KARAKTERISTIK GEN CYTOCHROME OXIDASE SUBUNIT I (COI)
PADA KERANG BULU (Anadara antiquata Linn. ) ASAL PERAIRAN
PANIMBANG DAN BOJONEGARA, PROVINSI BANTEN
DINI HERLINA
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
ABSTRAK
DINI HERLINA. Karakteristik Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) pada Kerang Bulu (Anadara antiquata Linn.) asal Perairan Panimbang dan Bojonegara, Provinsi Banten. Di bawah bimbingan DEDY DURYADI SOLIHIN dan NURLISA A. BUTET.
Kerang bulu Anadara antiquata Linn. merupakan salah satu bivalvia intertidal anggota Famili Arcidae yang keberadaannya tersebar luas di Indonesia. Kerang ini memiliki peran ekonomis dan ekologis penting. Berdasarkan basis data genetik di GenBank belum ada data genom spesies A. antiquata asal Indonesia. Dengan demikian untuk melengkapi informasi taksonomi kerang bulu, maka penelitian ini dilaksanakan dengan tujuan untuk mengkaji karakteristik gen cytochrome oxidase subunit I (COI) pada kerang bulu (Anadara antiquata linn.) asal Banten (Panimbang dan Bojonegara). Sampel yang diekstraksi berasal dari Panimbang dan Bojonegara. DNA hasil ekstraksi dilanjutkan dengan tahap amplifikasi dan sekuening Gen COI yang menghasilkan produk sebesar 607 nukleotida (nt). Produk tersebut kemudian dianalisis menggunakan Software MEGA 4.0, disejajarkan dengan beberapa sekuen yang berasal dari basis data GenBank. Penelitian ini telah mampu mengkarakterisasi gen COI A. antiquata menggunakan pensejajaran dengan metode Clustal W dan produk yang dihasilkan 382 nt.
Kata kunci : Anadara antiquata, COI, Banten.
ABSTRACT
DINI HERLINA. Characteristics of Gene Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) on Hairy Cockle (Anadara antiquata Linn.) from Panimbang and Bojonegara Waters,Banten Province. Supervised by DEDY DURYADI SOLIHIN and NURLISA A. BUTET.
Anadara antiquata is an intertidal bivalve belongs to Arcidae Family. Its distribution in Indonesia is widespread. Its play role both in economy and ecology. Based on genetic database from GenBank, there is no genome data of A. antiquata from Indonesia. Therefore, to accomplish information on this hairy cockle, this research was aimed at characterizing cytochrome oxidase subunit I (COI) in cockle (Anadara antiquata linn.) from Banten (Panimbang and Bojonegara). Hairy cockle samples were collected from Panimbang and Bojonegara. Those were extracted for DNA analysis. DNA extraction and amplification process were followed with DNA sequencing of COI gene that produced 607 nucleotides (nt). The product was analyzed using software MEGA 4.0 and aligned with some sequences from GenBank database. This study was able to characterize A. antiquata COI gene which product was 382 nt using alignment method of Clustal W.
KARAKTERISTIK GEN CYTOCHROME OXIDASE SUBUNIT I (COI)
PADA KERANG BULU (Anadara antiquata Linn. ) ASAL PERAIRAN
PANIMBANG DAN BOJONEGARA, PROVINSI BANTEN
DINI HERLINA
Skripsi
sebagai salah satu syarat memperoleh
gelar Sarjana Sains
pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul skripsi : Karakteristik Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) pada
Kerang Bulu (Anadara antiquata Linn.) asal Perairan Panimbang
dan Bojonegara, Provinsi Banten
Nama
: Dini Herlina
NIM
: G34070033
Departemen : Biologi
Disetujui:
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA
Dr. Ir. Nurlisa A. Butet, M.Sc
NIP. 19561102 198403 1 003
NIP. 19651208 199011 2 001
Diketahui,
Ketua Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.
NIP. 19641002 198903 1 002
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah yang berjudul Karakteristik Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) pada Kerang Bulu (Anadara antiquata Linn.) asal Perairan Panimbang dan Bojonegara, Provinsi Banten ini dapat diselesaikan. Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Januari 2011 hingga bulan Desember 2012 bertempat di Laboratorium Biologi Molekuler, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) dan Laboratorium terpadu Departemen Biologi, FMIPA Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA dan Ibu Dr. Ir. Nurlisa A. Butet, M.Sc atas segala bimbingan, arahan, saran serta ilmu yang senantiasa diberikan sepanjang penelitian hingga penulisan karya ilmiah ini selesai. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Bapak Heri dan Ibu Retno yang telah membantu dalam proses penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada umi, bapak dan seluruh keluarga atas segala doa, dukungan dan kasih sayang yang telah diberikan, serta kepada teman-teman seperjuangan di laboratorium (Ratna, Dewi, Gita, Kak Nining dan Fery) dan keluarga besar Biologi 44 atas semangat dan pertemanan yang telah diberikan.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Maret 2013
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Cianjur pada tanggal 22 Mei 1988 dari ayah Udin Saripudin dan ibu Etih Nurhayati. Penulis merupakan putri kedua dari tiga bersaudara.
Tahun 2007 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Cilaku dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih mayor biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
2
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR vii
DAFTAR LAMPIRAN vii
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Tujuan 2
BAHAN DAN METODE 2
Waktu dan Tempat 2
Bahan 2
Metode 2
Ekstraksi DNA 2
Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA 2
Perunutan Produk PCR (Sekuening) DNA A. antiquata Gen COI 3
Analisis Filogeni 3
HASIL DAN PEMBAHASAN 3
Hasil 3
Ekstraksi DNA Total 3
Amplifikasi Daerah COI 4
Sekuening dan Alignment Produk PCR pada Daerah COI 4
Analisis Filogeni 4
Pembahasan 5
SIMPULAN 6
SARAN 6
3
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Gambar kerang bulu (Anadara antiquata) 2
2 Hasil isolasi DNA total otot A. atlas pada gel agarosa 1.2% 3
3 Hasil amplifikasi daerah COI pada gel agarosa 1.2% 4
4 Elektroforesis DNA hasil pre-test produk PCR pada gel agarosa 1% 4
5 Konstruksi pohon filogeni dengan bootstrap neighboor-Joining (NJ) 1000 kali pengulangan berdasarkan p-distance basa-basa nukleotida COI sepanjang 382 nt A. antiquata ingroup dan outgroup 5
6 Gambar 6 Pensejajaran A. antiquata dengan spesies lain yang berasal dari ingroup dan outgroup. 6
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1 Pensejajaran berganda nukleotida (607 nt) pada gen COI A. antiquata sampel Bj 6, Bj 11 dan P 2289
2 Pensejajaran berganda nukleotida (382 nt) pada gen COI A. antiquata dengan sekuen lain yang berasal dari GenBank 12
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Bivalvia khususnya Arcidae merupakan salah satu famili yang keberadaannya paling melimpah di perairan tropis dan memiliki nilai ekonomis yang sangat tinggi untuk daerah Indo-Pasifik (Broom 1985). Bivalvia banyak dimanfaatkan oleh masyarakat sebagai sumber bahan pangan alternatif.
Kerang bulu (Anadara antiquata Linn.) merupakan salah satu anggota spesies dari Famili Arcidae, Subfamili Anadarinae yang tersebar luas di Indonesia. Anadara antiquata termasuk ke dalam Subkelas Lamellibranchiata yang memiliki filamen insang memanjang dan melipat seperti hurup W. Filamen satu dengan filamen lainnya dihubungkan oleh cilia (filibranchia). Kerang ini memiliki ciri bentuk kedua aduktor berukuran kurang lebih sama (Nurjanah et al. 1999). Cangkang kerang bulu lebih tipis dari kerang darah dan memiliki ciri khas ditumbuhi oleh bulu – bulu halus. Menurut Dixon et al. (1995) bulu tersebut berasal dari periostrakum yang merupakan lapisan terluar cangkang, terbuat dari zat tanduk dan material organik (choncialin). Bulu ini berfungsi sebagai alat perlindungan diri dari predator karena struktur cangkangnya yang relatif lebih tipis dibanding kerang darah. Selain itu bulu juga berperan sebagai alat penempelan pada substrat.
Distribusi kerang tersebut meliputi New Caledonia, Australia, Tropical Indo-West Pacific, Red Sea, Jepang, China, Laut Cina Selatan, Hong Kong (Xianggang), Vietnam, Thailand, Philippines, dan Indonesia. Penyebarannya di Indonesia tersebar di kawasan pesisir pantai. Anadara antiquata terdapat di area sublitoral, mendiami celah bebatuan (Broom 1985), sedimen berpasir kerikil (Afiati 2007) atau daerah estuari bersubstrat lumpur yang berbatasan dengan hutan mangrove (Pattikawa 2007). Kerang bulu merupakan filter feeder. Makanan utamanya adalah plankton, terutama fitoplankton. Menurut Suwignyo et al. (1998) makanan masuk melalui siphon inhalant, dijebak pada insang karena terdapat mukus. Zat makanan selanjutnya dialirkan ke mulut melalui silia dan disortir oleh pulp yang berada di sekitar mulut. Partikel seperti kerikil dikeluarkan oleh siphon exhalant, makanan di transformasikan ke mulut kemudian di proyeksikan ke perut oleh bagian ventral
perut dan terjadi gerakan rotasi. Makanan hancur secara mekanis dan material yang tidak dicerna akan di buang melalui anus sebagai feses.
Sebagai hewan filter feeder dan sedenter, kerang bulu berpotensi kecil untuk menghindar dari perubahan lingkungan perairan yang membahayakan (Nurjanah et al. 1999). Kerang bulu dengan demikian dapat digunakan sebagai bioindikator. Keberhasilan A. antiquata sebagai bioindikator telah dilakukan oleh Iswani et al. (1995).
Pengkajian keragaman genetik melalui penandaan molekuler menggunakan Deoxyribonucleic Acid (DNA) pada inti dan DNA mitokondria (mtDNA) dapat mengungkapkan perbedaan intra dan interspesies dengan lebih teliti. Hal tersebut menyangkut tentang struktur, komposisi dan organisasi genom pada tingkat DNA (Solihin 1994). DNA mitokondria memiliki susunan yang berbeda dengan DNA inti, ukurannya lebih kecil. Penggunaan mtDNA sebagai penanda genetik telah memberikan informasi secara kualitatif maupun kuantitatif. Selain itu mtDNA memiliki kemampuan berevolusi sangat cepat sehingga dapat digunakan untuk melacak kejadian yang relatif baru (Solihin 1994).
Gen penyandi dalam genom mtDNA di antaranya adalah Gen cytochrome oxidase subunit I (COI). Gen COI memiliki banyak kelebihan untuk mempelajari karakteristik genetik, yaitu gen COI sedikit sekali mengalami delesi dan insersi pada sekuennya, serta banyak bagian yang bersifat conserve (lestari) sehingga dapat digunakan sebagai DNA barcoding, yaitu penciri setiap spesies (Hebert et al. 2003). Gen COI dapat digunakan untuk merekonstruksi filogenetik pada cabang evolusi tingkat spesies (Palumbi 1996). Selain itu susunan asam amino dari protein yang disandi gen COI jarang mengalami substitusi sehingga gen COI bersifat stabil dan dapat digunakan sebagai penanda analisis filogeni, namun basa-basa pada triple kodonnya masih berubah dan bersifat silent yaitu perubahan basa yang tidak merubah jenis asam amino (Lynch & Jarrell 1993).
2
karakteristik gen cytochrome oxidase subunit I (COI) pada kerang bulu A. antiquata asal Banten (Panimbang dan Bojonegara). Kedua daerah tersebut sudah mulai berubah karena lingkungannya mulai tercemar limbah industri maupun limbah rumah tangga. Menurut Muawanah et al. (2005) kondisi perairan di Teluk Lada khususnya Panimbang telah mengalami pencemaran logam berat seperti Hg (0.001-0.021 mg/l), Pb (0.005-0.023 mg/l) dan Cu (0.005-0.065 mg/l). Sedangkan di Teluk Banten perairannya mengandung Hg sebesar 0.153 mg/l, Pb 0.153 mg/l dan Cd 0.064 mg/l (Setyobudiandi 2004). Tingkat pe-rubahan lingkungan dapat berpengaruh terhadap karakteristik genetik suatu organisame menarik untuk dipelajari. Hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai informasi dasar mengenai ke-ragaman genetik dengan penanda COI sebagai pembeda antar spesies A. antiquata.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji karakteristik gen COI pada kerang bulu asal Perairan Panimbang dan Bojonegara, Provinsi Banten.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Januari 2011 hingga bulan Desember 2012 di Laboratorium Biologi Molekuler Hewan, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) dan Laboratorium Terpadu Departemen Biologi, FMIPA Institut Pertanian Bogor.
Bahan
Sampel yang digunakan adalah sampel otot A. antiquata asal Panimbang (P) dan Bojonegara (Bj). Berikut gambar kerang bulu yang digunakan pada penelitian ini.
Gambar 1. Kerang Bulu (Anadara antiquata)
Metode Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA genomik A. antiquata asal Panimbang (P) sebanyak 30 dan sampel
Bojonegara (Bj) sebanyak 14 sampel menggunakan metode menurut Solihin (1997) yang telah dimodifikasi. Sampel otot dicacah halus dan dimasukan ke dalam microtube (1.5 ml), diberi larutan Low TE (Tris HCL : EDTA = 1:10) sampai terendam. Sampel diinkubasi pada suhu 37
⁰C selama kurang lebih satu bulan. Sampel disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit, kemudian larutan Low TE dibuang. Sampel digerus dengan diberi penambahan 800 µl 1x cethyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) Buffer dan 10 µl Proteinase K 20 mg/ ml kemudian diinkubasi pada suhu 55 ⁰C selama semalam.
Suspensi yang telah diinkubasi pada suhu 55⁰C ditambah fenol 400 µl, larutan CIAA (chloroform : Isoamyl alcohol = 24:1) 400 µl dan larutan NaCl 5 M 40 µl, diputar membentuk angka delapan selama 20 menit pada suhu ruang kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit. Supernatan dipindahkan ke microtube baru, dan ditambahkan larutan CIAA 400 µl, diputar membentuk angka delapan selama 20 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit. Supernatan (lapisan atas) dipindahkan ke microtube baru, ditambahkan etanol absolut sebanyak 2x volume, simpan di freezer selama semalam.
Selanjutnya sampel disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit dan dibuang supernatannya. Sampel diberi penambahan etanol 70 % sebanyak 2x volume, sentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit dan dibuang supernatannya. DNA (endapan putih) dikeringudarakan pada suhu ruang selama 15 sampai 30 menit. Endapan diberi larutan TE-RNAse 40 mg/ ml sebesar 35-50 µl, diinkubasi pada suhu 37⁰C selama 15 menit. DNA disimpan di freezer.
Kualitas DNA dilihat dengan dimigrasikan pada gel agarosa 1,2% menggunakan buffer 1xTAE. Pewarnaan gel agarosa dengan ethidium bromide (0.5 g/ ml) diamati dan difoto menggunakan GELDOC pada sinar Ultra violet 400 nm.
Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA
3
COI dilakukan dengan menggunakan pasangan primer koleksi Dr. Dedy D. Solihin, DEA dan Dr. Ir. Nurlisa A. Butet, M.Sc dengan primer forward AGF (5’ -AGCCGGCAGGTCTTTATGTAGAAGTT AG-3’) dan primer reverse AGR (5’ -TAAACCTCCGGGTGTCCAAAAAACCA
-
3’).
Komposisi pereaksi PCR terdiri atas 5 µl buffer A (KAPA), 5 µl enhancer, 6.8 µl ddH2O, 3 µl sampel DNA yang tidak diukurkonsentrasinya, 2 µl MgCl2 50mM, 1 µl
dNTP, 1 µl primer forward 20 ρmol, 1 µl primer reverse 20 ρmol dan 0.2 µl taq Robust Hot Start. Total volume reaksi adalah 25 µl.
Reaksi PCR dilakukan menggunakan mesin AB Verity, dengan kondisi yaitu, diawali predenaturasi 94 ⁰C selama 5 menit. Siklus PCR dilakukan sebanyak 35 kali, terdiri atas denaturasi 94 ⁰C selama 45 detik, penempelan primer (annealing) 59 ⁰C selama satu menit 30 detik, perpanjangan (elongasi) 72 ⁰C selama 1 menit diakhiri dengan post-elongasi 72⁰C selama 7 menit. Produk PCR yang diharapkan adalah sebesar 600 nt.
Kualitas produk PCR dilihat dengan dimigrasikan pada gel agarosa 1.2% dengan menggunakan buffer 1xTAE. Pewarnaan gel agarosa menggunakan ethidium bromida (0.5 g/ml), diamati dan difoto menggunakan GELDOC pada sinar ultraviolet (400 nm).
Perunutan Produk PCR (Sekuening)
DNA A. antiquata Gen COI
Sekuening merupakan metode yang digunakan untuk mengetahui variasi genetik gen COI. Pembacaan sekuen DNA dilakukan untuk mengetahui komposisi nukleotida dan asam amino suatu gen, juga menganalisis kekerabatan dan jalur evolusinya (Albert et al. 1994)
Produk PCR gen COI penelitian ini berupa pita tunggal yang berukuran 600 nt. Produk PCR disekuening di PT Genetika Science secara lengkap dengan primer forward dan reverse.
Analisis Filogeni
Runutan nukleotida gen COI A. antiquata dengan primer forward dan reverse diedit dan dianalisis untuk mendapatkan sekuen DNA dari gen COI. Runutan nukleotida yang telah diedit disejajarkan dengan urutan baku nukleotida dari GenBank pada satu famili Arcidae (ingroup) dengan kode akses AB050895.1
(A. antiquata Jepang), HQ258847.1 (A. crebricostata Cina), HQ258848.1 (A. vellicata Cina), AB050896.1 (Diluvarca ferruginea Jepang), HQ258861.1 (Scapharca globosa Cina) dan yang diluar famili Arcidae (outgroup), yaitu AB050892.1 (Cucullaea labiata Jepang) famili Cucullaedae dan AF253493.1 (Arcopsis solida Panama) famili Noetiidae. Pensejajaran runutan nukleotida dilakukan dengan menggunakan program Clustal W yang terdapat pada software MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007).
Analisis filogeni berupa perhitungan komposisi basa nukleotida, jarak genetik dan konstruksi filogeni menggunakan program MEGA 4 (Tamura et al. 2007). Jarak genetik diperoleh dengan membagi jumlah nukleotida yang berbeda dengan jumlah total nukleotida, dan pohon filogeni direkonstruksi berdasarkan metode bootstrapped Neighbour-Joinning (NJ) dengan 1000 kali pengulangan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Ekstraksi DNA Total
Dari Sampel DNA kerang bulu asal Panimbang yang berjumlah 30, menghasilkan pita DNA dengan integritas yang baik hanya 11 sampel. Sedangkan sampel DNA kerang bulu asal Bojonegara sebanyak 14 sampel, menghasilkan pita yang berintegritas baik hanya sembilan sampel. Contoh hasil ekstraksi DNA total yang berhasil, dimigrasikan pada gel agarosa 1.2% dan dilihat dengan sinar UV trans-ulliminator (Gambar 2). DNA total inilah yang selanjutnya digunakan sebagai cetakan DNA untuk mengampifikasi gen COI pada proses PCR.
1 2 3 4 5
4
Amplifikasi Daerah COI
Sampel DNA yang berhasil diamplifikasi berjumlah lima sampel (Gambar 3). Amplifikasi daerah COI mtDNA pada kelima sample A. antiquata menghasilkan pita tunggal berukuran sekitar 600 nt. Tampak bahwa pita sampel P 22 paling tebal diantara yang lainnya. Hal ini dipengaruhi oleh kualitas dari DNA total yang menjadi cetakan pada saat amplifikasi. Berdasarkan kualitas hasil PCR tersebut hanya tiga sampel yang dilanjutkan ketahap sekuening, yaitu P 22, Bj 6 dan Bj 11.
1 2 3 4 5 6
[image:12.595.326.479.211.378.2]
600nt 500nt
Gambar 3. Hasil amplifikasi gen daerah COI kerang bulu pada gel agarosa 1.2%. Keterangan: kolom1= marker 100nt, 2= P 22, 3= Bj 4, 4= Bj 5, 5= Bj 6 dan kolom 6= Bj 11
Sekuening dan Alignment Produk PCR pada Daerah COI
Sebelum dilakukan sekuening, PT Genetika Science selaku penyedia jasa sekuen melakukan pre-test untuk mengetahui kualitas dari produk PCR (Gambar 4). Perunutan DNA dilakukan dari dua arah, forward dan reverse. Hasil sekuen dari ketiga sampel menunjukan hasil yang baik, meskipun hasil pre-test yang dilakukan oleh PT. Genetika Science (Gambar 4) pada sampel berkode Bj 6 dan Bj 11 sangat tipis. Ketebalan ketiga pita sampel hasil PCR tersebut berbeda.
Setelah dilakukan pensejajaran, diperoleh panjang DNA hasil sekuening sebesar 607 nt (Lampiran 1). Hasil pensejajaran tersebut menunjukkan bahwa gen COI A. antiquata sangat conserve pada level spesies. Komposisi nukleotida hasil pensejajarannya terdiri atas 21.4 % basa A, 40.2 % basa T, 15.3 % basa C dan 23.1 % basa G. Basa yang mendominasi gen COI pada A. antiquata ini adalah basa T.
1 2 3 4 5
1kb 1kb
Gambar 4. Visualisasi hasil pre-test kualitas produk PCR pada gel agarosa 1%. Keterangan: kolom 1=marker, 2= Bj 6, 3= Bj 11, 4= P 22 dan kolom 5= marker
Selanjutnya ketiga sekuen gen COI A. antiquata disejajarkan dengan sekuen gen COI bivalvia lain yang diperoleh dari GenBank. Panjang basa nukleotida dari seluruh sekuen setelah disejajarkan sebesar 382 nt (Lampiran 2). Pensejajaran sekuen menghasilkan nilai conserve sebesar 53.93% (206/382) dan nilai variabel sebesar 46.07% (176/382). Berdasarkan pensejajaran inter spesies A. antiquata asal Banten dengan A. antiquata asal Jepang terdapat perbedaan basa nukleotida sebesar 83 situs nukleotida. Sedangkan jika A. antiquata asal Banten dibandingkan dengan spesies lain, terdapat 11 situs nukleotida COI A. antiquata yang berbeda dan bersifat diagnostik sehingga dapat digunakan sebagai penciri bagi spesies tersebut (Lampiran 2).
Analisis Filogeni
Hubungan kekerabatan Famili Arcidae (A. antiquata, A. crebricostata, A. vellicata, Diluvarca ferruginea dan Scapharca globosa) serta famili lainnya (Cucullaea labiata dan Arcopsis solida) dapat dibandingkan berdasarkan jarak genetik (p-1000 nt
750 nt 500 nt
[image:12.595.115.274.239.551.2]5
distance) dari basa-basa nukleotidanya (Lampiran 3). Jarak genetiknya berkisar antara 0-0,301. Berdasarkan jarak genetik p-distance dari basa-basa nukleotida COI tersebut terbentuk konstruksi pohon filogeni A. antiquata seperti pada Gambar 5.
ketahap sekuening. Hanya sampel yang memiliki kualitas baik yang dipilih dengan ditandai oleh pita yang tebal. Keberhasilan amplifikasi ini bisa dipengaruhi oleh beberapa hal di antaranya komposisi bahan pereaksi, kondisi reaksi PCR yang tepat,
hdg hdd
Gambar 5. Konstruksi pohon filogeni dengan bootstrap neighboor-Joining (NJ) 1000 kali pengulangan berdasarkan p-distance basa-basa nukleotida COI sepanjang 382 nt A. antiquata ingroup dan outgroup
Berdasarkan pohon filogeni (Gambar 5) terdapat dua nodus utama, yaitu nodus A yang berasal dari famili Arcidae dan nodus B yang berasal dari dua famili lainnya yaitu Famili Noetiidae dan Famili Cucullaeidae. Nilai jarak genetik A. antiquata asal Jepang dengan A. antiquata asal Panimbang sebesar 0.223 (22.3%), sedangkan dengan A. antiquata asal Bojonegara sebesar 0.225 (22.5%). Jarak genetik terbesar pada matriks yaitu antara A. antiquata dan Cucullaea labiata sebesar 0.301 (30.1%) yang berasal dari famili berbeda (Lampiran 3).
Semakin besar nilai jarak genetik menunjukkan bahwa semakin besar perbedaan basa nukleotidanya, begitupun sebaliknya. Analisis filogeni menunjukan kekerabatan yang dekat antara sampel A. antiquata asal Panimbang dan A. antiquata Bojonegara karena hanya ada satu komposisi nukleotida yang berbeda. Ketiga sampel tersebut berada pada nodus yang sama dengan nilai bootstrap 100%.
Pembahasan
Tidak semua hasil amplifikasi diteruskan
terutama pada proses penempelan primer (annealing) (Handoyo et al. 2000) dan kualitas DNA sebagai templat yang kurang baik, termasuk konsentrasi atau kadar kemurnian DNAnya (Palumbi 1996). Hal tersebut tampak pada sampel BJ 6 dan BJ 11 yang pita hasil amplifikasinya tipis, sedangkan P 22 pitanya sangat tebal. Hal ini bisa disebabkan oleh tingkat kemurnian DNA yang rendah pada sampel BJ 6 dan BJ 11 sehingga seharusnya volume DNA ditingkatkan pada saat PCR. Suhu optimum annaeling pada saat PCR sebesar 59⁰ C.
Panjang basa nukleotida gen COI A. antiquata yang dihasilkan sebesar 607 nt. Hasil amplifikasi pitanya tipis, namun hal tersebut tidak terlalu mempengaruhi kualitas pembacaan basa-basa nukleotida. Semua nukleotida terbaca tanpa adanya nukleotida yang disandikan hurup N. Sampel P 22 berbeda satu basa terhadap sampel Bj yaitu pada situs ke 292 (Lampiran 1). Perbedaan satu situs pada P 22 yang berasal dari Panimbang terhadap Bj 6 dan Bj 11 yang berasal dari Bojonegara bisa disebabkan karena perbedaan lokasi yang memicu terjadi mutasi. Namun perbedaan tersebut tidak berbeda nyata karena yang berbeda
6
hanya satu basa saja. Bojonegara merupakan daerah perairan yang terletak di Utara Jawa tepatnya Teluk Banten. Sebaliknya Panimbang terletak di Teluk Lada, daerah perairan yang menghadap ke Selat Sunda.
Berdasarkan analisis filogeni, dapat diketahui bahwa intra spesies A. antiquata asal panimbang dan Bojonegara bersifat conserve. Ketiga sampel berada pada nodus dan cabang yang sama dengan nilai bootstrap sebesar 100 %. Penggunaan Primer forward AGF (5’ -AGCCGGCAGGTCTTTATGTAGAAGTT AG-3’) dan primer reverse AGR (5’ -TAAACCTCCGGGTGTCCAAAAAACCA
-
3’
) juga dilakukan pada penelitian Rahayu (2013) terhadap A. granosa, menghasilkan panjang basa sebesar 606 nt. Sekuen nukleotida tersebut hanya berbeda satu nukleotida terhadap penelitian ini. Oleh karena itu panjang basa 607 nt pada A. antiquata ini belum bisa dijadikan sebagai penciri spesies (barcoding). Hal ini bisa disebabkan karena primer yang digunakan kurang spesifik terhadap spesies A. antiquata. Panjang basa nukleotida A. antiquata 607 nt setelah disejajarkan dengan spesies lain yang berasal dari satu ingroup dan outgroup menjadi 382 nt. Hal ini dikarenakan perbedaan panjang basa nukleotida yang berbeda dari semua spesies yang dibandingkan tersebut, sehingga diambil panjang basa nukleotida terpendek setelah disejajarkan.Gambar 6. Pensejajaran A. antiquata dengan spesies lain yang berasal dari ingroup dan outgroup
Anadara antiquata Banten (Panimbang dan Bojonegara) dan A. antiquata Jepang memiliki 83 nt basa yang berbeda dengan nilai matriks sebesar 0.223 (22.3%) dan 0.225 (22.5%). Hal ini bisa disebabkan oleh perbedaan geografis yang dapat memicu perubahan susunan nukleotida. Sebaliknya A. antiquata dengan spesies lainnya didapatkan 11 situs nukleotida yang berbeda dan bersifat diagnostik sehingga dapat digunakan sebagai penciri bagi spesies tersebut.
Pohon filogeni terbagi ke dalam dua nodus utama, yaitu nodus A dan B. Nodus A merupakan cabang yang ditempati oleh spesies yang masih berasal dari satu famili yang sama (ingroup) dengan A. antiquata, yaitu Arcidae. Hubungan kekerabatan terdekat diluar genus yang sama yaitu D. Ferruginea, hal ini sesuai dengan Masahiro (2002) dan Feng et al. (2011), kemudian S. globosa dengan nilai bootstrap sebesar 59 %.
Nodus yang kedua (B) berasal dari luar famili sebagai outgroup. Outgroup digunakan sebagai faktor pengkoreksi dalam menentukan karakter diantara ingroup yang ada (Maddison et al. 1984). Famili Arcidae memiliki kekerabatan yang lebih dekat dengan A. solida yang beasal dari Famili Noetiidae dibandingkan C. labiata yang berasal dari Famili Cucullaedidae. Hal ini sesuai dengan penelitian Oliver et al. (2006) bahwa Famili Arcidae dan Noetiidae memiliki lebih banyak kesamaan dibanding Famili Cucullaeidae, serta menurut Masahiro (2002) dan Feng et al. (2011) berdasarkan karakteristik gen COI.
SIMPULAN
Penelitian ini telah mampu mengkarakterisasi gen COI A. antiquata sepanjang 607 nt. Panjang nukleotida tersebut belum dapat digunakan sebagai penciri spesies (barcoding) terhadap A. antiquata. COI tidak mampu membedakan individu pada intra spesies. Gen COI dapat membedakan inter populasi Banten dan Jepang.
SARAN
Penambahan jumlah sampel yang disekuening dan lokasi sampling yang lebih beragam perlu dilakukan untuk lebih menguji sifat conserve COI pada intra dan inter populasi di Indonesia. Selain itu perlu adanya pangkajian keragaman genetik intra spesies menggunakan cytochrome oxidase b sebagai marka genetiknya.
DAFTAR PUSTAKA
Afiati N. 2007. Gonad maturation of two intertidal blood clams Anadara granosa (L.) and Anadara antiquata (L.) (bivalvia: arcidae) in Central Java. Journal of Coastal Development 10: 105-113.
Albert J, Wahlberg J, Leitner T, Escamilla D, Uhlen M. 1994. Analysis of a rape
607 nt
382 nt
7
case by direct sequencing of the human immunodeficiency virus type 1 pol and gag genes. J. Virol 68: 5018-24.
Broom MJ. 1985. The Biology and Culture of Marine Bivalve Molluscs of The Genus Anadara. Manila: ICLARM Studies.
Dixon DR, Solecava AM, Pascoe PL dan Holland PWH. 1995. Periostracal adventitious hairs on spat of the mussel Mytilus edulis. J. Mar. Biol. Ass 75:363-372.
Feng Y, Li Q, Kong L, Zheng X. 2011. COI-based DNA barcoding of Arcoida species (Bivalvia: Pteriomorphia) along the coast of China. Moleculer Ecology Resources 11:435-441.
Handoyo D, Rudiretna A. 2000. Prinsip umum dan pelaksanaan polymerase chain reaction (PCR). Unitas 9:17-29. Hebert PDN, Cywinska A, Ball SL, de
Waard JR. 2003. Biological identifications through DNA barcodes. Proc R Soc 270: 313–321.
Iswani GS, Hidayat F, Zulkarnaen A. 1995. Stripping voltametry glassy carbon pada studi cemaran logam berat Cd & Pb di Perairan Gresik dengan bioindikator kerang bulu (A. antiquata Linn.). Di dalam: Prosiding Pertemuan dan Presentasi Ilmiah PPNY-BATAN; Yogyakarta, 25-27 April 1995. Hlm 245-252.
Lynch M, Jarrel PE. 1993. A method for calibrating molecular clocks and its application to animal mitochondrial DNA. Genetics 135: 1197-1208.
Maddison WP, Donoghue MJ, Maddison DR. 1984. Outgroup analysis and parsimony. Syst Zool 33: 83-103.
Masahiro M. 2002. Phylogenetics analysis of the subclass Pteriomorphia (Bivalvia) from mtDNA COI sequences. Moleculer Phylogenetics and Evolution 27: 429-440.
Muawanah NS, Hendrianto, Triana A. 2005. Pemantauan lingkungan perairan pada
kegiatan pengembangan budidaya dan sanitasi kerang hijau (Perna viridis) di Kabupaten pandeglang, Provinsi Banten. Buletin Teknik Litkayasa Akuakultur 4:13-16.
Nurjanah, Hartanti, Nitibaskara RR. 1999. Analisis kandungan logam berat Hg, Cd, Pb, As dan Cu dalam tubuh kerang konsumsi. Buletin THP VI(1): 5-8. Palumbi SR. 1996. Nucleic acids II: the
polymerase chain reaction. Dalam Molecular systematic. Ed ke-2. Edited by Hillis DM, Moritz C, Mable BK. Massachusetts: Sinauer.
Pattikawa JA. 2007. Pertumbuhan kerang bulu (Anadara antiquata) di perairan Pantai Passo, Teluk Ambon, Maluku. Ilmu Kelautan 12: 181-186.
Oliver PG, Holmes AM. 2006. The Arcoidae (Mollusc:Bivalvia): a review of the current phenetic-based systematics. Zoological Journal of the Linnean Society 148:237-251.
Rahayu GK. 2013. Studi keragaman genetik kerang darah (Anadara granosa) berdasarkan cytochrome oxidase sub unit I (COI) [skripsi]. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Setyobudiandi I. 2004. Beberapa aspek biologi reproduksi kerang hijau Perna viridis Linnaeus, 1758 pada kondisi perairan berbeda [disertasi]. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Solihin DD. 1994. Peran DNA mitokondria (mtDNA) dalam studi keragaman genetik dan biopopulasi pada hewan. Hayati 1: 1-4.
Solihin DD. 1997. Isolasi dan Purifikasi Mitochondrian (mtDNA). Laboratorium Biologi Molekuler Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB. Bogor.
Suwignyo S, Widigdo B, Wardiatno Y dan Krisanti M. 1998. Avertebrata Air Jilid 1. Jakarta : Penebar Swadaya.
9
Lampiran 1. Pensejajaran berganda nukleotida (607 nt) pada gen COI A. antiquata sampel Bj 6, Bj 11 dan P 22
#MEGA
!Title Alignment Bj6vsBj11vsP22; !Format
DataType=Nucleotide NSeqs=3 NSites=607
Identical=. Missing=? Indel=-; !Domain=Data;
[ 1 1111111112 2222222223 3333333334 4444444445 5555555556 6666666667 ] [ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 ] #BJ6 AGCCGGCAGG TCTTTATGTA GAAGTTAGTC AGTTGTATAA TGTGATTATT ACGAGGCATG CATTTATTAT #BJ11 ... ... ... ... ... ... ... #P22 ... ... ... ... ... ... ...
[ 1 1111111111 1111111111 1111111111 1111111111 ] [ 7777777778 8888888889 9999999990 0000000001 1111111112 2222222223 3333333334 ] [ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 ] #BJ6 GATTTTTTTT TTCGTTATAC CAGTAATAAT GGGGGGGTTT GGTAATTGAC TGATTCCAAT TATAGTTGGG #BJ11 ... ... ... ... ... ... ... #P22 ... ... ... ... ... ... ...
[ 1111111111 1111111111 1111111111 1111111111 1111111111 1111111112 2222222222 ] [ 4444444445 5555555556 6666666667 7777777778 8888888889 9999999990 0000000001 ] [ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 ] #BJ6 TGTGGGGATA TAAGACACCC ACGTTTAAAT AATTTTAGCT ACTGAGCCAT TCCTGGTGCT TTATTCATAG #BJ11 ... ... ... ... ... ... ... #P22 ... ... ... ... ... ... ...
10
Lanjutan
[ 2222222222 2222222223 3333333333 3333333333 3333333333 3333333333 3333333333 ] [ 8888888889 9999999990 0000000001 1111111112 2222222223 3333333334 4444444445 ] [ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 ] #BJ6 GATCTATCAT AAAAGTCCGG CGCTGGATAT GGTTATTCTT TCGTTGCATA TTGCTGGGTT TGGTTCAATG #BJ11 ... ... ... ... ... ... ... #P22 ... .G... ... ... ... ... ...
[ 3333333333 3333333333 3333333333 3333333333 3333333334 4444444444 4444444444 ] [ 5555555556 6666666667 7777777778 8888888889 9999999990 0000000001 1111111112 ] [ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 ] #BJ6 ATAAGGTCTT TAAATTTTAT GTGTACTATA ATTACAAGTC GTTTTTATGC TATAATTCCA GAGCGGATAC #BJ11 ... ... ... ... ... ... ... #P22 ... ... ... ... ... ... ...
[ 4444444444 4444444444 4444444444 4444444444 4444444444 4444444444 4444444444 ] [ 2222222223 3333333334 4444444445 5555555556 6666666667 7777777778 8888888889 ] [ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 ] #BJ6 CTGTGTTTTG TTGGTCGATG TTTGTTACAT CTTGGTTATT ATTATTTTCT TTACCTGTCT TGGCTGGCGG #BJ11 ... ... ... ... ... ... ... #P22 ... ... ... ... ... ... ...
11
Lanjutan
12
Lampiran 2. Pensejajaran berganda nukleotida (382 nt) pada gen COI A. antiquata dengan sekuen lain yang berasal dari GenBank
#MEGA
!Title Alignment A. antiquata vs ingroup-outgroup Arcidae; !Format
DataType=Nucleotide NSeqs=10 NSites=382
Identical=. Missing=? Indel=-; !Domain=Data;
[ 1 1111111112 2222222223 3333333334 4444444445 5555555556 6666666667 ] [ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 ] #BJ6 CACGTTTAAA TAATTTTAGC TACTGAGCCA TTCCTGGTGC TTTATTCATA GTTTTCATGT CAGCGTTGAT #BJ11 ... ... ... ... ... ... ... #P22 ... ... ... ... ... ... ... #A._Antiquata_Japan .T...G.. ...G ..T...ATTT .G..A..A.. ...T... ..AA.T..A. .T..T..A.. #A._crebricostata_China .T..G... ...G ..T....TAC .A... ...T... ..CA.TG... .T..TC.T.. #A._vellicata_China .T..G... ...G ..T....TAC .A... ...T... ..CA.TG... .T..TC.T.. #Scapharca_globosa_China .T..G... ...A ..T....TGT .A..G... GC.T..T... ...G.T.... .T... #Diluvarca_ferruginea_Japan .T..G... ...C...A ..T..G.TTT .A..A... ...G..T... ..CA.T.... .T..TC.T.. #Arcopsis_solida_Panama .T..GG.T.. ....A.G..T ..T..GTTAT .G...C. ....G.G..G C..A.T.GT. ....AGGA.. #Cucullaea_labiata_Japan .T..G..G.. ....A.G..G .TT..GTTGT .G...GC. GC.G..T..G T.A..GG.T. .T.G...A..
13
Lanjutan
[ 1 1111111111 1111111111 1111111111 1111111111 ] [ 7777777778 8888888889 9999999990 0000000001 1111111112 2222222223 3333333334 ] [ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 ] #Cucullaea_labiata_Japan ...A..T ..T..CT.G. .G..G..G.. A..T...A ...AA.G. AT.GG.T... CTC..CA..T
[ 1111111111 1111111111 1111111111 1111111111 1111111111 1111111112 2222222222 ] [ 4444444445 5555555556 6666666667 7777777778 8888888889 9999999990 0000000001 ] [ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 ] #BJ6 GCGCTGGATA TGGTTATTCT TTCGTTGCAT ATTGCTGGGT TTGGTTCAAT GATAAGGTCT TTAAATTTTA #BJ11 ... ... ... ... ... ... ... #P22 ... ... ... ... ... ... ... #A._Antiquata_Japan ..TT.A.... ....GG.... ...CC.T... ..C..A..A. ....G... A...T... ... #A._crebricostata_China ..TT... ...T. C..TC.T... ... ....G..T.. ...G..A... ... #A._vellicata_China ..TT... ...T. C..TC.T... ... ....G..T.. ...G..A... ... #Scapharca_globosa_China ..TT.A.... ...T. ...TC.T... ... ....A... A...T..G ..G... #Diluvarca_ferruginea_Japan ..TT.A.... .A..A...T. ...TC.T... ... ....G..T.. A...A..A ... #Arcopsis_solida_Panama ..AA.A...T .A...T. ...T..A... ... ....G..T.. ...C..A ...C.... #Cucullaea_labiata_Japan ..TA...T .A...T. ...T..A... G.G...T. ...T.. T...T... ..G..C....
14
Lanjutan
[ 2222222222 2222222223 3333333333 3333333333 3333333333 3333333333 3333333333 ] [ 8888888889 9999999990 0000000001 1111111112 2222222223 3333333334 4444444445 ] [ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 ] #BJ6 GTTTGTTACA TCTTGGTTAT TATTATTTTC TTTACCTGTC TTGGCTGGCG GTTTAACTAT ACTTCTTACT #BJ11 ... ... ... ... ... ... ... #P22 ... ... ... ... ... ... ... #A._Antiquata_Japan ...A..G ...G. .G..GC.... ...G...G ...C..A. .G... ...GT.G..G #A._crebricostata_China A...A..G ...G. .G... ...G...G ...G. .G... G...T.G... #A._vellicata_China A...A..G ...G. .G... ...G...G ...G. .G... G...T.G... #Scapharca_globosa_China ...G..G ..A..AC... .G... GC.T...G ... .G..G..G.. G...T.A... #Diluvarca_ferruginea_Japan ...G..G ..G..AC.T. ... ...G...G ..A...A. .G... ....T.A... #Arcopsis_solida_Panama .A.G..A... ...G. ...C.G.. A..G...A ..A..A..A. .G..G... G..AA....A #Cucullaea_labiata_Japan A...T ..A... ....G... ...G...G ...G..G. .C...C.. GT.AA....G
15
Lampiran 3. Matriks perbedaan rata-rata nukleotida p-distance (% nukleotida yang berbeda) berdasarkan metode pairwise distance daerah COI pada kerang bulu A. antiquata beberapa pembandingnya ingroup dan outgroup yang berasal dari GenBank
Takson [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10]
[1]
[2] 0.000
[3] 0.003 0.003
[4] 0.225 0.225 0.223
[5] 0.209 0.209 0.207 0.186
[6] 0.209 0.209 0.207 0.186 0.000
[7] 0.212 0.212 0.209 0.199 0.175 0.175
[8] 0.199 0.199 0.196 0.178 0.141 0.141 0.141
[9] 0.293 0.293 0.293 0.301 0.285 0.285 0.298 0.267
[10] 0.301 0.301 0.301 0.288 0.283 0.283 0.277 0.283 0.259
Keterangan :
