengan data GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Analisis homologi tersebut
menggunakan program Basic Local Alignment Seacrh Tool-Nucleotide
(BLAST-N) dari website National Center for Biotechnology Information (NCBI)
(www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Sekuen nukleotida gen COI S. incertulas pada penelitian ini di-alignment
dengan data sekuen nukleotida gen COI ngengat anggota Crambidae yang
diperoleh dari GenBank. Data sekuen nukleotida untuk gen COI S. incertulas
yang sudah ada diperoleh dari GenBank (Tabel 2). Analisis homologi sekuen
nukleotida gen COI menggunakan program Clustal X (Thompson 1997) dan
program MEGA 5 (http://www.megasoftware.net/mega.php).
Gen COII
Sekuen gen COII S. incertulas penelitian ini dilakukan analisis homologi
menggunakan program BLAST-N dari situs NCBI. Selanjutnya, sekuen gen COII
S. incertulas pada penelitian ini di-alignment terhadap data sekuen gen COII hasil
penelitian Raffiudin dan Samudra (2010) (Tabel 3). Analisis alignment
mengunakan program Clustal X (Thompson 1997) dan program MEGA 5.
Tabel 2 Database haplotipe gen COI S. incertulas yang ada di GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov)
No Sampel Haplotipe Lokasi No. Akses
Sampel GenBank
1 Lep.12062007 Lep.12062007.H1 Dieng, Wanasaba, Jateng AB495265 2 Lep.20032007 Lep.20032007.H1 Pakembinangun, Sleman, DIY AB495267
3 Lep.16042007 Lep.16042007.H1 Magetan, Jatim AB495268
4 Lep.23032006 Lep.23032006.H1 Karangmangu, Baturaden, Jateng AB495272
5 Lep.10062005 Lep.10062005.H1 Garut, Jabar AB495273
6 Lep.10042007 Lep.10042007.H2 Baluran National Park, Jatim AB495269 7 Lep.13042007 Lep.13042007.H3 Alas Purwo National Park, Jatim AB495270
8 Lep.20052006 Lep.20052006.H4 Ciamis, Jabar AB495271
9 Lep.10022006 Lep.10022006.H5 Wates, Kulon Progo, DIY AB495266 10 Lep.28052006 Lep.28052006.H6 Halimun-Salak National Park, Jabar AB495274 Keterangan:
Analisis Homologi Asam Amino PutataiveS. incertulas
Sekuen nukleotida gen COI dan gen COII S. incertulas penelitian ini
masing-masing ditranslasi ke dalam asam amino dengan mengunakan program
Genetyx Win versi 4.0. Tahap berikutnya, sekuen asam amino putative gen COI
dan gen COII S. incertulas penelitian ini dilakukan analisis homologi dengan data
GenBank. Analisis homologi tersebut menggunakan program Basic Local
Alignment Search Tool-Protein (BLAST-P) dari situs NCBI. Selanjutnya, sekuen
asam amino putative di-alignment terhadap individu S. incertulas untuk
masing-masing gen COI dengan gen COII.
Analisis Jarak Genetik
Analisis jarak genetik dilakukan antara gen COI S. incertulas dan S.
innotata (Si; No. Akses GenBank: AB495264). Sedangkan, analisis jarak genetik
gen COII S. incertulas dilakukan antara S. excerptalis asal Papua Nugini dan India
(Se.PNG dan Se.India; berturut-turut No. Akses GenBank: AY320508 dan
AY320507). Proses analisis jarak gen COI dan COII S. incertulas menggunakan
program MEGA 5.
Tabel 3 Database haplotipe gen COII S. incertulas berdasarkan penelitian Raffiudin dan Samudra (2010)
No Sampel Haplotipe Lokasi Titik Koordinat
Sampel
1 Sc7Bg Sc7Bg.H1 Bogor, Jabar L: -6,872
2 Sc9Bg Sc9Bg H1 Bogor, Jabar A: 109,359
3 Sc22Kr Sc22Kr.H1 Karawang, Jabar L: -6,256 A: 107,322
4 Sc8Id Sc8Id.H1 Indramayu, , Jabar L: -
5 Sc10Id Sc10Id.H1 Indramayu, Jabar A: -
6 Sc11Bg Sc11Bg.H2 Bogor, Jabar L: -6,872
A: 109,359
7 Sc24Kr Sc24Kr.H3 Karawang, Jabar L: -
8 Sc1Cb Sc1Cb.H4 Cirebon, Jabar A: -
Keterangan:
Analisis Filogeni
Konstruksi pohon filogeni dilakukan antar gen COI S. incertulas (ingroup)
dan spesies ngengat lain kelompok Crambidae (outgroup) yaitu S. innotata, C.
suppressalis, dan O. furnacalis (Tabel 4). Pada gen COII, konstruksi pohon
filogeni dilakukan antar S. incertulas (ingroup) spesies ngengat lain kelompok
Crambidae (outgroup) yaitu S. excerptalis, C. suppressalis, dan O. furnacalis
(Tabel 5). Proses analisis filogeni tersebut menggunakan metode Neighbor
Joining (NJ) dengan bootstrap 1000x pada program MEGA 5.
[image:45.595.102.506.52.839.2]
Tabel 4 Database gen COI Crambidae (outgroup) yang diperoleh dari GenBank untuk analisis filogeni pada penelitian ini
No Spesies Lokasi No. Akses GenBank Sampel
1 S. innotata Indonesia AB495264 Si.AB495264
2 C. suppressalis Cina EU362114 Cs.H1.EU362114
Cina EU362115 Cs.H2.EU362115
3 O. furnacalis Cina NC003368 Of.NC003368
Tabel 5 Database gen COII Crambidae (outgroup) yang diperoleh dari GenBank untuk analisis filogeni pada penelitian ini
No Spesies Lokasi No. Akses GenBank Sampel
1 S. excerptalis India AY320507 Se.India.AY320507
Papua Nugini AY320508 Se.PNG.AY320508
HASIL
Koleksi Penggerek Batang Padi Kuning S. incertulas
Koleksi S. incertulas dilakukan di daerah tanaman padi yang mengalami
gejala kerusakan yang berbeda. Pada gejala sundep, koleksi sampel dilakukan
pada S. incertulas dewasa yang menunjukkan perilaku hinggap di ujung daun
pada fase vegetatif tanaman padi. Koleksi S. incertulas juga dilakukan di areal
tanaman padi yang menunjukkan gejala beluk pada fase generatif. Pada areal
tersebut, S. incertulas dewasa menunjukkan perilaku terbang di sekitar areal
tanaman padi (Gambar 5).
Total S. incertulas dewasa yang berhasil dikoleksi yaitu 164 individu.
Koleksi S. incertulas di Provinsi Jawa Tengah dan Daerah Istimewa Yogyakarta
(DIY) diperoleh dari empat kabupaten yaitu Kebumen, Sleman, Klaten, dan
Pemalang. Pengambilan sampel S. incertulas di Provinsi Jawa Timur dikoleksi
dari enam kabupaten yaitu Mojokerto, Probolinggo, Situbundo, Jember, dan
Lumajang. Selain itu, sampel S. incertulas juga diperoleh dari Kabupaten
Tabanan, Bali (Tabel 6, Gambar 6).
[image:47.595.108.508.89.790.2]B)
Gambar 5 Gejala kerusakan padi akibat serangan S. incertulas. A) Sundep; B) Beluk.
Tabel 6 Data lokasi koleksi S. incertulas yang dilakukan pada penelitian ini
No Lokasi Kode Jumlah Titik Kolektor
Jawa Tengah; DIY Sampel Sampel Koordinat
1 Kec. Kebumen, Sc-KBM 22 L: -7,670 RIR, RMW,
Kab. Kebumen A: 109,660 JAF
2 Kec. Berbah, Sc-SLM 3 L:-7,794 RMW, DZU
Kab. Sleman A: 110,455
3 Kec. Klaten Selatan, Sc-KLT 4 L: -7,717 RIR, RMW,
Kab. Klaten A: 110,583 JAF
4 Kec. Pemalang, Sc-PML 28 L: -6,872 RIR, RMW,
Kab. Pemalang A: 109,359 JAF
Jawa Timur
5 Kec. Mojosari, Sc-MJK 6 L: -7,471 IMS
Kab. Mojokerto A: 115,433
6 Kec. Gending, Sc-PBL 18 L: -7,827 RIR, RMW,
Kab. Probolinggo A: 113,437 CAN
7 Kec. Suboh, Sc-STB 3 L: -9,033 RIR, RMW,
Kab. Situbondo A: 164,616 CAN
8 Kec. Patrang, Sc-JMB 3 L: -8,183 RIR, RMW,
Kab. Jember A: 113,782 CAN
9 Kec. Mayang, Sc-JMB 1 L: -8,232 RIR, RMW,
Kab. Jember A: 113,848 CAN
10 Kec. Rowo Kangkung, Sc-LMJ 15 L: -8,1856 RIR, RMW,
Kab. Lumajang A: 113,347 CAN
Bali
11 Kec. Negara, Sc-JBR 0 L: -8,314 RMW
Kab. Jembrana A: 114,601
12 Kec. Kerambitan, Sc-TBN 61 L: -8,550 IMS
Kab. Tabanan A: 115,077
Total Sampel 164
Keterangan:
Kec. = Kecamatan, Kab. = Kabupaten;
Sc = S. incertulas; - = nomor urutan sampel S. incertulas;
KBM = Kebumen, SLM = Sleman, KLT= Klaten, PML = Pemalang, MJK = Mojokerto, PBL = Probolinggo, STB = Situbondo, JMB = Jember, LMJ = Lumajang, JBR = Jembrana, TBN = Tabanan;
L = Latitude, A = Altitude;
Gen COI S. incertulas
Amplifikasi DNA gen COI S. incertulas
Amplikon gen COI S. incertulas menggunakan primer forward Mt D4 dan
reverse Mt D9 menunjukkan ukuran pita DNA ± 900 pasang basa (pb). Panjang
basa DNA S. incertulas tersebut sama pada tiap individu dari lokasi koleksi
sampel. Sampel S. incertulas asal Sleman diwakili oleh yaitu Sc1SLM dan Sc2
SLM, lokasi Mojokerto diwakili oleh Sc1MJK dan Sc2MJK, lokasi Probolinggo
diwakili oleh Sc1PBL dan Sc2PBL, lokasi Tabanan diwakili oleh Sc1TBN dan
Sc2TBN, lokasi Kebumen diwakili oleh Sc2KBM, lokasi Klaten diwakili oleh
Sc1KLT dan Sc2KLT, lokasi Pemalang diwakili oleh Sc1PML dan Sc2 PML,
lokasi Jember diwakili oleh Sc1JMB dan Sc2JMB, serta lokasi Lumajang diwakili
[image:49.595.99.510.66.829.2]oleh Sc1LMJ dan Sc2LMJ (Gambar 7 & 8).
Gambar 6 Peta lokasi koleksi S. incertulas di Jawa Tengah, Daerah Istimewa Yogyakarta (DIY), Jawa Timur, dan Bali. Nomor merujuk pada Tabel 6.
1 4
10 6
9 8
7
11 12 5
3 2
Pulau Jawa dan Bali
[image:49.595.110.504.87.348.2]Sekuen DNA gen COI S. incertulas
Sekuen DNA gen COI S. incertulas dilakukan pada dua individu yang
mewakili tiap lokasi. Hasil sekuen gen COI diperoleh berupa kromatogram
(Lampiran 1 & 2). Sekuen gen COI yang telah di-edit ditemukan sekuen
nukleotida primer forward Mt D4 dan reverse Mt D9 (Gambar 9). Hasil sekuen
DNA gen COI S. incertulas pada tiap lokasi menghasilkan panjang nukleotida
yaitu ± 770 pb.
Gambar 7 Amplikon gen COI S. incertulas. A = 1: Sc1SLM, 2: Sc1MJK, 3: Sc1PBL, 4: Sc1TBN; B = 1: Sc1KLT, 2: Sc1PML, 3:Sc1JMB, 4: Sc2LMJ. M = Penanda DNA 100 pb (Promega). Kode sampel merujuk pada Tabel 6.
A
M 1 2 3 4
B
M 1 2 3 4
Gambar 8 Amplikon gen COI S. incertulas. A = 1: Sc2SLM, 2: Sc2MJK, 3: Sc2PBL, 4: Sc2TBN; B = 1: Sc2KBM, 2: Sc2KLT, 3: Sc2PML, 4:Sc2JM, 5: Sc2LMJ. M = Penanda DNA 100 pb (Promega). Kode sampel merujuk pada Tabel 6.
900 pb
M 1 2 3 4
A
4 5
1 2 3
M
900 pb
10 20 30 40 50 60 TTACAATTTATCGCCTAAACTTCAGCCATTTTATCATGCGAAAATGAATATACTCTACAA
Y S T N
70 80 90 100 110 120 ATCATAAGGATATTGGTACTTTATATTTTATTTTTGGAATTTGAGCTGGTATAGTAGGAA H K D I G T L Y F I F G I W A G M V G T
130 140 150 160 170 180 CTTCTTTAAGCTTACTTATTCGAGCTGAATTAGGAACTTCTGGATCCTTAATTGGAGATG S L S L L I R A E L G T S G S L I G D D
190 200 210 220 230 240 ATCAAATCTATAACACTATTGTCACAGCCCATGCCTTTATTATAATTTTTTTTATAGTTA Q I Y N T I V T A H A F I M I F F M V M
250 260 270 280 290 300 TACCCATTATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATTAGTCCCCCTAATATTAGGAGCCCCAG P I M I G G F G N W L V P L M L G A P D
310 320 330 340 350 360 ATATAGCTTTCCCCCGAATAAATAACATAAGATTCTGATTATTACCCCCCTCTTTAACAC M A F P R M N N M S F W L L P P S L T L
370 380 390 400 410 420 TCCTCATTTCTAGAAGAATTGTAGAAAATGGGGCTGGAACAGGATGAACTGTTTACCCAC L I S S S I V E N G A G T G W T V Y P P
430 440 450 460 470 480 CCCTATCATCCAATATTGCTCATGGGGGAACATCAGTAGATTTAGCTATTTTTTCTCTAC L S S N I A H G G T S V D L A I F S L H
490 500 510 520 530 540 ACCTAGCAGGAATTTCATCTATTTTAGGAGCTATTAATTTTATTACAACCATTATTAATA L A G I S S I L G A I N F I T T I I N M
550 560 570 580 590 600 TACGAATTAATGGATTATCATTTGACCAAATACCTCTATTTGTGTGAGCTGTTGGTATTA R I N G L S F D Q M P L F V W A V G I T
610 620 630 640 650 660 CAGCCCTTCTTTTACTTCTCTCTCTCCCAGTTTTAGCTGGAGCTATTACCATATTACTAA A L L L L L S L P V L A G A I T M L L T
670 680 690 700 710 720 CAGATCGAAATTTAAATACATCTTTTTTTGATCCAGCTGGAGGAGGAGATCCAATTTTAT D R N L N T S F F D P A G G G D P I L Y
[image:51.595.109.493.67.682.2]730 740 750 760 770 780 ATCAACACTTATTTTGATTTTTTGGGCATCCAGAAGTTTATATTTTAATTTTACC Q H L F W F F G H P E V Y I L I L
Analisis homologi DNA gen COI S. incertulas
Berdasarkan alignment DNA gen COI S. incertulas penelitian ini terhadap
data haplotipe gen COI S. incertulas yang ada di GenBank (Tabel 2) menunjukkan
kesamaan sekuen nukleotida dengan haplotipe S. incertulas yang sudah ada yaitu
haplotipe 1 (Lep.12062007.H1) dan haplotipe 5 (Lep.10022006.H5) (Gambar 10,
Lampiran 3). S. incertulas yang termasuk haplotipe 1 adalah Sc2TBN.H1,
Sc2PBL.H1, Sc2PML.H1, Sc2MJK.H1, dan Sc1JMB.H1. Sedangkan, S.
incertulas penelitian ini yang sama dengan sekuen nukleotida S. incertulas
haplotipe 5 yaitu Sc1MJK.H5, Sc1TBN.H5, Sc1PBL.H5, Sc2JMB.H5,
Sc1LMJ.H5, Sc2SLM.H5, Sc2KBM.H5, Sc2KLT.H5, dan Sc1KLT.H5. Individu
S. incertulas yang termasuk ke dalam haplotipe 5 merupakan haplotipe umum.
Alignment gen COI S. incertulas tersebut menunjukkan ada tiga haplotipe
baru yaitu haplotipe 7 (Sc2LMJ.H7), haplotipe 8 (Sc1SLM.H8), dan haplotipe 9
(Sc1PML.H9) (Tabel 7, Lampiran 3). Pemberian nomor untuk haplotipe baru
yang ditemukan melanjutkan nomor haplotipe S. incertulas yang sudah terdaftar
pada GenBank (Tabel 7).
Variasi nukleotida pada haplotipe baru yang ditemukan pada penelitian ini
disebabkan oleh beberapa subtitusi. Haplotipe 7 (Sc2LMJ.H7) pada S. incertulas
asal Lumajang terjadi subtitusi nukleotida pada posisi ke-482 yaitu C->T dan
posisi basa ke-644 (T->C). Haplotipe 8 (Sc1SLM.H8) terjadi subtitusi nukleotida
pada posisi basa ke-557 (C->T) dan posisi basa ke-644 (T->C) pada S. incertulas
asal Sleman. Selanjutnya, haplotipe 9 (Sc1PML.H9) terjadi subtitusi nukleotida
pada posisi basa ke-677 (A->G) pada S. incertulas asal Pemalang (Tabel 7 & 8).
Berdasarkan analisis homologi DNA gen COI S. incertulas menggunakan
program BLAST-N, masing-masing haplotipe baru yang ditemukan pada
penelitian ini menunjukkan kesamaan dengan data haplotipe S. incertulas yang
sudah ada di GenBank. Nilai kesamaan dan Expectation value (E-value) pada
haplotipe 7 (Sc2LMJ.H7), haplotipe 8 (Sc1SLM.H8), dan haplotipe 9
Tabel 7 Gabungan data haplotipe gen COI S. incertulas di Jawa Barat, Jawa Tengah, Daerah Istimewa Yogyakarta, Jawa Timur, dan Bali
No Sampel Haplotipe Posisi Perubahan
Sampel subtitusi nukleotida
1 Lep.12062007 Lep.12062007.H1 644 T->C
2 Lep.10042007 Lep.10042007.H2 51, 557, 644 A->G, C->T, T->C
3 Lep.13042007 Lep.13042007.H3 536 G->A
4 Lep.20052006 Lep.20052006.H4 117, 644 T->G, T->C
5 Lep.10022006 Lep.10022006.H5 - -
6 Lep.28052006 Lep.28052006.H6 29, 644 T->A, T->C
7 Sc2LMJ Sc2LMJ.H7* 482, 644 C->T, T->C
8 Sc1SLM Sc1SLM.H8* 557, 644 C->T, T->C
9 Sc1PML Sc1PML.H9* 677 A->G
Keterangan:
Sampel 1-6 merujuk Tabel 2. Sampel 7-9 merujuk Tabel 6. - = tidak ada perubahan nukleotida
* = haplotipe baru pada gen COI S. incertulas yang ditemukan pada penelitian ini.
2 5 8 2 4 6 7 1 9 3
100 200 300 400 500 600 680
Sc2LMJ.H7 Sc2TBN.H1 Sc2PBL.H1 Sc2PML.H1 Lep.20052006.H4 Lep.12062007.H1 Lep.28052006.H6 Lep.10022006.H5 Lep.13042007.H3 Sc1KLT.H5 Sc1PML.H9 Sc2MJK.H1 Sc1JMB.H1 Sc1LMJ.H5 Sc2SLM.H5 Sc2KBM.H5 Sc2KLT.H5 Nuk (pb) Lep.10042007.H2 Sc1MJK.H5 Sc1TBN.H5 Sc1PBL.H5 Sc2JMK.H5 Sc1SLM.H8
Tabel 8 Posisi nukleotida gen COI S. incertulas penelitian ini dengan database
sekuen nukleotida berdasarkan GenBank yang menunjukkan variasi haplotipe
Gen COI Nukleotida ke-
Sampel 29 51 117 482 536 557 644 677
Sc1MJK.H5 T A T C G C T A
Sc1TBN.H5 . . . . . . . .
Sc1PBL.H5 . . . .
Sc2JMB.H5 . . . .
Sc1SLM.H8 . . . . . T C .
Lep.10042007.H2 . G . . . T C .
Sc2LMJ.H7 . . . T . . C .
Sc2TBN.H1 . . . . . . C .
Sc2PBL.H1 . . . . C .
Sc2PML.H1 . . . . C .
Lep.20052006.H4 . . G . . . C .
Lep.12062007.H1 . . . . C .
Lep.28052006.H6 A . . . C .
Sc2MJK.H1 . . . . C .
Sc1JMB.H1 . . . . C .
Sc1LMJ.H5 . . . .
Sc2SLM.H5 . . . .
Sc2KBM.H5 . . . .
Sc2KLT.H5 . . . .
Sc1KLT.H5 . . . .
Sc1PML.H9 . . . . G
Lep.10022006.H5 . . . .
Lep.13042007.H3 . . . . A . . .
Keterangan:
Sampel 1-6 merujuk Tabel 2; sampel 7-9 merujuk Tabel 6. = haplotipe baru yang ditemukan pada penelitian ini
Karakter Gen COI S. incertulas penelitian ini
Sc2LMJ.H7 Sc1SLM.H8 Sc1PML.H9
Panjang DNA (pb) 680 680 680
Kandungan AT (%) 66.48 66.57 66.86
Hasil BLAST:
Spesies lain S. incertulas S. incertulas S. incertulas
(Lep.12062007.H1) (Lep.10022006.H5) (Lep.12062007.H1)
No. Akses AB495265 AB495273 AB495265
E-value 0.0 0.0 0.0
Persentase Kesamaan 679/680 (99%) 679/680 (99%) 679/680 (99%)
Gap 0/680 (0%) 0/680 (0%) 0/680 (0%)
Analisis homologi asam amino putative gen COI S. incertulas
Alignment sekuen asam amino putative gen COI S. incertulas pada
penelitian ini menunjukkan kesamaan asam amino untuk semua sampel pada tiap
lokasi. Panjang sekuen asam amino putative gen COI pada semua sampel S.
incertulas adalah ± 249 pb.
Berdasarkan analisis homologi asam amino putative gen COI S. incertulas
menggunakan program BLAST-P, masing-masing haplotipe baru yang ditemukan
pada penelitian ini menunjukkan kesamaan terhadap data haplotipe S. incertulas
yang sudah ada. Nilai kesamaan dan E-value pada asam amaino putative haplotipe
7 (Sc2LMJ.H7) dan haplotipe 8 (Sc1SLM.H8) yaitu 100% (1E-127), serta
haplotipe 9 (Sc1PML.H9) yaitu 100% (7E-128) (Tabel 10).
Analisis jarak genetik dan filogeni gen COI
Analisis jarak genetik dan filogeni dilakukan antara S. incertulas dengan
dan S. innotata (outgroup). Nilai jarak genetik tertinggi antara S. innotata dan S.
incertulas asal Pemalang (Sc1PML.H9) sebesar 0.125. Selanjutnya, jarak genetik
tertinggi antar S. incertulas ingroup yaitu individu asal Baluran
(Lep.10042007.H2) dan individu asal Pemalang (Sc1PML.H9) dengan nilai
0.006. Sedangkan jarak genetik terendah dengan nilai 0.000 terjadi antara S.
incertulas asal Tabanan (Sc2TBN.H1) dan S. incertulas asal Mojokerto
(Sc2MJK.H1) (Tabel 11). Konstruksi filogeni untuk gen COI S. incertulas
(ingroup) dengan spesies lain kelompok Crambidae (outgroup) menunjukkan S.
incertulas menjadi satu kelompok namun bersifat politom (Gambar 11).
Karakter Gen COI S. incertulas penelitian ini
Sc2LMJ.H7 Sc1SLM.H8 Sc1PML.H9
Panjang asam amino (pb) 226 226 226
Hasil BLAST:
Spesies lain S. incertulas S. incertulas S. incertulas
(Lep.12062007.H1) (Lep.10022006.H5) (Lep.12062007.H1)
No. Akses AB495265 AB495273 AB495265
E-value 1E-127 2E-127 7E-128
Persentase Kesamaan 226/226 (100%) 226/226 (100%) 226/226 (100%)
Gap 0/226 (0%) 0/226 (0%) 0/226 (0%)
[image:56.842.106.751.133.460.2]
Tabel 11 Jarak genetik gen COI S. incertulas penelitian ini, data GenBank, serta S. innotata (Si.AB495264)
Keterangan:
[ 1] Sc1SLM.H8 [ 7] Lep.20052006.H4 [13] Sc1KLT.H5 [19] Sc2SLM.H5
[ 2] Lep.10042007.H2 [ 8] Lep.12062007.H1 [14] Sc1PML.H9 [20] Sc1LMJ.H5
[ 3] Sc2TBN.H1 [ 9] Sc1MJK.H5 [15] Lep.10022006.H5 [21] Sc2PBL.H1
[ 4] Sc2MJK.H1 [10] Sc1TBN.H5 [16] Lep.13042007.H3 [22] Lep.28052006.H6
[ 5] Sc1JMB.H1 [11] Sc1PBL.H5 [17] Sc2KLT.H5 [23] Sc2LMJ.H7
[ 6] Sc2PML.H1 [12] Sc2KBM.H5 [18] Sc2JMB.H5 [24] Si.AB495264
Gen COII S. incertulas
Amplifikasi DNA gen COII S. incertulas
Amplikon gen COII S. incertulas dengan pasangan primer forward A-298
dan reverse Bt-LYS diperoleh ukuran pita ± 450 pb pada semua lokasi koleksi
sampel. Panjang basa DNA S. incertulas tersebut sama pada tiap individu dari
lokasi koleksi sampel. Sampel S. incertulas asal Sleman diwakili oleh yaitu
Sc1SLM dan Sc2SLM, lokasi Mojokerto diwakili oleh Sc1MJK dan Sc2MJK,
lokasi Probolinggo diwakili oleh Sc1PBL dan Sc2PBL, lokasi Tabanan diwakili
oleh Sc1TBN dan Sc2TBN, lokasi Kebumen diwakili oleh Sc1KBM dan
Sc2KBM, lokasi Klaten diwakili oleh Sc1KLT, asal Pemalang diwakili oleh
Sc1PML dan Sc2 PML, lokasi Situbondo diwakili oleh Sc3STB dan Sc2STB,
lokasi Jember diwakili oleh Sc1JMB dan Sc2JMB, serta lokasi Lumajang diwakili
oleh Sc1LMJ dan Sc2LMJ (Gambar 12 & 13).
Gambar 12 Amplikon gen COII S. incertulas. 1: Sc1SLM; 2: Sc1MJK; 3: Sc1PBL; 4: Sc1TBN; 5: Sc1KBM; 6: Sc1KLT; 7: Sc1PML; 8: Sc3STB; 9:Sc1JMB; 10: Sc1LMJ; Kode sampel merujuk pada tabel 2; M = Penanda DNA 100 pb (Promega). Kode sampel merujuk pada Tabel 6.
8
M 1 2 3 4 5 6 7 9 10
450 pb
M 1 2 3 4
A
4
1 2 3 5 M
B
Sekuen gen COII S. incertulas
Sekuen gen COII dilakukan untuk dua individu S. incertulas pada tiap
lokasi pengambilan sampel. Hasil sekuen berupa kromatogram, menunjukkan
panjang sekuen DNA gen COII S. incertulas yaitu ± 420 pb (Lampiran 4 & 5).
Analisis hasil sekuen DNA gen COII S. incertulas menunjukan posisi primer
forward A-298 dan reverse Bt-LYS (Gambar 14).
10 20 30 40 50 60
TATTGGACATCAATGATATTGAAGTTATGAATACTCCGACTTCAAAAACATTGAATTTGA I G H Q W Y W S Y E Y S D F K N I E F D
70 80 90 100 110 120 CTCCTATATAACCCCCTCAAATGAAATAAACCCTAATAATTTTCGGCTTTTAGATGTTGA S Y M T P S N E M N P N N F R L L D V D
130 140 150 160 170 180 TAACCGAATTGTTCTACCCATGAATAATCAAATTCGTATATTAATTACAGCTACAGATGT N R I V L P M N N Q I R M L I T A T D V
190 200 210 220 230 240 TATCCACTCCTGAACTATTCCCTCATTGGGAATTAAGGTAGATGCTAACCCAGGTCGACT I H S W T I P S L G I K V D A N P G R L
250 260 270 280 290 300 AAATCAAACATCCTTTTTTATAAACCGACCAGGAGTTTTTTTCGGACAATGCTCAGAAAT N Q T S F F M N R P G V F F G Q C S E I
310 320 330 340 350 360 TTGCGGGGCTAATCATAGTTTTATACCTATTGTAATTGAAAGTGTTAACATTAAAAATTT C G A N H S F M P I V I E S V N I K N F
370 380 390 400 410 420 TATTAATTGAATTAATAATTATTCCTCATTAGATGACTGAAGGCAAGTACTGGTCTCTTA I N W I N N Y S S L D D W S
[image:59.595.108.501.92.585.2]
Analisis homologi DNA gen COII S. incertulas
Analisis homologi gen COII S. incertulas penelitian ini dengan data
haplotipe gen COII S. incertulas yang sudah ada (Tabel 3) menunjukkan ada
delapan individu yang memiliki kesamaan homologi dengan haplotipe 1
(Sc7Bg.H1). Delapan haplotipe tersebut adalah Sc3STB.H1, Sc2PML.H1,
Sc1JMB.H1, Sc2LMJ.H1, Sc1SLM.H1, Sc2MJK.H1, Sc2PBL.H1, dan
Sc2TBN.H1. Individu S. incertulas yang termasuk ke dalam haplotipe 1
merupakan haplotipe umum. Selain itu, sekuen nukleotida S. incertulas yang
menunjukkan kesamaan dengan haplotipe 3 (Sc24Kr.H3) yaitu Sc2SLM.H3.
Alignment gen COII S. incertulas juga menunjukkan haplotipe baru. Ada
